第二章 酶的發(fā)酵工程

第二章酶的發(fā)酵工程第一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五TheMethodsofEnzymeProductionextractionbiosynthesischemicalsynthesisorgan/tissue/cellmicroorganismfermentationplantcellcultureanimalcellculturefewexample第二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Unit1

BiosynthesisandRegulationofEnzymes

1.

BiosynthesisProcessofEnzyme

-Centraldogma

-Transcription-Translation

-Regulation

第三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五ReversetranscriptionCentralDogma第四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Transcription?MakingRNAfromaDNAtemplatetotransferinformationfromthegenome?IngredientsrNTPs（ribonucleotides）DNAtemplateRNApolymerase

第五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Stages

·Recognitionofinitiationsite

·Initiation

·Elongation

·Termination

·Processingormodification第六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

ThesynthesisofproteinfrommRNAtemplate.

Whatisnecessary?Template-mRNARibosomes

tRNAs(Linkedtoaminoacids)ManyaccessoryproteinsSomeenergy

Translation

mRNAproteintranslationtemplate

product第八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五FivestagesPreinitiationInitiationElongationTerminationPost-translationalmodification第十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五2.MetabolicRegulationRegulationcanoccuratanyofthepointsonthepathwaytogeneexpression（

Figure）enzymeconcentrationenzymeactivity

14-4第十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五GeneticLevelRegulationInductionFeedbackrepressionCataboliterepression(glucoseeffect)CellularLevelRegulationAllostericregulationZymogenactivationsReversiblecovalentmodification第十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Infeedbackinhibition,thereisasecondbindingsiteontheenzymewheretheinhibitorbinds,sothattheinhibitorisnotnecessarilysimilarinstructuretothesubstrate.第十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Whatarethedifferencesbetweenfeedbackrepressionandfeedbackinhibition?第十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五FeedbackrepressionFeedbackinhibitionRegulationlevelgenetic:RNAtranscriptioncellular:activityofenzymeComplexformedendproduct+repressorendproduct+enzymeEffectoperatoronDNAtemplateoccupiedbythecomplexreducedenzymeactivityConsequenceblockedtranscriptionTherespectivereactionisinhibited.第十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五GeneticLevelRegulationSomegenesareregulated.（Thelevelofgeneexpressioncanvaryunderdifferentconditions.）Othersarenot(constitutive).Theyhaveessentiallyconstantlevelsofexpression.Frequently,constitutivegenesencodeproteinsthatarenecessaryforthesurvivaloftheorganism.第十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五operonstructuralgene,Scontrolregionoperatorgene,Opromotergene,P

GeneticRegulatoryTheory

JacobandMonod------operontheory

第十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Structureofatypicaloperon第二十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

operatorgene

promotergeneoperatorgene

structuralgene

DNA

transcription

（-）

RNApolymerase（+）transcription

translation

mRNA

translation

repressor

protein

inducercontrolregioninformationregionoperonOperonpresence第二十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

Regulatorygene

Producesarepressor(regulatoryprotein)thatinhibitsanoperatorgene.

ArepressorhavetwobindingsitesOneforasmalleffector（inducer,co-repressor）moleculeTheotherforDNACo-repressor

------isasmallmoleculethattriggersrepressionoftranscriptionbybindingtoaregulatoryprotein.

第二十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Promotergene

EachpromotercontainsseveralshortDNAsubsequences,called“bindingsites”(BSs)thatareboundbyspecificproteinscalled“transcriptionfactors”(TFs)第二十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五TFsboundtotheirBSsTranscriptionmachineryGenestart第二十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Operatorgene

-isthesiteonDNAatwhicharepressorproteinbindstopreventtranscription.Structuralgene

-codesforanyRNAorproteinproduct.第二十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

TypesofGeneticLevelRegulation1)Induction-constitutiveenzymes

-inducibleenzymes

2)Repression-cataboliterepression-feedbackrepression第二十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五ConstitutiveEnzyme

Enzymesthatarealwayspresentandactiveincellregardlessoftheamountofsubstrate;InducibleEnzyme

Enzymeswhosesynthesisisstimulatedinthepresenceofachemical(substrate)orphysicalstimulus(heat,light);第二十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五(1)Induction——referstotheabilityofbacteria(oryeast)tosynthesizecertainenzymesonlywhentheirsubstratesarepresent;

Inducer------isasmallmoleculethattriggersgenetranscriptionbybindingtoaregulatoryprotein.TheRegulatoryMechanism第二十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五InductionoftheLacOperonGenetranscriptioncanbeswitchedonandoffbygeneregulationproteins.ThelacoperoninE.coliisanexampleofthatdualcontrol.Glucoseandlactoselevelscontroltheinitiationoftranscriptionofthelacoperon.第二十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五InanE.Colicellgrowingintheabsenceoflactose,arepressorproteinbindstotheoperator,preventingRNApolymerasefromtranscribingthelacoperon'sgenes.TheoperonisOFF.Whentheinducer,lactose,isadded,itbindstotherepressorandchangestherepressor'sshapesoastoeliminatebindingtotheoperator.TheoperonisON.第三十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五RegulatorgeneOperatorgeneStructuralgenesPGLacZLacYLacamRNArepressor（active）InactiveNotranscriptionNotranslationPromotergeneOGRGPGLacZLacYLacaOGRGmRNAZmRNAYmRNAaRepressorinducercomplexmRNAA、Noinducer

B、Inducer(lactose)lactoseRepressorjoinsandturnsoffoperatorgeneturnedoffStructuralgenesturnedonRNApolymerasetranscriptiontranslation第三十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五(2)FeedbackRepression(end-productrepression)

Enzymeswhosesynthesiscanbedecreased

byaddingtheendproducts(co-repressor).第三十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五ExpressionisregulatedbytheTrprepressorproteinwhichisencodedbythetrpRgene.TrpRproteinisunabletobindtotheoperatorbyitself.Aslongasthereisinsufficienttryptophaninthecell,itwillremainso.Oncetheleveloftryptophanbuildsup,theTrprepressorwillblockfurthertranscriptionoftheoperonandthesynthesisofthoseenzymeswilldecline.TheTryptophanOperon第三十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第三十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五m-RNARNApolymeraserepressorPromoterOperatorGene1Gene2Gene3NormalTranscriptionRNApolymeraserepressorPromoterOperatorGene1Gene2Gene3Co-repressorTranscriptionBlockedDNAtemplateinactiveactiveDNAtemplate第三十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五methodsrepressoradditivebindwithoperatorgeneeffectsexamplesinductionactive－＋transcriptionoff

andtranslationoff.inducer－transcription

andtranslation.Lacoperonrepressioninactive－Co-repressor＋transcriptionoff

andtranslationoff.TrpoperonInducibleOperonandRepressibleOperon第三十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五InductionRepression1.Itturnstheoperonon.1.Itturnstheoperonoff.2.Itstartstranscriptionandtranslation.2.Itstopstranscriptionandtranslation.3.Itiscausedbyanewsubstance,whichneedsenzymestogetused.3.Itiscausedbyanexcessofexistingmetabolite.4.Itoperatesinacatabolicpathway.4.Itoperatesinananabolicpathway.5.Repressorispreventedbytheinducerfromjoiningtheoperatorgene.5.Repressorisenabledbyaco-repressortojointheoperatorgene.第三十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五(3)CataboliteRepression（GlucoseEffect）WhenexposedtobothlactoseandglucoseE.coliusesglucosefirst,andcataboliterepressionpreventstheuseoflactoseWhenglucoseisdepleted,cataboliterepressionisalleviated,andthelacoperonisexpressedglucose？第三十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Thesmalleffectormoleculeincataboliterepressionisnotglucose.Thisformofgeneticregulationinvolvesasmallmolecule,cyclicAMP(cAMP)ItisproducedfromATPviatheadenylatecyclasecAMPbindsanactivatorproteinknownastheCataboliteActivatorProtein(CAP)Alsotermed：

thecyclicAMPreceptorprotein(CRP)第四十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五CataboliteRepressionRLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAaCAPgeneStructuralgeneTCAPOCAP

bindingsiteRNApolymeraseTcAMP-CAPPglucosecatabolitecAMPasePhosphodiesteraseATPcAMP5'-AMPinhibitactivateGlucosecataboliteandcAMPcAMPLower〖cAMP〗InactivateCAP第四十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Thesequentialuseoftwosugarsbyabacteriumistermeddiauxicgrowth第四十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第四十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Genesfortransportandcatabolismofsecondarycarbonsource()TimeCelldensity=Usuallyglucose第五十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五TWOquestions:HowdoescAMPcontroltheenzymelevels(orgeneexpression)?Howdoesglucose(thefavoredcarbonsource)controlthelevelsofcAMP?CataboliteRepression第五十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Unit2Methodsof

ImprovingProductivity第五十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

GeneticControl

1.genemutation

Inducible

ConstitutiveRepressed

De-repressed第五十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五2.GeneRecombination

(1)Generecombinationinvivo-Conjugation（接合）：

geneticmaterialbetweentwobacterialcellviadirectcell-to-cellcontact-Transduction（轉(zhuǎn)導(dǎo)）：avirus-Transformation（轉(zhuǎn)化）：

donorDNAfreeintheenvironment-Protoplastfusion（原生質(zhì)體融合）:

cytoplasmichybridfromtwodifferentspecies第五十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第五十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五protoplastfusion1.Twodifferentcellswiththeircellwallsremovedbyenzymes.2.ThecellsgettogetherandfuseafterexposingthemtoPolyethyleneglycol.3.Asinglecellisproduced,oftenwith2nucleiandorganellesofthe2cells.第五十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五(2)Generecombinationinvitro

（recombinantDNAtechniqueorgeneengineering）

DonorVectorReceptor第五十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第五十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

ConditionControl1.Addinginducer（

substrateanalog）2.Controllingconcentrationofrepressor-Controlend-productconcentration-Usingnot-easily-usedcarbonsource(e.g.starch)-AddacertainamountofcAMP第五十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五3.Addingsurfaceactiveagent

-ionic

harmfultocell-non-ionic

increasecellpermeability

(Tween－80,TritonX－100)4.Addingenzymeaccelerator第六十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Unit3

FermentationKineticsofEnzymeProduction

1.Cellgrowthkineticsduringenzymeproduction

2.Biosyntheticmodeofenzyme

3.Enzymeproducingkinetics

GoGoGo第六十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五1.Cellgrowthkinetics4stagesofthecellgrowthcycle:Lagstage,exponentialstage、stationerystageanddeathstage第六十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Monodequationμ:specificgrowthratecoefficientμmax：maximumgrowthratecoefficientS：concentrationoflimitingnutrientKs：Monodcoefficient第六十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第六十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Synchronizationbiosyntheticmode

）Mid-termbiosyntheticmodeContinuebiosyntheticmodeLagbiosyntheticmode2.

Patternsofenzymesynthesis第六十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

Enzymesynthesisissynchronouswithcellsgrowth.Itwouldbestoppedaftertheinducerwasremovedorcellsgrowthenteredintotheequilibriumphase.Features：Canbereduced,butnotberepressedbycataboliterepressionandfeedbackrepression.mRNAisunstable.1)Synchronizationbiosyntheticmode

第六十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五2)Mid-termbiosyntheticmode

Enzymesynthesisstartedafteraperiodofcellsgrowthandstoppedaftercellsgrowthenteredintotheequilibriumphase.Features：Enzymesynthesisisrepressedbycataboliterepressionandfeedbackrepression.mRNAisunstable.第六十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五3)Continuebiosyntheticmode

Enzymesynthesisfollowedalongwiththecellsgrowthandlastedtotheendoftheequilibriumphase.

Features：Canbereduced,butnotrepressedbycataboliterepressionandfeedbackrepression.mRNAisstable.第六十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五4)Lagbiosyntheticmode

Enzymesynthesisstartedonlyaftercellsgrowthenteredintotheequilibriumphase.

Features：Repressedbycataboliterepression.mRNAisstable.第六十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第七十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五SummaryThemajorfactorswhichaffectthemodeofenzymebiosynthesis

1）mRNAstability(Whencellgrowthstopping……)

high：enzymesynthesiscontinues.

low：enzymesynthesisstopsimmediately.2）

repressor

Berepressed：Notberepressed：第七十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Toselect：

Themostdesirable

mold

——Continuebiosyntheticmode

Totransform：

Non-perfect

mode

Synchronizationbiosyntheticmode---increasingthestabilityofmRNA.How?

Lagbiosyntheticmode

---de-repressing(cataboliterepression)

Mid-termbiosyntheticmode

---startfromtwoaspects第七十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五3.KineticsofEnzymeProductionX——細胞濃度——細胞比生長速率——生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶系數(shù)——非生長偶聯(lián)的比產(chǎn)酶速率Synchronizationbiosyntheticmode

Mid-termbiosyntheticmodeContinuebiosyntheticmodeLagbiosyntheticmode

第七十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Unit4

ProducingEnzymebyMicroorganism

Anindustrialmicroorganism

-highyield

-cheapmedia

-growrapidly

-stable(noteasilymutatedordegenerated)

-non-pathogenic

第七十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

CommonmicroorganismsinenzymeproductionEscherichiacoliPseudomonasBacillussubtilisMicrococcusStreptococcusStreptomycesAspergillusnigerAspergillusoryzaeMonascusPenicilliumTrichodermaRhizopusMucorAbsidia

SaccharomycescerevisiaeCandida第七十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

IsolationandScreening

Sampling

Enrichment

Pureculture

Primaryscreening：quantity

Secondaryscreening：quality

第七十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

Screeningofmicroorganismsfortheproductionofα-amylase第七十七頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Screeningofmicroorganismsfortheproductionofprotease第七十八頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五

TheBiotechnicalProcess第七十九頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第八十頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Fermentor第八十一頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第八十二頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五第八十三頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五HighCellDensityFermentationOptimizationandcostreduction第八十四頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五HighCell-densityCulture

10xbiowetmass,10xproductcostreductionMethodsMediaoptimization(mediaformulation)ChangesupplymodeOxygenationRemovalofinhibitorycomponents第八十五頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五Unit5

EnzymeProductionbyPlantandAnimalCellCultures第八十六頁，共九十七頁，編輯于2023年，星期五AnimalCellCulturePlantCe