嘌呤受體P2X7激活谷氨酸受體NMDA引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡

嘌呤受體P2X7激活谷氨酸受體NMDA引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡【摘要】【目的】研究嘌呤受體P2X7和谷氨酸受體NMDA激活誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的相互作用機制?！痉椒ā竣賹π律鶯ong-Evan大鼠進行上丘注射熒光標(biāo)記物Aminostilbamidine標(biāo)記RGC，NMDA受體通道拮抗劑MK-801、APV和Memantine分別與P2X7受體激動劑BzATP共培養(yǎng)，檢測它們對體外培養(yǎng)RGC存活率的影響；②未經(jīng)Aminostilbamidine標(biāo)記的新生大鼠RGC，以10μmol/L鈣離子熒光染料Fura-2標(biāo)記后，利用Ca2+影像測定儀分別測定BzATP及三種NMDA拮抗劑對RGC胞內(nèi)Ca2+濃度的影響?！窘Y(jié)果】三種NMDA拮抗劑均分別不同程度阻斷BzATP引起的RGC凋亡。BzATP在50μmol/L濃度下，約殺死的RGC，而MK-801、APV和Memantine則均可明顯減輕BzATP對RGC的毒性作用，使RGC存活率分別提高至、和。BzATP可引起RGC胞內(nèi)Ca2+持續(xù)升高，在50μmol/L濃度下可使胞內(nèi)Ca2+升高至nmol/L。而MK-801、APV和Memantine則均可顯著降低BzATP介導(dǎo)的Ca2+升高幅度，分別為、和?！窘Y(jié)論】NMDA受體拮抗劑可阻斷嘌呤受體P2X7激活誘導(dǎo)的RGC凋亡。P2X7受體和NMDA受體通道激活可能共同介導(dǎo)著興奮性神經(jīng)毒作用且P2X7在NMDA受體的上一環(huán)節(jié)先起作用。

【關(guān)鍵詞】視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞；P2X7受體；NMDA

Abstract:【Objective】TodemonstrateifP2X7receptorandN-methyl-D-aspartate(NMDA)receptorlinktoinitiateretinalganglioncells(RGC)death.【Methods】(1)Long-EvanneonatalratswerebacklabeledwithAminostilbamidinetoidentifyRGC.RGCcellviabilitywasthenexaminedusingP2X7receptoragonistBzATPandNMDAreceptorantagonistsMK-801,APVandMemantine.(2)RGCweredissociatedfromtheretinasofunlabeledneonatalratsandwereloadedwithFura-2,anintracellularcalciumindicator.BzATPandthreeNMDAreceptorantagonistswereappliedtoRGCtoexaminetheireffectsonintracellularCa2+levelsusingCa2+imagingsystem.【Results】(1)BzATP(50μmol/L)couldkillabout(36%±2%)oftheRGC.CelldeathwaspreventedbyMK-801(10μmol/L),APV(100μmol/L)andMemantine(100μmol/L)withaincreasingthecellviabilityof(96%±4%)(P),(80%±5%,P=)and(76%±9%,P=),respectively.(2)BzATP(50μmol/L)ledtoalarge,sustainedincreasesofintracellularCa2+(1183±109)nmol/L.CalciuminfluxtriggeredbyBzATPwasattenuatedbypre-andco-incubationofMK-801(10μmol/L),APV(300μmol/L)andMemantine(30μmol/L)with(76%±7%,P=),(51%±17%,P=)and(55%±16%,P=),respectively.【Conclusions】StimulationofP2X7receptorleadsRGCtodeathmayupstreamactonNMDAreceptors.ItimplicatesthatbothP2X7andNMDAreceptorareinexcitotoxicdeathofRGC.

青光眼高眼壓最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。興奮性神經(jīng)毒谷氨酸升高、N-甲基-D-天冬氨酸受體激活是引起RGC凋亡的重要原因［1］。前期研究已證實高眼壓[2,3]可引起嘌呤信號ATP釋放，激活嘌呤受體P2X7導(dǎo)致RGC細胞內(nèi)鈣離子濃度升高[4-7]、細胞凋亡和RGC釋放出谷氨酸。為進一步探討P2X7與NMDA受體在介導(dǎo)RGC凋亡機制中的相互作用關(guān)系，本文進行了如下研究。

1材料與方法

RGC標(biāo)記及RGC體外培養(yǎng)

購買懷孕Long-Evan大鼠飼養(yǎng)，取生后第4～6天新生鼠，按本實驗室成熟的技術(shù)，從上丘注射熒光染料Aminostilbamidine，逆行標(biāo)記RGC。注射后2~8d內(nèi)將動物給予過量麻醉藥處死幼鼠，摘取眼球，分離視網(wǎng)膜，按RGC體外培養(yǎng)方法獲得RGC細胞懸液，進行24h培養(yǎng)。

RGC細胞存活率的測定

取5只來自不同母鼠的幼鼠進行P2X7與NMDA受體相互作用的實驗。將每個培養(yǎng)板內(nèi)的12個蓋玻片分為3組，每組4孔：4孔為對照組，不含任何藥物；4孔含P2X7受體激動劑BzATP；4孔先加入NMDA受體通道拮抗劑MK-801或APV或Memantine，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，進行預(yù)處理，然后加入BzATP。最佳濃度由預(yù)實驗獲得。加藥后培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后將蓋玻片取出，置于熒光顯微鏡下，計數(shù)熒光標(biāo)記的RGC。存活的RGC細胞胞體發(fā)綠色熒光，胞漿內(nèi)含發(fā)黃綠色強熒光的不規(guī)則顆粒。在40×高倍顯微鏡下計數(shù)80個視野內(nèi)存活的RGC。細胞計數(shù)由固定的實驗人員完成。計數(shù)時采用單盲法：計數(shù)前由另一實驗員將蓋玻片進行隨機編號，計數(shù)人員對所計數(shù)玻片的處理不知情。

RGC胞內(nèi)Ca2+濃度的測定

同前法培養(yǎng)RGC，但RGC事先不用熒光染料標(biāo)記。細胞內(nèi)Ca2+濃度測定：細胞培養(yǎng)24h后，加入10μmol/L鈣離子熒光標(biāo)記物Fura-2和200mg/Lpluoronic，室溫下孵育60min。將蓋玻片取出置于Ca2+測定影像儀上，進行單個RGC胞內(nèi)Ca2+濃度的測定。獲取Ca2+影像時，蓋玻片分別用340nm和380nm光源激發(fā)，選定的視野內(nèi)520nm的發(fā)射光被系統(tǒng)捕獲。Ca2+濃度由340nm和380nm激發(fā)下測定的熒光強度的比率換算而得。灌注液含105mmol/LNaCl,mmol/LKCl,mmol/LNa-Hepes,mmol/LHepesacid,mmol/LCaCl2,mmol/LMgCl2,5mmol/LGlucose,75mmol/LMannitol。校正液含5μmol/Lionomycin和5mol/LEGTA。所有實驗均在室溫下進行。被檢測的RGC取自4只來源于不同母鼠的幼鼠。

進行單獨BzATP實驗時，每次加入BzATP15s，之間用灌注液沖洗6min，在同一細胞上重復(fù)4次，獲取可重復(fù)性的波峰；進行NMDA拮抗劑阻斷BzATP作用實驗時，分別用三種不同拮抗劑MK-801、APV和Memantine，最佳濃度亦由預(yù)實驗獲得。加入BzATP15s后，用灌注液沖洗3min，接著分別加入三種不同拮抗劑3min。后再給予BzATP15s。在同一細胞上實驗重復(fù)2次，獲取可重復(fù)性的波峰。

數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表達為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。應(yīng)用獨立樣本t檢驗檢測組間差異。對于細胞活性實驗研究，實驗次數(shù)表示每次數(shù)80個視野的載玻片個數(shù)。因每次實驗獲取RGC濃度不同，每次RGC計數(shù)結(jié)果先經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化再列入統(tǒng)計學(xué)分析：每個載玻片中RGC的百分比=×100%。對Ca2+影像測定,n為測定的細胞個數(shù)。設(shè)定P為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2結(jié)果

NMDA受體拮抗劑阻斷P2X7受體激動劑BzATP介導(dǎo)的RGC胞內(nèi)Ca2+升高作用

P2X7受體激動劑BzATP可引起RGC胞內(nèi)Ca2+顯著升高[4,6]。本研究應(yīng)用50μmol/LBzATP作用15s，RGC胞內(nèi)Ca2+最大可升高至nmol/L。移除BzATP后，用灌注液沖洗6min，待胞內(nèi)Ca2+濃度穩(wěn)定后給予第2次刺激，胞內(nèi)Ca2+又升高，重復(fù)3～4次得到可重復(fù)均一波峰，BzATP反應(yīng)的平均峰值為nmol/L。

NMDA受體拮抗劑可阻斷BzATP介導(dǎo)的Ca2+升高：分別用三種不同拮抗劑MK-801、APV和Memantine進行實驗。如先用BzATP15s后，得到第一個RGC胞內(nèi)Ca2+升高的波峰，峰值為nmol/L，用灌注液沖洗3min，接著MK-801預(yù)處理3min后，給予50μmol/LBzATP刺激15s，得到第２個RGC胞內(nèi)Ca2+升高的波峰，峰值為nmol/L。為了更客觀地觀察MK-801的作用，在同一細胞再重復(fù)上述實驗，分別得到第３和第４個波峰，峰值分別為nmol/L、nmol/L。將圖1B中兩次MK-801作用下BzATP的反應(yīng)高峰的平均值nmol/L與兩次單獨BzATP刺激的反應(yīng)高峰的平均值nmol/L進行比較，MK-801可顯著降低BzATP介導(dǎo)的Ca2+升高幅度達。同法進行APV和Memantine的實驗，得到圖1C和1D，兩者分別降低BzATP介導(dǎo)的Ca2+升高幅度為、。三組數(shù)據(jù)均表明NMDA受體拮抗劑可阻斷BzATP介導(dǎo)的Ca2+升高。

NMDA受體拮抗劑減少P2X7受體激活劑BzATP介導(dǎo)的RGC凋亡

對事先用熒光染料Aminostilbamidine標(biāo)記的幼鼠RGC進行原代培養(yǎng)。已知與50μmol/LBzATP共同孵育24h后，RGC數(shù)量較正常對照組明顯減少，呈劑量依賴性，且細胞以凋亡形式死亡。本實驗50μmol/LBzATP組RGC的數(shù)量為對照組的(64%±2%)。事先分別用NMDA受體通道拮抗劑MK-801、APV和Memantine孵育30min，再與BzATP共同孵育24h。MK-801和APV使BzATP誘導(dǎo)的RGC凋亡數(shù)目大大減少,存活率上升，但Memantine的作用較弱。

3討論

嘌呤研究的進展

嘌呤和嘌呤受體是重要的調(diào)節(jié)遞質(zhì)影響著中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能［4］,近年來成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點之一。

嘌呤家族分為P1、P2兩大類。P1代表著以腺苷及其A1、A2A、A2B和A3受體的一類核苷；P2家族包括ATP及其核苷酸受體P2X1-7和P2Y1-6，其中，P2X7受體是近年來發(fā)現(xiàn)的、有獨特特點的受體，在鈣離子(Ca2+)內(nèi)流、細胞凋亡等方面起重要作用[5-10]。研究表明哺乳類及鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元含有P2X1-7的受體表達，尤其RGC層有P2X7的存在[11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)P2X7受體的激活參與了大量視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生、發(fā)展[12-14]。例如在玻璃體視網(wǎng)膜病變中，P2X7受體的表達增加[12]；受體的激活可引起視網(wǎng)膜周細胞收縮[14]。

我們已有的研究闡明了ATP受體P2X7激活是導(dǎo)致RGC凋亡的重要環(huán)節(jié)[5-8]，提出青光眼視神經(jīng)損傷嘌呤調(diào)節(jié)的可能機制：青光眼高眼壓引起嘌呤信號ATP釋放[2-3]，作用于視網(wǎng)膜細胞上P2X7受體，引起Ca2+內(nèi)流導(dǎo)致RGC凋亡。將嘌呤調(diào)節(jié)引入青光眼中研究，為探討青光眼發(fā)病機制提供了新的思路與途徑。

NMDA與青光眼發(fā)病機制

青光眼是由病理性高眼壓引起，以RGC死亡、視功能逐漸喪失為主要特征的一種進行性視神經(jīng)病變。RGC以凋亡的形式死亡，但目前RGC凋亡的機制尚未完全清楚。

有學(xué)說認為升高的眼內(nèi)壓可能降低了視神經(jīng)乳頭的血流灌注，但在沒有眼內(nèi)壓升高的視網(wǎng)膜動脈阻塞的病例中，卻沒有見到在青光眼中應(yīng)見到的同樣改變，表明在正常的血管彈性下，單純血管因素是不足以引起RGC死亡的；另有人認為，升高的眼內(nèi)壓也可能因為擴張了視神經(jīng)乳頭篩板從而抑制了神經(jīng)營養(yǎng)因子諸如腦源性BNDF等的軸漿運輸，但研究發(fā)現(xiàn)RGC的死亡可以先于神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏，這表明RGC的死亡在早期可能胞體早有變化，后因神經(jīng)營養(yǎng)因子的缺乏而加速了死亡進程。另一理論涉及的是興奮性神經(jīng)毒損傷：興奮性神經(jīng)毒谷氨酸升高、NMDA受體激活引起RGC細胞內(nèi)Ca2+升高導(dǎo)致細胞死亡[1]。盡管目前對此學(xué)說仍未完全肯定[15，16]，但可重復(fù)性的研究證實谷氨酸受體激動劑確實對RGC表現(xiàn)出毒性作用[1，17，18]。臨床和基礎(chǔ)研究表明谷氨酸受體NMDA拮抗劑Memantine能預(yù)防壓力誘導(dǎo)的RGC死亡，提示谷氨酸在青光眼發(fā)生發(fā)展中起一定作用[19]。然而，升高的眼內(nèi)壓是如何產(chǎn)生過量的谷氨酸去過激NMDA受體還不完全清楚，最初有研究報道，降低谷氨酸轉(zhuǎn)運子水平并不能逆轉(zhuǎn)這一作用[19，20]。

P2X7受體/NMDA受體在青光眼發(fā)病機制中的作用

研究已表明，嘌呤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在高眼壓致谷氨酸增高的過程中起重要中介調(diào)節(jié)作用。首先高眼壓可引起ATP釋放。實驗發(fā)現(xiàn)，壓力、損傷、應(yīng)激等均可刺激嘌呤信號ATP的釋放[2，3,22，23]，如輕度的壓力可導(dǎo)致內(nèi)層視網(wǎng)膜星狀細胞釋放出ATP[22],眼內(nèi)壓升高可檢測到視網(wǎng)膜持續(xù)的釋放出ATP[2，3]。我們將剪去眼前段的新鮮牛眼放入自制壓力容器中，牛眼杯內(nèi)ATP濃度隨壓力升高而增高。另外，在激光誘導(dǎo)的實驗性猴青光眼模型中檢測到玻璃體腔ATP水平的增高。最近在臨床高眼壓青光眼病人房水中也證實有ATP釋放。

ATP受體P2X7激活可導(dǎo)致RGC凋亡[1-3，5-8]。關(guān)鍵的研究顯示P2X7受體激活可誘發(fā)出視網(wǎng)膜星狀細胞[25]和RGC釋放出谷氨酸。因此，眼內(nèi)壓力、P2X7受體、谷氨酸釋放及NMDA受體之間可能存在一定的相互作用，而明確其相互作用機制可能是理解RGC死亡和保護的關(guān)鍵部分。

本研究結(jié)果顯示，三種NMDA受體拮抗劑MK-801、APV和Memantine均可阻斷P2X7受體激動劑BzATP介導(dǎo)的RGC胞內(nèi)Ca2+升高作用和減少體外培養(yǎng)的BzATP介導(dǎo)的RGC死亡數(shù)量。有力地說明，P2X7與NMDA受體之間可能共同介導(dǎo)著RGC興奮性神經(jīng)毒損傷機制，且P2X7在NMDA受體的上一環(huán)節(jié)先起作用。

【參考文獻】

LEIAZ,ZHANGD,ABELEAE，etal.BlockadeofNMDAreceptormediatedmobilizationofintracellularCa2+preventneurotoxicity[J].BrainRes,1992,598(1-2):196-202.

ZHANGX,REIGADAD,MITCHELLCH.IncreasedocularpressureincreasesvitreallevelsofATP.InvestOphthalmolVisSci,2006,47(8):426-428.

MITCHELLCH,ZHANGX,REIGADAD,etal.Pressure-inducedATPreleasemaystimulateP2X7receptorstotriggerretinalganglioncelldeath.InvestOphthalmolVisSci,2004,45(8):2083-2085.

朱永紅，李海標(biāo)，黃嘌呤抗神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜細胞凋亡的作用［J］．解剖學(xué)研究，2001，23：295-297.

ZHANGX,ZHANGM,LATIESAM,etal.StimulationofP2X7receptorelevatedCa2+andkillsretinalganglioncells[J].InvestOphthalmolVisSci,2005,46(6):2183-2191.

ZHANGX,ZHANGM,MITCHELLCH.AdenosinepreventsdeathofretinalganglioncellsfollowingP2X7receptoractivationbyactingtheA3receptors[J].JNeurochem,2006,98(2):566-575.

張秀蘭,張梅,葛堅,等.嘌呤受體P2X7激活介導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞死亡的實驗研究[J].中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2006,27(2):130-134.

MITCHELLCH,ZHANGM,ZHANGX,etal.NeuronaldeathevokedbytheP2X7receptormediatedbytheNMDAreceptor［J］.InvestOphthalmolVisSci,2006,47(8):2589-2594.

GORODESKIGI.EstrogenattenuatesP2X7-R-mediatedapoptosisofuterinecervicalcellsbyblockingcalciuminflux[J].NucleosidesNucleotidesNucleicAcids,2004,23(8-9):1287-1293.

YOONMJ,LEEHJ,LEEYS,etal.ExtracellularATPisinvolvedintheinductionofapoptosisinmurinehematopoieticcells[J].BiolPharmBull,2007，30(4):671-676.

PUTHUSSERYT,FLETCHEREL.SynapticlocalizationofP2X7receptorsintheratretina[J].JCompNeurol,2004,472(1):13-23.

SUGIYAMAT,OKUH,KOMORIA,etal.EffectofP2X7receptoractivationontheretinalbloodvelocityofdiabeticrabbits[J].ArchOphthalmol,2006，124(8):1143-1149.

BRINGMANNA,PANNICKET,MOLLV,etal.UpregulationofP2X7receptorcurrentsinmüllerglialcellsduringproliferativevitreoretinopathy[J].InvestOphthalmolVisSci,2001,42(3):860-867.

SUGIYAMAT,KAWAMURAH,YAMANISHIS,etal.RegulationofP2X7-inducedporeformationandcelldeathinpericyte-containingretinalmicrovessels[J].AmJPhysiolCellPhysiol,2005，288(3):C568-576.

ULLIANEM,BARKISWB,CHENS,etal.InvulnerabilityofretinalganglioncellstoNMDAexcitotoxicity[J].MolCellNeurosci,2004,26(4):544-557.

LUOX,BABAA,MATSUDAT,etal.Susceptibilitiestoandmechanismsofexcitotoxiccelldeathofadultmouseinnerretinalneuronsindissociatedculture[J].InvestOphthalmolVisSci,2004,45(12):4576-4582.

LANYW,ISHIIY,PALMERKE,etal.2-Deoxy-D-glucoseprotectsretinalganglioncellsagainstexcitotoxicity[J].Neuroreport,2003,14(18):2369-2372.

MANABES,LIPTONSA.DivergentNMDAsignalsleadingtoproapoptoticandantiapoptoticpathwaysintheratretina[J].InvestophthalmolVisSci,2003,44(1):385-392.

WOLDEMUSSIEE,YOLESE,SCHWARTZM,etal.Neuroprotectiveeffectofmemantineindifferentretinalinjurymod