基因工程第三章基因工程的載體

（優(yōu)選）基因工程第三章基因工程的載體本文檔共169頁；當前第1頁；編輯于星期六\2點25分載體（Vector）

基因克隆載體(genecloningvector):能承載外源基因，將其帶入受體細胞得以穩(wěn)定維持的DNA分子。本文檔共169頁；當前第2頁；編輯于星期六\2點25分載體的功能（FunctionofVector）運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞。為外源基因提供復制能力或整合能力。為外源基因的擴增或表達提供必要的條件。本文檔共169頁；當前第3頁；編輯于星期六\2點25分多克隆位點(multiplecloningsite,MCS)ori復制起始點(ReplicationOrigin,ORI)遺傳標記(Geneticselectionmark)pUCMCSAmpr克隆載體的結(jié)構(gòu)特征(CharacterofVector)本文檔共169頁；當前第4頁；編輯于星期六\2點25分(1)針對受體細胞的可轉(zhuǎn)移性；(2)自主復制功能；(3)顯著的篩選標記；(4)特定的多克隆位點；(5)安全性；

克隆載體具備的條件：本文檔共169頁；當前第5頁；編輯于星期六\2點25分載體分類：1）根據(jù)構(gòu)建克隆載體所用的DNA來源分為：質(zhì)粒載體病毒或噬菌體載體質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的載體等。本文檔共169頁；當前第6頁；編輯于星期六\2點25分2）根據(jù)應用對象分：原核生物克隆載體植物克隆載體動物克隆載體3）按照功能分：克隆載體:

克隆一個基因或DNA片斷表達載體:

用于一個基因的蛋白表達整合載體:

把一個基因插入到染色體組中本文檔共169頁；當前第7頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第8頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體1.1與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)1.2質(zhì)粒載體必須具備的基本條件1.3質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建本文檔共169頁；當前第9頁；編輯于星期六\2點25分質(zhì)粒載體以質(zhì)粒DNA分子為基礎構(gòu)建的克隆載體，含有質(zhì)粒的復制起始位點，能夠按質(zhì)粒復制的形式進行復制。1.1.1質(zhì)粒組成與構(gòu)型1.1.2質(zhì)粒DNA大小1.1.3質(zhì)粒DNA的復制1.1.4質(zhì)粒的不親和型1.1.5質(zhì)粒遷移1.1.6顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒1.1與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)本文檔共169頁；當前第10頁；編輯于星期六\2點25分1.1.1質(zhì)粒組成與構(gòu)型質(zhì)粒(plasmid)是一種寓于宿主細胞中染色體外的裸露DNA分子，一個質(zhì)粒就是一個DNA分子。數(shù)量：每種質(zhì)粒在相應的宿主細胞內(nèi)保持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)，少者幾個，多者上百個。存在廣泛：許多細菌、乳酸桿菌、藍藻、酵母等生物中均發(fā)現(xiàn)含有質(zhì)粒。本文檔共169頁；當前第11頁；編輯于星期六\2點25分DNA構(gòu)型：在宿主細胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以ccc-DNA的形式存在。體外在理化因子作用下，質(zhì)?？赡艹蔀殚_環(huán)DNA和線形DNA分子。本文檔共169頁；當前第12頁；編輯于星期六\2點25分1.1.2質(zhì)粒DNA大小質(zhì)粒DNA分子小的不足2kb，大的可達100kb以上，多數(shù)在10kb左右。本文檔共169頁；當前第13頁；編輯于星期六\2點25分1.1.3質(zhì)粒DNA的復制質(zhì)粒含有復制起始位點，能在宿主細胞內(nèi)進行自我復制。COP因子：決定質(zhì)粒的拷貝數(shù)，指揮細胞合成阻遏物，當質(zhì)粒復制到一定的拷貝時，阻遏物的量也積累到足以阻止質(zhì)粒的復制。Rep基因：指揮宿主細胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制。Par基因：保證細胞分裂時質(zhì)粒正確分配到子細胞。本文檔共169頁；當前第14頁；編輯于星期六\2點25分“嚴緊型”質(zhì)粒（StringentPlasmid）：低拷貝數(shù)，每個宿主細胞僅含1-3份的拷貝?！八沙谛汀辟|(zhì)粒（RelaxedPlasmid）：高拷貝數(shù)的，每個宿主細胞可達到10-60份拷貝。本文檔共169頁；當前第15頁；編輯于星期六\2點25分1.1.4質(zhì)粒的不親和性（plasmidincompatibility）質(zhì)粒的不親和性，也稱不相容性:在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細胞中穩(wěn)定地共存。大腸桿菌質(zhì)?，F(xiàn)已鑒別出25個以上的不親和群。它們之間是相容的，而同一個不親和群內(nèi)的質(zhì)粒是不相容的。本文檔共169頁；當前第16頁；編輯于星期六\2點25分1.1.5質(zhì)粒遷移(PlasmidMobilization)通過接合作用,質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)移到新的宿主細胞中。Tra基因：指令宿主細胞合成菌毛和細胞表面物，促使宿主細胞與受體細胞表面結(jié)合，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。分為兩種：接合型質(zhì)粒(ConjugativePlasmid)：含有自我復制基因、接合轉(zhuǎn)移Tra基因，拷貝數(shù)少，分子大。非接合型質(zhì)粒(non-ConjugativePlasmid)：能夠自我復制，但不含Tra基因，這類質(zhì)粒不能從一個細胞自我轉(zhuǎn)移到另一個細胞；較安全，且拷貝數(shù)多，分子小，適于構(gòu)建克隆載體。本文檔共169頁；當前第17頁；編輯于星期六\2點25分1.1.6顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)粒顯性質(zhì)粒：也稱表達型質(zhì)粒，質(zhì)粒攜帶一些除與自身復制和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因外，還有別的基因使得宿主細胞出現(xiàn)新性狀。隱蔽質(zhì)粒：宿主細胞含有某種質(zhì)粒，但無異樣性狀表現(xiàn)。顯性質(zhì)粒的相關(guān)基因：抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr，產(chǎn)毒素基因：大腸桿菌素基因（Col-質(zhì)粒）。降解基因：降解重金屬、有機物和農(nóng)藥等。致瘤基因：誘導某些組織形成腫瘤，如Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒。本文檔共169頁；當前第18頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)粒克隆載體1.1與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒性質(zhì)1.2質(zhì)粒載體必須具備的基本條件1.3質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建本文檔共169頁；當前第19頁；編輯于星期六\2點25分(1)能自主復制，即本身是復制子(2)具有多種限制酶的單一切割位點，即多克隆位點，并在此位點中插入外源基因片段，不影響本身的復制功能；(3)在基因組中有1-2個篩選標記，為寄主細胞提供易于檢測的表型特征。(4)分子量要小，多拷貝，易于操作。；(5)構(gòu)建不同用途的質(zhì)粒載體時，可以根據(jù)特殊需要組裝各種元件（小DNA片段）。1.2質(zhì)粒載體必須具備的基本條件本文檔共169頁；當前第20頁；編輯于星期六\2點25分天然質(zhì)粒：沒有經(jīng)過以基因克隆為目標的體外修飾改造的質(zhì)粒。

天然質(zhì)粒相對分子質(zhì)量拷貝數(shù)單一酶切位點選擇性標記復制類型pSC1015.8×1069.09kb1~3EcoRItetr嚴緊ColE14.2×10620EcoRI大腸桿菌素松弛RSF21247.4×10610EcoRI(BamHI)ampr松弛局限性：分子量高、拷貝數(shù)低、合適的單一酶切位點少、選擇標記不合適本文檔共169頁；當前第21頁；編輯于星期六\2點25分如何識別載體上的各種元件及其功能：本文檔共169頁；當前第22頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第23頁；編輯于星期六\2點25分1.3.1大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)1.3.3農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5酵母2um質(zhì)?？寺≥d體1.3質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建本文檔共169頁；當前第24頁；編輯于星期六\2點25分1.3.1大腸桿菌質(zhì)粒克隆載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)建

（1）pBR322：p-plsmid，BR分別為該質(zhì)粒的兩位主要構(gòu)建者F.Bolivar和姓氏的頭一個字母，“322”為實驗編號。含有雙抗基因（Apr，Tcr）和ColE1復制起始子。

本文檔共169頁；當前第25頁；編輯于星期六\2點25分優(yōu)點：①具有較小的分子量，4363bp。②具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。含有24種單一的限制性內(nèi)切酶識別位點，且BamHI、SalI和PstI等幾個酶切位點分別處于四環(huán)素和氨芐青霉素抗性基因上，當將外源DNA片段插入到這些位點時，可用抗生素基因的失活來篩選重組體。

③具較高的拷貝數(shù)，經(jīng)過擴增之后，每個細胞中可累積1000-3000個拷貝。本文檔共169頁；當前第26頁；編輯于星期六\2點25分pBR322質(zhì)粒載體的篩選插入失活篩選法本文檔共169頁；當前第27頁；編輯于星期六\2點25分(2)衍生pUC質(zhì)粒載體由美國加利福尼亞大學（UniversityofCalifornia）J.Messing和J.Vieria于1987年構(gòu)建。包括如下四個組成部分：i)

來自pBR322質(zhì)粒的復制起點(ori)；ii)氨芐青霉素抗性基因(ampr)

；

本文檔共169頁；當前第28頁；編輯于星期六\2點25分iii)大腸桿菌β-半乳糖酶基因(lacZ)的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ'基因；iiii)

位于lacZ'基因中的靠近5’--端的一段多克隆位點（multiplecloningsites,MCS）區(qū)段。本文檔共169頁；當前第29頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第30頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第31頁；編輯于星期六\2點25分pUC18-19多克隆位點本文檔共169頁；當前第32頁；編輯于星期六\2點25分表達性載體（ExpressionVector）：根據(jù)宿主細胞的不同，表達蛋白質(zhì)的載體大致可分為：原核生物表達載體和真核生物表達載體。由于真核生物種類繁多，又分為酵母表達載體，植物表達載體，昆蟲類表達載體和哺乳類表達載體等等。本文檔共169頁；當前第33頁；編輯于星期六\2點25分原核生物表達性載體（ProkaryoticExpressionVector）：pGEXVector(GSTtagExpressoinVector):本文檔共169頁；當前第34頁；編輯于星期六\2點25分pGEXVectorMCSregion：本文檔共169頁；當前第35頁；編輯于星期六\2點25分pETVector(StagExpressoinVector):本文檔共169頁；當前第36頁；編輯于星期六\2點25分pETVectorMCSregion：本文檔共169頁；當前第37頁；編輯于星期六\2點25分真核核生物表達性載體（EukaryoticExpressionVector）：pcDNA3.1mammalianExpressionVector:本文檔共169頁；當前第38頁；編輯于星期六\2點25分pcDNA3.1VectorMCSregion：本文檔共169頁；當前第39頁；編輯于星期六\2點25分pEGFP-C1mammalianExpressionVector:本文檔共169頁；當前第40頁；編輯于星期六\2點25分GFPandREPExpressionVector:本文檔共169頁；當前第41頁；編輯于星期六\2點25分pMSCpuroRetroviralVector

Map:本文檔共169頁；當前第42頁；編輯于星期六\2點25分RetroviralVector:本文檔共169頁；當前第43頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第44頁；編輯于星期六\2點25分1.3.1大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)建1.3.3農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5酵母2um質(zhì)粒克隆載體1.3質(zhì)?？寺≥d體的構(gòu)建（ConstructionofPlasmidVector）:本文檔共169頁；當前第45頁；編輯于星期六\2點25分致癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)含一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時，這種質(zhì)粒會引發(fā)植物在創(chuàng)傷部位組織增生而形成植物腫瘤

(冠癭瘤)，稱此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)。1.3.3農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建本文檔共169頁；當前第46頁；編輯于星期六\2點25分上：電鏡下的根癌農(nóng)桿菌下：冠癭瘤本文檔共169頁；當前第47頁；編輯于星期六\2點25分Ti質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀DNA分子，約200kb，分四個區(qū)：1）T-DNA(transferDNA)：25kb，進入植物細胞區(qū)域含有多種基因，其表達產(chǎn)物破壞植物細胞內(nèi)源激素的平衡，干擾細胞分裂從而引發(fā)植物腫瘤。本文檔共169頁；當前第48頁；編輯于星期六\2點25分T-DNA左右兩邊界(LB，RB)各有一個25bp長的正向重復序列(LTS和RTS)，對T-DNA的轉(zhuǎn)移和整合是不可缺少的。本文檔共169頁；當前第49頁；編輯于星期六\2點25分2）Vir區(qū)：位于T-DNA上游的一組基因，表達產(chǎn)物能激活T-DNA向植物細胞轉(zhuǎn)移，引發(fā)植物腫瘤，顯示細菌的致病性。3)Con區(qū)：含有tra基因，農(nóng)桿菌之間轉(zhuǎn)移接合4)Oir區(qū)：調(diào)控質(zhì)粒的自主復制本文檔共169頁；當前第50頁；編輯于星期六\2點25分

農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建

與大腸桿菌的質(zhì)粒載體不同，構(gòu)建的Ti質(zhì)粒載體不真正用于細菌，而是用于植物細胞，農(nóng)桿菌只起著中間介導的作用。構(gòu)建共整合質(zhì)粒載體和雙元載體本文檔共169頁；當前第51頁；編輯于星期六\2點25分共整合質(zhì)粒載體本文檔共169頁；當前第52頁；編輯于星期六\2點25分將外源基因克隆在大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒的T-DNA區(qū)內(nèi)；雙元整合載體本文檔共169頁；當前第53頁；編輯于星期六\2點25分1.3.1大腸桿菌質(zhì)粒載體pBR322及其衍生載體的構(gòu)建1.3.3農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建1.3.5酵母2um質(zhì)?？寺≥d體1.3質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建（ConstructionofPlasmidVector）本文檔共169頁；當前第54頁；編輯于星期六\2點25分1.3.5酵母2μm質(zhì)粒載體酵母是一種最簡單的單細胞異養(yǎng)真核生物，可以像細菌一樣進行基因操作，能夠在廉價的培養(yǎng)基上生長，可高密度發(fā)酵。酵母又具有真核生物的特性，具有對外源基因翻譯后進行蛋白質(zhì)加工和修飾的功能。幾乎所有的釀酒酵母菌中都存在2μm質(zhì)粒。利用2μm質(zhì)粒和其染色體組分與細菌質(zhì)粒pBR322構(gòu)建酵母質(zhì)粒載體，能分別在細菌和酵母菌中進行復制，又稱為穿梭載體。本文檔共169頁；當前第55頁；編輯于星期六\2點25分2μm復制起點YEP載體（游離型）本文檔共169頁；當前第56頁；編輯于星期六\2點25分

質(zhì)?？寺≥d體的用途

用于保存和擴增片段小于2kb的目的基因。構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫?？捎糜谀康幕虻臏y序。作為核酸雜交時探針的來源。本文檔共169頁；當前第57頁；編輯于星期六\2點25分回顧plasmid質(zhì)粒載體必須具備的基本條件pUC18/19質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體Ti質(zhì)粒pUC18/19質(zhì)粒載體的組成特點、結(jié)構(gòu)圖。

插入失活α-互補T-DNA本文檔共169頁；當前第58頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第59頁；編輯于星期六\2點25分病毒由DNA(或RNA)和外殼蛋白組成，經(jīng)包裝后成為病毒顆粒。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞，利用宿主細胞的合成系統(tǒng)進行DNA(或RNA)復制和殼蛋白的合成，實現(xiàn)病毒顆粒的增殖。本文檔共169頁；當前第60頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第61頁；編輯于星期六\2點25分2病毒（噬菌體）克隆載體λ噬菌體克隆載體M13克隆載體Cosmid克隆載體CaMV克隆載體TMV克隆載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體本文檔共169頁；當前第62頁；編輯于星期六\2點25分2.1.1λ噬菌體性質(zhì)λ噬菌體由DNA和外殼蛋白組成，分為頭部和尾部。2.1λ噬菌體克隆載體本文檔共169頁；當前第63頁；編輯于星期六\2點25分（1）λDNA：λDNA在噬菌體中以線狀雙鏈DNA分子存在，全長48502bp。

COS位點(cohesiveendsite):左右兩端各有12個核苷酸組成的5’凸出黏性末端，而且兩者的核苷酸序列互補。本文檔共169頁；當前第64頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第65頁；編輯于星期六\2點25分（2）λ基因組DNA的結(jié)構(gòu)含50個以上的基因，各司其職。本文檔共169頁；當前第66頁；編輯于星期六\2點25分AWBCDEFZUVGHMLKIJb2

cIcrocIIOPQSR

attintxisgamredcIIINCOSCOS

頭部基因尾部基因功能不明區(qū)溶源化重組早期控制阻遏DNA合成晚期溶菌約有20kb生長非必須區(qū)段cI基因：溶源過程控制基因。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)本文檔共169頁；當前第67頁；編輯于星期六\2點25分（1）λ噬菌體是一種溫和噬菌體，對大腸桿菌具有很高的感染能力，以溶源狀態(tài)可保存在大腸桿菌中。（2）能承載比較大外源DNA：λDNA上約有20kb的區(qū)域?qū)Ζ耸删w的生長不是絕對需要的，可以缺失或被外源DNA片段取代。(3)λDNA上有56種限制酶識別位點（見附錄3-1），便于多種外源DNA片段的克隆。2.1.2選用λ噬菌體作為克隆載體的依據(jù)本文檔共169頁；當前第68頁；編輯于星期六\2點25分

①限制性內(nèi)切核酸酶切位點的改造點突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識別序列失效，避免外源DNA片段插入必需區(qū)；2.1.3構(gòu)建λ噬菌體克隆載體本文檔共169頁；當前第69頁；編輯于星期六\2點25分②在非必需區(qū)插入選擇標記基因；③建立重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)。重組λDNA分子經(jīng)過體外包裝稱噬菌體顆粒后才能有效轉(zhuǎn)導受體細胞。本文檔共169頁；當前第70頁；編輯于星期六\2點25分①置換型載體可被外源DNA置換的λ噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一對限制性酶切位點的載體，稱為置換型載體。2.1.4λ噬菌體載體的類型λλ本文檔共169頁；當前第71頁；編輯于星期六\2點25分只有λDNA的長度大于野生型λ噬菌體DNA長度的75％而不超過其105％時，才能被包裝成噬菌體顆粒，當DNA的長度短于野生型的75%或超過105%時，噬菌體的活性就急劇下降，因此要求λ載體DNA和外源DNA長度之和在39～53kb之間。本文檔共169頁；當前第72頁；編輯于星期六\2點25分②插入型載體：有一類只含一個限制性位點可供插入外源DNA的載體，這類λ噬菌體載體稱插入型載體。僅保留了EcoRⅠ的單一切點可插入長度為10kb的外源DNA.切點又位于報告基因上，故在切開DNA并插入外源基因后，報告基因失活，即可依此進行重組體的篩選本文檔共169頁；當前第73頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第74頁；編輯于星期六\2點25分主要用于建立cDNA文庫。也用于克隆外源目的基因。2.1.5λ噬菌體克隆載體的應用本文檔共169頁；當前第75頁；編輯于星期六\2點25分2)組裝

1)連接3)侵染置換載體本文檔共169頁；當前第76頁；編輯于星期六\2點25分2病毒（噬菌體）克隆載體λ噬菌體克隆載體單鏈DNA噬菌體載體M13Cosmid克隆載體噬菌質(zhì)粒載體CaMV克隆載體TMV克隆載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體本文檔共169頁；當前第77頁；編輯于星期六\2點25分2.2單鏈DNA噬菌體載體M13、f1、fd。2.2.1優(yōu)越性：1)單鏈DNA噬菌體的復制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復制形式的DNA簡稱RFDNA；2)不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3)單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA制約，不存在包裝限制問題；4)容易測定外源DNA片斷的插入取向；5)可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。本文檔共169頁；當前第78頁；編輯于星期六\2點25分2.2.2M13噬菌體的特點外型絲狀，環(huán)狀單鏈DNA(6407bp)，M13至少11個編碼基因，M13DNA不插入到宿主基因組中,不裂解細菌，但抑制宿主生長。本文檔共169頁；當前第79頁；編輯于星期六\2點25分++-+-+-+-+-+-單鏈結(jié)合蛋白RF型DNA復制約200copy+++++以-鏈DNA為模板合成+鏈DNA本文檔共169頁；當前第80頁；編輯于星期六\2點25分滾環(huán)方式復制本文檔共169頁；當前第81頁；編輯于星期六\2點25分M13的侵染循環(huán)本文檔共169頁；當前第82頁；編輯于星期六\2點25分2.2.3構(gòu)建M13噬菌體載體插入選擇標記基因在選擇標記基因區(qū)內(nèi)組裝合適的多克隆位點。本文檔共169頁；當前第83頁；編輯于星期六\2點25分M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖本文檔共169頁；當前第84頁；編輯于星期六\2點25分2.2.4M13克隆載體的應用適合用于制備克隆基因的單鏈DNA。用于制備測序用單鏈DNA模板、特異的單鏈DNA探針，定位誘變等。本文檔共169頁；當前第85頁；編輯于星期六\2點25分2病毒（噬菌體）克隆載體λ噬菌體克隆載體M13克隆載體Cosmid克隆載體噬菌質(zhì)粒載體CaMV克隆載體TMV克隆載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體本文檔共169頁；當前第86頁；編輯于星期六\2點25分cosmid載體：也稱粘粒、柯斯載體。這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos末端及質(zhì)粒重組而成的載體。該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細胞內(nèi)。2.3Cosmid(考/柯斯)克隆載體本文檔共169頁；當前第87頁；編輯于星期六\2點25分

Cosmid(考/柯斯)克隆載體特征:1)具有質(zhì)粒的性質(zhì)，含有大腸桿菌內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點、克隆位點和選擇標記基因等基本構(gòu)件，可在細菌中保存和大量復制。2)含有Cosmid位點，可進行體外包裝；3)Cosmid載體一般在10kb以下，能承載比較大的外源DNA片段。本文檔共169頁；當前第88頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第89頁；編輯于星期六\2點25分2.4噬菌質(zhì)粒載體，簡稱噬菌粒1）組成：噬菌粒是由單鏈噬菌體和質(zhì)粒載體DNA融合而成。質(zhì)粒ColE1的ori抗生素抗性標記M13或f1噬菌體復制起點如pUC118噬菌粒載體就是將野生型M13的基因間隔區(qū)插入質(zhì)粒載體pUC18構(gòu)建而成的。本文檔共169頁；當前第90頁；編輯于星期六\2點25分2）噬菌粒優(yōu)點：①載體本身分子小，約為3000bp，便于分離和操作；②克隆外源DNA的容量為10kb，而M13噬菌體載體是克隆300~400bp；③兩種復制方式噬菌粒在寄主細胞內(nèi)以質(zhì)粒形式存在，復制產(chǎn)生雙鏈DNA。當用輔助噬菌體M13感染宿主細胞后，噬菌質(zhì)粒的復制就轉(zhuǎn)變成如同M13噬菌體一樣的滾環(huán)復制，產(chǎn)生單鏈DNA。用途：可用于制備單鏈或雙鏈DNA，克隆和表達外源基因。本文檔共169頁；當前第91頁；編輯于星期六\2點25分2病毒（噬菌體）克隆載體λ噬菌體克隆載體M13克隆載體Cosmid克隆載體噬菌粒載體CaMV克隆載體TMV克隆載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體本文檔共169頁；當前第92頁；編輯于星期六\2點25分CaMV花椰菜花斑病病毒克隆載體含1個約8kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子；用于十字花科和少數(shù)非十字花科的植物基因轉(zhuǎn)移；其感染對植物有害，不能直接做載體；本文檔共169頁；當前第93頁；編輯于星期六\2點25分CaMV35S啟動子基因載體系統(tǒng)構(gòu)建的含強啟動子35SRNA啟動子的載體可在植物細胞內(nèi)高效表達基因。

本文檔共169頁；當前第94頁；編輯于星期六\2點25分CaMV35S啟動子植物根部特異性表達植物地上部特異性表達本文檔共169頁；當前第95頁；編輯于星期六\2點25分用于構(gòu)建植物載體的植物病毒：雙鏈DNA病毒：花椰菜花葉病毒(CaMV)，單鏈DNA病毒：蕃茄金黃花葉病毒(TGMV)、非洲木薯花葉病毒(ACMV)、玉米線條病毒(MSV)、小麥矮縮病毒(WDV)，RNA病毒：雀麥草花葉病毒(BMV)、大麥條紋花葉病毒(BSMV)、蕃茄叢矮病毒(TBSV)、馬鈴薯X病毒(PVX)、煙草花葉病毒(TMV)、煙草蝕刻病毒(TEV)、李痘病毒(PPV)等。本文檔共169頁；當前第96頁；編輯于星期六\2點25分動物病毒識別宿主細胞，某些動物病毒載體能高效整合到宿主基因組中，以及高拷貝和強啟動子等，有利于真核外源基因的克隆與表達。目前利用許多哺乳動物病毒如SV40、腺病毒、痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等改造后的衍生物作為基因載體。用于構(gòu)建動物載體的動物病毒：本文檔共169頁；當前第97頁；編輯于星期六\2點25分猿猴病毒-40(SV-40)載體優(yōu)點：

5243bp共價閉合環(huán)狀分子感染率高，幾乎100％寄主細胞能被感染能提供完整的真核基因轉(zhuǎn)錄所需的成分侵染性具有寄主特異性本文檔共169頁；當前第98頁；編輯于星期六\2點25分反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒是一類含RNA的病毒，進入受體細胞后，RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過兩端由數(shù)百bp組成的長末端重復序列，整合到染色體上，成為原病毒。本文檔共169頁；當前第99頁；編輯于星期六\2點25分反轉(zhuǎn)錄病毒整合入宿主DNA中的分子機制，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)座。本文檔共169頁；當前第100頁；編輯于星期六\2點25分昆蟲病毒載體優(yōu)點：高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高達100kb；高表達效率，外源DNA的表達量達到細胞蛋白質(zhì)總量的25％左右，甚至更多；具有安全性，僅感染無脊椎動物，并不引起人和乳動物本文檔共169頁；當前第101頁；編輯于星期六\2點25分

腺病毒克隆載體

雙鏈DNA病毒，基因組36kb單鏈取代本文檔共169頁；當前第102頁；編輯于星期六\2點25分腺病毒載體的優(yōu)點：宿主范圍廣,對人致病性低在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因與人類基因同源不整合到染色體中，無插入致突變性能同時表達多個基因本文檔共169頁；當前第103頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第104頁；編輯于星期六\2點25分質(zhì)粒載體或病毒載體攜帶的外源DNA分子在宿主細胞中的復制有兩種情況：自主復制：外源DNA產(chǎn)生多拷貝，但是容易丟失，導致轉(zhuǎn)基因生物的不穩(wěn)定性；整合到染色體DNA：能穩(wěn)定維持，但是插入位點不確定，可能對受體細胞基因組的自穩(wěn)系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，導致出現(xiàn)有害的突變。基因定位整合平臺系統(tǒng)可克服這兩者的負面效應，已廣泛應用于轉(zhuǎn)基因動植物的研究。3染色體定位整合克隆載體本文檔共169頁；當前第105頁；編輯于星期六\2點25分3.1基因整合平臺系統(tǒng)的組成整合平臺定位整合載體（1）整合平臺：指受體細胞基因組上給定的一個DNA區(qū)域，是外源DNA定位整合的位置(靶位)。整合平臺可以在基因區(qū)或者在基因間隔區(qū)。本文檔共169頁；當前第106頁；編輯于星期六\2點25分（2）定位整合載體：除了一般質(zhì)粒載體必須具備的元件外，還必須含有一段或兩段與整合平臺DNA區(qū)域核苷酸序列同源的DNA片段。同源DNA片段長度在1kb以上。通過同源重組，定位整合載體攜帶的目的DNA片段能夠定位整合到整合平臺DNA區(qū)域，隨受體細胞染色體DNA的復制而復制，穩(wěn)定遺傳。利用基因整合平臺系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的方法也稱為基因打靶或基因定位同源重組。本文檔共169頁；當前第107頁；編輯于星期六\2點25分分為4種類型：內(nèi)源平臺整合載體：整合平臺選定在受體細胞基因組的一個DNA區(qū)；又可分為雙交換置換載體、單交換插入載體和雙交換插入載體；外源平臺整合載體：有兩組同源DNA、整合兩次。多采用雙交換插入載體。3.2定位整合克隆載體的幾種模式本文檔共169頁；當前第108頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第109頁；編輯于星期六\2點25分與受體細胞的種屬有關(guān)；和同源DNA片段的長短有關(guān)，隨著載體同源DNA片段長度增加而提高。整合平臺DNA兩側(cè)有重組酶RecBC的chi位點可提高重組率。3.3定位整合克隆載體的定位整合效率本文檔共169頁；當前第110頁；編輯于星期六\2點25分噬菌粒載體柯斯質(zhì)粒載體特點、結(jié)構(gòu)特征染色體定位整合克隆載體回顧噬菌體λ噬菌體載體cosends主要類型包裝長度M13噬菌體載體RFDNA整合平臺定位整合載體本文檔共169頁；當前第111頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第112頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第113頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第114頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第115頁；編輯于星期六\2點25分人工染色體載體（artificialchromosomevector）：利用染色體的復制元件來驅(qū)動外源DNA片段復制的載體。穿梭載體：含有第一受體(大腸桿菌)內(nèi)源質(zhì)粒復制起始位點

含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及選擇標記基因。4.1人工染色體克隆載體含義和特點本文檔共169頁；當前第116頁；編輯于星期六\2點25分酵母的自主復制區(qū)ARS序列

(autonomouslyreplicatingsequence)

，在酵母染色體復制和質(zhì)粒復制中均發(fā)揮復制起點的功能。本文檔共169頁；當前第117頁；編輯于星期六\2點25分人工染色體載體在第一受體細胞內(nèi)按質(zhì)粒復制形式進入高拷貝復制。這種克隆載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體細胞，按染色體DNA復制的形式進行復制和傳遞。篩選第一受體的克隆子，用抗菌素抗性選擇標記；篩選第二受體的克隆子，用與受體互補的營養(yǎng)缺陷型。本文檔共169頁；當前第118頁；編輯于星期六\2點25分酵母人工染色體(YAC)的構(gòu)建：含酵母染色體的DNA端粒(TEL)、DNA復制起點(ARS)著絲粒(CEN)選擇標記(HIS和TRP1)基因多克隆位點(MCS)的DNA片段大腸桿菌的復制子大腸桿菌的選擇標記YAC載體的裝載量為350-400kb4.2人工染色體克隆載體的構(gòu)建本文檔共169頁；當前第119頁；編輯于星期六\2點25分YAC的使用本文檔共169頁；當前第120頁；編輯于星期六\2點25分細菌人造染色體(BAC)是在F質(zhì)?；A上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb，人類人工染色體載體（HAC）哺乳動物人工染色體載體（MAC）本文檔共169頁；當前第121頁；編輯于星期六\2點25分構(gòu)建基因組文庫容納大的外源片段，用于構(gòu)建人類和高等生物的基因組文庫?；蛑委煷蟮耐庠雌文苋菁{完整的基因家族，從而可能校正由多個突變位點引起的致病突變?；蚬δ荑b定大的外源片段包含編碼區(qū)、內(nèi)含子、調(diào)控區(qū)。4.3人工染色體克隆載體的應用本文檔共169頁；當前第122頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第123頁；編輯于星期六\2點25分啟動子探針型克隆載體誘導型表達克隆載體反義表達克隆載體組織特異性表達克隆載體分泌型表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體含增強子表達克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第124頁；編輯于星期六\2點25分啟動子是調(diào)控基因有效轉(zhuǎn)錄的必備元件。啟動子探針載體含有質(zhì)粒載體必備的元件和檢測部件。檢測部件有兩部分組成:遺傳標記基因以及克隆位點。標記基因：抗生素抗性基因和綠色熒光蛋白基因g?p等。5.1啟動子探針載體本文檔共169頁；當前第125頁；編輯于星期六\2點25分1）較安全的基因表達載體：由此獲得的轉(zhuǎn)基因生物進入自然環(huán)境中，由于不存在合適的誘導條件，不能表達外源基因產(chǎn)物，也不會導致環(huán)境污染和影響生態(tài)系統(tǒng)的平衡；2）能人為控制基因時空的表達，將為基因治療的臨床應用及基礎研究提供良好的手段。種類：二價金屬離子誘導啟動子、紅光誘導啟動子、熱誘導啟動子和干旱誘導啟動子等。5.2誘導型表達載體本文檔共169頁；當前第126頁；編輯于星期六\2點25分反義核酸技術(shù)：利用人工合成或重組的與靶基因互補的一段反義DNA或RNA片段，特異性地與靶基因結(jié)合，能封閉其表達。用途：此技術(shù)已成為基因治療的重要手段。將獲得的致病基因反向插入表達載體，構(gòu)建成反義表達載體。反義表達載體導入靶細胞后，可轉(zhuǎn)錄出與致病基因mRNA互補的反義RNA，特異性地封閉致病基因的表達。5.3反義表達載體本文檔共169頁；當前第127頁；編輯于星期六\2點25分高等真核生物中，一些特殊的調(diào)控序列(啟動子等)可以調(diào)控基因只能在一定的組織中才進行有效的表達。已經(jīng)構(gòu)建乳腺組織特異性表達載體、腫瘤細胞特異性表達載體、神經(jīng)組織特異性表達載體、花藥特異性表達載體種子特異性表達載體等。5.4組織特異性表達載體本文檔共169頁；當前第128頁；編輯于星期六\2點25分葉特異性表達葉肉特異性表達維管束特異表達莖特異表達本文檔共169頁；當前第129頁；編輯于星期六\2點25分馬鈴薯花藥特異性表達根特異性表達本文檔共169頁；當前第130頁；編輯于星期六\2點25分分泌型表達克隆載體雙啟動子表達克隆載體串聯(lián)啟動子表達克隆載體含增強子表達克隆載體本文檔共169頁；當前第131頁；編輯于星期六\2點25分1質(zhì)?？寺≥d體2病毒（噬菌體）克隆載體3染色體定位整合克隆載體4人工染色體克隆載體5特殊用途克隆載體本文檔共169頁；當前第132頁；編輯于星期六\2點25分列舉質(zhì)粒載體必須具備的基本特性。舉例說明什么是穿梭載體？什么是Ti質(zhì)粒和T-DNA？為什么野生型的噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？噬菌體與cos作載體有何區(qū)別？M13載體的主要用途？何謂YAC?主要特性是什么?列舉主要用于植物和動物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體和病毒載體有哪些？什么是定位整合載體？思考題本文檔共169頁；當前第133頁；編輯于星期六\2點25分回顧plasmid質(zhì)粒載體必須具備的基本條件pUC質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體phageΛ噬菌體cosends包裝長度M13載體RFDNA噬菌粒載體柯斯質(zhì)粒載體特點、結(jié)構(gòu)特征Ti質(zhì)粒載體本文檔共169頁；當前第134頁；編輯于星期六\2點25分整合平臺定位整合載體

染色體定位整合克隆載體

人工染色體克隆載體染色體的復制元件本文檔共169頁；當前第135頁；編輯于星期六\2點25分本章重點掌握的內(nèi)容兼習題掌握載體、穿梭載體、質(zhì)粒、質(zhì)粒的不相容性、人工染色體載體的概念?？寺≥d體DNA分子具備的條件。pUC18/19質(zhì)粒載體的組成、結(jié)構(gòu)圖、優(yōu)點及質(zhì)粒克隆載體用途。λ-DNA載體的構(gòu)建、類型及其優(yōu)點?？滤官|(zhì)粒載體、噬菌粒載體的結(jié)構(gòu)特征和特點。什么是Ti質(zhì)粒和T-DNA？為什么野生型的噬菌體DNA不宜作為基因工程載體？M13載體的主要用途？何謂YAC?主要特性是什么?列舉主要用于植物和動物轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒載體和病毒載體有哪些？本文檔共169頁；當前第136頁；編輯于星期六\2點25分小結(jié)載體的概念、性能plasmid質(zhì)粒載體必須具備的基本條件pUC質(zhì)粒載體pBluscriptⅡ質(zhì)粒載體phageλphagecosends主要類型包裝長度M13vectorRFDNA本文檔共169頁；當前第137頁；編輯于星期六\2點25分噬菌粒載體柯斯質(zhì)粒載體特點、結(jié)構(gòu)特征、本文檔共169頁；當前第138頁；編輯于星期六\2點25分質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈噬菌體克隆DNA大片段±*++-構(gòu)建基因組文庫-++-構(gòu)建DNA文庫+---常規(guī)的亞克隆化+---構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+---序列分析+--+單鏈探針+**--+外源基因在大腸桿菌中的表達+---四種常用載體的比較*外源DNA如超過10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低**已有個別材料可用于此目的本文檔共169頁；當前第139頁；編輯于星期六\2點25分

質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動物的病毒可改造用作動物細胞的載體。由于動物細胞的培養(yǎng)和操作較復雜、花費也較多，因而病毒載體構(gòu)建時一般都把細菌質(zhì)粒復制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來序列能方便地在細菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細胞。目前病毒載體常用者有改造來自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動物細胞中表達或試驗其功能、或作基因治療等。

本文檔共169頁；當前第140頁；編輯于星期六\2點25分花椰菜花斑病病毒DNA缺口的結(jié)構(gòu)缺口1：GAATTTTTTAA5’3’GCATTTTTTAA5’5’CGCTTAAAAAATT3’缺口2：5’GGTTGATTACTCGAGCC5’GGTTGATTACTCGAGAA3’3’CCAACTAATGAGCTCGGTT5’缺口3：5’TCCAATAGTCTTCTTTTTCAG5’TCCAATAGTCTTCTTTTTGAA3’3’AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT5’本文檔共169頁；當前第141頁；編輯于星期六\2點25分本文檔共169頁；當前第142頁；編輯于星期六\2點25分根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來進行重組子的篩選本文檔共169頁；當前第143頁；編輯于星期六\2點25分復習載體的概念、性能質(zhì)粒質(zhì)粒載體必須具備的基本條件pUC質(zhì)粒載體pBR322質(zhì)粒載體

載體必須具備的基本條件Ti質(zhì)粒載體本文檔共169頁；當前第144頁；編輯于星期六\2點25分2.2.2使用Cosmid克隆載體的基本程序本文檔共169頁；當前第145頁；編輯于星期六\2點25分1.3.6TA克隆載體原理：在PCR反應中，Taq酶通常會在延伸的PCR產(chǎn)物3’末端加上一個非配對的堿基A。根據(jù)這一特性研制出了一種線性質(zhì)粒，其5’端各帶一個不配對的堿基T。采用這樣的質(zhì)?？蓪CR產(chǎn)物以TA配對連接的方式直接進行克隆，即TA克隆。用于TA克隆的載體被稱為T-克隆載體，它的出現(xiàn)使PCR產(chǎn)物的克隆更加簡便快捷。本文檔共169頁；當前第146頁；編輯于星期六\2點25分

①限制性內(nèi)切核酸酶切位點的改造酶切除去λDNA上的部分或全部非必需區(qū)。點突變或甲基化酶處理等方法使必需區(qū)內(nèi)的酶的識別序列失效，避免外源DNA片段插入必需區(qū)；保留這種酶的1個或2個識別位點作為克隆位點，

插入型載體：非必需區(qū)只保留一個識別位點；替換型載體：非必需區(qū)具有兩個識別位點。2.1.3構(gòu)建λ噬菌體克隆載體21.6KB4.9KB5.5KB7.5KB5.9KB3.3KB

插入型的容納量：11.1kb，（）；替換型的容納量：0.7-16kb，36.4kb+4.9kb-40.4kb；51.5kb-40.4kb+4.9kb；此載體的大小是40.4kb，即48.5kb-5.5kb-2.6kb重組DNA分子大小是原λDNA的75%-105%,約36.4～51.5kb

；本文檔共169頁；當前第147頁；編輯于星期六\2點25分2病毒（噬菌體）克隆載體λ噬菌體克隆載體Cosmid克隆載體M13克隆載體CaMV克隆載體TMV克隆載體SV40克隆載體反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體腺病毒克隆載體痘苗病毒克隆載體桿狀病毒表達克隆載體本文檔共169頁；當前第148頁；編輯于星期六\2點25分猿猴空泡病毒40(Simianvirus40，SV40)2.6.1SV40DNA的一般特性1）SV40DNA為環(huán)狀雙鏈DNA（5243bp），與宿主細胞組蛋白H4，H2A，H2B和H3結(jié)合，組成念珠狀核小體-微型染色體（mini-chromosome）。

2）SV40DNA編碼兩個基因區(qū)，早期轉(zhuǎn)錄區(qū)和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)，分別以相反的方向轉(zhuǎn)錄。2.6SV40克隆載體本文檔共169頁；當前第149頁；編輯于星期六\2點25分SV40基因轉(zhuǎn)錄圖本文檔共169頁；當前第150頁；編輯于星期六\2點25分3)SV40DNA單識別位點限制性內(nèi)切酶位點

限制性內(nèi)切酶識別位點

KpnI294NaeI343HpaII346HaeII832EcoRI1782

BamHI2533BstXI2759TaqI4739BglI5235本文檔共169頁；當前第151頁；編輯于星期六\2點25分2.6.2SV40-DNA的轉(zhuǎn)錄、復制與增殖

SV40感染并進入細胞

DNA進入細胞核進行早期轉(zhuǎn)錄，合成T抗原啟動DNA復制

晚期轉(zhuǎn)錄，合成包裝蛋白

組裝成病毒顆粒，細胞裂解---受納細胞本文檔共169頁；當前第152頁；編輯于星期六\2點25分2.6.3構(gòu)建SV40克隆載體的策略和途徑策略：

a)保留完整的T-抗原基因

b)保留復制起始點(Ori),間隔區(qū)和終止序列

c)替換晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)基因本文檔共169頁；當前第153頁；編輯于星期六\2點25分1)取代型載體本文檔共169頁；當前第154頁；編輯于星期六\2點25分2)病毒-質(zhì)粒重組克隆載體

含完整早期區(qū)段和復制起始點的病