第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

第六部分放射性核素在生物和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用第一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)放射自顯影技術(shù)放射自顯影技術(shù)－是利用放射性核素衰變時發(fā)射的射線對乳膠的感光作用，在乳膠底片上現(xiàn)出影像，以顯示標(biāo)本或樣品中的放射性物質(zhì)的分布、定位和定量的方法。

分子克隆９６５圖第二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五放射自顯影技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：1、

能準(zhǔn)確示蹤定位。顯示形態(tài)與功能的定位關(guān)系。2、

能在整體平面上同時比較，注入體內(nèi)后的標(biāo)記物質(zhì)在各個臟器內(nèi)的分布與代謝狀態(tài)，分析在各臟器中的攝取量，在不同時期的吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)與排泄途徑等動態(tài)關(guān)系。3、

是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝研究的有力工具。４、缺點(diǎn)是對某一位置上的放射性一般只能相對定量。

第三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五用于放射自顯影的感光材料

（是由鹵化銀和明膠所組成的乳膠）感光材料特點(diǎn)鹵素離子與銀離子按一定規(guī)律、一定距離排列，形成一立方形的晶體點(diǎn)陣。

具有理想晶體結(jié)構(gòu)的鹵化銀晶體對光線和核射線的作用不靈敏。采用不同配方和制作工藝，使鹵化銀晶體出現(xiàn)晶體缺陷（不是完全規(guī)則的六面體立方結(jié)晶，而呈如三角形、圓形等）。導(dǎo)致晶體內(nèi)部的電荷不平衡。電荷不平衡之處對相反的電荷形成陷阱（亦稱敏化中心）。陷阱對提高乳膠的靈敏度，起著重要的作用。

主要采用的感光材料有：原子核乳膠：原子核乳膠是自顯影中較理想的感光材料。它的銀鹽顆粒直徑在0.2—0.5μm，密度大（1013銀顆粒/平方厘米），分辨率高。主要用于微觀放射自顯影。X光片：X光片兩面都涂有保護(hù)層，防止乳膠層被劃傷，其乳膠銀顆粒較大，平均直徑為2.5—3μm，密度較?。?×109銀顆粒/立方厘米）。氚片：氚片銀粒的平均直徑是1μm，單面沒有保護(hù)層，因為保護(hù)層將吸收90%以上的發(fā)射的β粒子。其余性能與X光片類似。第四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五選擇乳膠一般從敏感度和分辨率兩方面來考慮。

質(zhì)量好的乳膠，顆粒細(xì)、密度大、敏感度低，則分辨力高。

反之銀鹽的顆粒愈大，敏感度愈大，分辨力也愈差。

第五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五劑量與曝光

：

放射性劑量給予的大小、曝光時間的長短與放射自顯影乳膠底片影像效果好壞有很大關(guān)系。

在一個實(shí)驗中如何選取兩者的大小，人們在實(shí)際實(shí)驗中有很多經(jīng)驗。如：分不同的時間取片等。

也有人推薦下面公式：

設(shè)：L為單位面積上衰變的放射性強(qiáng)度

Ａ０為單位時間上開始曝光時的放射性強(qiáng)度(μCi/cm2)

Ａt為單位時間上終了曝光時的放射性強(qiáng)度(μCi/cm2)

t為曝光時間,T為半衰期

則因為所以第六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五乳膠感光原理

（1）（2）（3）（4）（1）核射線與乳膠作用時，電離產(chǎn)生的電子；

（2）電子向敏化中心移動，形成一陰電層；

（3）銀離子向陰電層聚集，與此同時銀離子被還原成銀原子；

（4）銀原子在敏化中心周圍集中而形成潛影。

這些潛影將在顯影過程中起著重要地催化作用。因而也稱為“顯影中心”。

第七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五注意：

已經(jīng)建立起來的潛影，在水、氧作用下會消退（這個現(xiàn)象的實(shí)質(zhì)是溴化銀晶體中所產(chǎn)生的極少量的銀原子又退變成離子返回晶格），而失去原來的催化作用。

所以在“曝光”期間應(yīng)注意干燥、低溫和隔氧。

第八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五顯影、停影和定影

顯影和顯影液（顯影劑、促進(jìn)劑、保護(hù)劑和抑制劑組成〕停影和停影液

定影和定影液（定影液一般包括：定影劑、保護(hù)劑、停顯劑和堅膜劑）水洗和干燥

第九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五Х光膠片顯影液配方水（50℃）（ml）800米圖爾（g）2.2無水亞硫酸鈉（g）72海得爾（g）8.8無水碳酸鈉（g）48溴化鉀（g）4加水至總量（ml）1000常用停影液配方是：２８％醋酸４８ｍｌ，加水至１０００ｍｌ。

酸性堅膜定影液的配方溶液一

①海波（硫代硫酸鈉）240g②蒸餾水（５０℃）500ml

溶液二①蒸餾水（５０℃）150ml②無水亞硫酸鈉15g③２８％醋酸（冰醋酸３份，加水８份）48ml④鉀明礬15g

加水總量至：1000ml按上面試劑的順序分別配置溶液一、二，然后把溶液二加到溶液一中，并劇烈攪拌。

第十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五自顯影的閱讀與相對定量

（1）光密度法（根據(jù)自顯影中影像的黑化程度來確定組織中放射性核素相對量的方法）同時制備一套已知放射性強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品在完全相同的情況下進(jìn)行放射自顯影。用光密度計測量出標(biāo)準(zhǔn)和待測樣品的黑化強(qiáng)度，再比較定出相對含量。（２）顆粒數(shù)量計算法（也稱：微尺目數(shù)法）它是利用目鏡微尺在顯微鏡視野下圈定一定范圍（如50平方微米），進(jìn)行射線顆粒數(shù)量計數(shù)。推算出單位面積或細(xì)胞、細(xì)胞核的相對標(biāo)記強(qiáng)度。（３）徑跡數(shù)量計算法這是計算由射線粒子在膠片上所形成的徑跡的數(shù)量來測定組織和細(xì)胞中放射性核素相對含量的方法。計數(shù)方法與上述的顆粒計數(shù)法相同。求出單位面積內(nèi)的徑跡數(shù)。

第十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)放射免疫測定法

這是一種超微量分析技術(shù)，具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的突出優(yōu)點(diǎn)。這類方法名稱繁多，常見的名稱有：放射免疫測定法、免疫放射測定法、競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合測定法、放射受體測定法、放射酶測定法、體外放射分析法等。此方法的建立和發(fā)展，給醫(yī)學(xué)生物學(xué)的一個重要分支—內(nèi)分泌學(xué)帶來了革命。本方法的創(chuàng)始人榮獲了1977年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎。

第十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五基本原理

利用放射性標(biāo)記抗原(Ag*)、待測抗原(Ag)與特異性的抗體(Ab)競爭結(jié)合。

在一個放免實(shí)驗里(Ag*)和(Ab)的量需保持恒定，Ag與Ag*之和大于Ab上有效結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目。此時，Ag與Ag*-Ag間存在著函數(shù)關(guān)系第十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五

抗原抗體BFB/FB/B+F

4/2=2

4/6=67%

оо

3/3=1

3/6=50%

оо

оо

оо

оооо

2/4=0.5

2/6=33%

оо

оо

оооооооооооооо

о

оооооооооооооо

1/5=0.2

1/6=17%

游離的Ag*結(jié)合的Ag*-Ag第十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線第十五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五基本步驟：放射免疫分析目的：檢測待測樣品中抗原（Ag）的量。如上圖加樣。０－１是標(biāo)準(zhǔn)樣品；Ｔ管；ＮＳＢ是非特異性管；待測管可是若干個待測樣品。室溫放置或保溫一定時間。加入二抗（Ｔ管不加〕，室溫放置或保溫，使二抗與抗原-抗體復(fù)合物充分結(jié)合成分子量很大的復(fù)合物；3500-5000轉(zhuǎn)/分離心（T管不離心），去上清（抗原抗體的復(fù)合物沉淀，）；探測器測cpm值。利用公式計算B%：

標(biāo)準(zhǔn)管0123456Ag*1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ulAg010204080160200Ab1111111待測管

1ul?血清

1ＴNSB1ul1ul04000×１００％第十六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五以已知的標(biāo)準(zhǔn)抗原含量（ng/ml）為橫坐標(biāo)，B%為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)競爭抑制曲線待測樣品的測量，先與標(biāo)準(zhǔn)樣品一樣，計算出B%，再在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測樣品的抗原含量。

第十七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五對于抗原、抗體的制備，劉兢老師的免疫學(xué)課中會做介紹。在這不作介紹了。第十八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)放射性示蹤技術(shù)

示蹤－即為在研究對象中引入一標(biāo)記物作為探針，通過觀察探針的去向，了解其分布、運(yùn)動及轉(zhuǎn)化的情況。放射性示蹤的基本依據(jù)是：（1）可測性，因為放射性核素總是自發(fā)發(fā)射各種射線。（2）放射性核素與其同種非放射性核素理化性質(zhì)基本相同，一般生物體不區(qū)別對待它們。

放射性示蹤的特點(diǎn)：靈敏度高、操作簡便、合乎生理條件、可解決其他方法不能解決的難題、準(zhǔn)確定位。標(biāo)記化合物來源少、技術(shù)操作要求高、輕元素的同位素效應(yīng)、放射效應(yīng)。第十九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五例：檸檬酸HO—C—COOHH2C—C*OOHH2C—COOH

酶

2HC—C*OOHH—C—HH2C—COOHOα—酮戊二酸KMnO4C—OHH2C—COOHH—C—HO+C*O2＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ琥珀酸檸檬酸脫羧機(jī)制的確定

第二十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五示蹤實(shí)驗的設(shè)計及步驟：

1、根據(jù)實(shí)驗?zāi)康暮蛯?shí)驗周期長短，選擇合適的放射性核素及其標(biāo)記化合物。

(1)

合適放射性核素的選擇,(2)合適標(biāo)記化合物的選擇：2、示蹤劑的用量，根據(jù)實(shí)驗周期長短，示蹤劑的給予方式的不同（如：喂養(yǎng)、靜脈注射、呼吸等）,被示蹤生物對示蹤劑的利用率和在體內(nèi)分布及排泄情況，確定。3、選擇合適的輻射防護(hù)條件和廢物處理方法,對于操作復(fù)雜的實(shí)驗，需先做空白實(shí)驗。4、根據(jù)實(shí)驗的要求及示蹤劑射線類型，選擇合適的樣品測量方法。（包括：定量測量、定位測量、定性測量〕5、對放射性測量結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并根據(jù)實(shí)驗要求計算、書寫出一定的數(shù)據(jù)形式。

第二十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五放射性核素稀釋分析法（放射性核素稀釋法又稱為載體法或俘獲技術(shù)）。

此分析法的特點(diǎn)：可以對含有多種性質(zhì)相近成分的混合物中某一化合物進(jìn)行定量分析。

正稀釋法：分析計算混合物中某一化合物的含量（ＷＸ）。具體方法如下：（1）在混合物中加入一定量（Ｗ０）的已知放射性比活度（Ｓ０）的與待測化合物相同的放射性核素或標(biāo)記化合物；（2）充分均勻混合；（3）分離純化待測化合物，直至恒定比活度（Ｓ）；

根據(jù)放射性被加入混合物前后，雖比活度發(fā)生了變化，但放射性總強(qiáng)度沒變，可由下列方程式成立。反稀釋法：分析計算混合物中某一放射性標(biāo)記化合物的含量（ＷＸ）。具體方法如下：（1）取一定量的待測混合物進(jìn)行分離純化，直至恒定放射性比活度，探測器測得該活度為Ｓ０；（2）在混合物中加入大量的與待測標(biāo)記化合物相同的非標(biāo)記化合物，已知加入量為Ｗ０；（3）充分混合，并分離純化，直至恒定放射性比活度，探測器測得該活度為Ｓ；同理，有下列方程成立。第二十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五放射性探針的制備雙鏈探針的合成法:單鏈探針的合成法:切口平移法用隨機(jī)寡核苷酸引物合成均一標(biāo)記的DNA探針合成可與克隆于噬菌體或M13噬菌體載體上的序列互補(bǔ)的放射性標(biāo)記DNA。將克隆于特定載體上的靶序列轉(zhuǎn)錄成放射性的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶識別的sp6啟動子。第二十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五切口平移法混合下列成分:10×切口平移緩沖液2.5ul；ＤＮＡ模板0.5ug；未標(biāo)記的三種20nmol/L的dNTP各１ul；一種α－３２Ｐ－dNTP１ul；加水至終體積為21.5ul，使混合液驟冷至０Ｃ。加入2.5ul胰ＤＮＡ酶Ⅰ(10mg/ml，用1×切口平移緩沖液配制〕，振蕩均勻。加入E.coilDNA聚合酶2.5單位16℃溫育60min加入25ul100mmol/LEDTA終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物上柱（SephadexG50)，用ＴＥ緩沖液洗脫，分管收集，測cpm值，合并第一個cpm峰（探針〕，第二個cpm峰為α－３２Ｐ－dNTP。標(biāo)記水平的計算：32P-dNTP利用率＝*DNA(dpm/g)=DNA重量第一個峰總計數(shù)(cpm)－本底探測器的探測效率第一個峰總計數(shù)－本底(cpm)第一,第二峰總計數(shù)（cpm)×100%3，OH缺口（胰DNA酶I作用）

缺口向3，端移動大腸桿菌DNA聚合酶I5，-3，聚合酶活性第二十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五用隨機(jī)寡核苷酸引物合成均一標(biāo)記的DNA探針首先需要純化所需制備探針的目的DNA（200ug）并與過量的隨機(jī)引物（75ug）混合將混合液沒入沸水中煮3min。

到時取出后，迅速沒入冰水中1min。

取出，并移入已配置好的（如下）混合液中。（20mmol/LDTT1ul;dGTP,dCTP,dTTP的混合液，濃度各5mmol/L1ul;10×RP緩沖液0.67ul;α-32P-dATP（比活度>3000Ci/mmol）3ul;H2O1ul)加5各單位（約1ul）的大腸桿菌聚合酶IKlenow片段，混合

室溫下溫育至少3小時。

在反應(yīng)液中加入10ulA緩沖液。

隨機(jī)引物可由以下三種途徑得到：1、用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鮭精DNA產(chǎn)生大量長為6—12核苷酸的單鏈DNA。2、直接從一些廠家購買用小牛胸腺DNA制備的隨機(jī)引物。3、在自動DNA合成儀上合成，這種合成引物也可在公司買到。第二十五頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五單鏈探針的制備

由DNA模板體外制備單鏈探針有以下兩種方法：（1）合成可與克隆于噬菌體或M13噬菌體載體上的靶序列互補(bǔ)的放射性標(biāo)記DNA。（2）將克隆于特定載體上的靶序列轉(zhuǎn)錄成放射性的RNA，在此載體上帶有可被噬菌體依賴于DNA的RNA聚合酶識別的啟動子。這兩種方法都可以產(chǎn)生比活度極高且長度固定的探針。但第一種方法需用物理手段把新合成的放射性標(biāo)記DNA與互補(bǔ)的未標(biāo)記模板分開（例如：根據(jù)片段大小選用變性聚丙烯酰胺凝膠或堿性瓊脂糖凝膠電泳、堿性柱層吸等）。而第二種方法中，DNA模板更容易用不含RNA酶的DNA酶I除去。也可以以RNA為模板制備單鏈探針。這時合成cDNA的引物可以用寡脫氧胸苷酸（oligo(dT)）或隨機(jī)序列的寡核苷酸。cDNA探針合成的主要思路：1、選擇適當(dāng)?shù)囊铩?、選擇適當(dāng)?shù)腞NA模板。3、在有dNTP（其中一種是放射性dNTP*）存在下，利用依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）催化合成cDNA*放射性探針。第二十六頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五以寡核苷酸作為引物合成與單鏈RNA互補(bǔ)的總cDNA探針為例在1無菌的EP管中+3ul（無RNA酶）水+1ugRNA模板，混勻。

70℃加熱5分鐘，并馬上放在冰上驟冷。加入：胎盤RNA酶抑制物20單位；引物（2.5mg/ml）（隨機(jī)序列的八核苷酸）5ul。10×隨機(jī)引物緩沖液2.5ul；dGTP,dTTP,dATP各20mmol/L的混合液1ul；120umol/L.

120umol/L.dCTP-α-32P(比活度>3000Ci/mmol)10ul；Moloney鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶（200000單位/毫升）0.5ul；加水至25ul,輕搖混勻。37℃溫育1小時。

加入0.5mol/LNaOH,68℃溫育30min,水解RNA。

待溶液溫度降到室溫后，加入10ul1mol/LTris.Cl(PH7.4),再加入3ul2mol/LHCl。

通過酚氯仿抽提純化cDNA*分離cDNA*

和dCTP*（可用SephadexG50,也可用乙醇選擇性沉淀）。cDNA*產(chǎn)率的測定：取三張Whatman圓濾紙，剪成能放進(jìn)液閃瓶大小。

CA、B用5%三氯醋酸，0.5%焦磷酸鈉抽洗兩次，再用95%乙醇10ml抽洗，涼干。（為了除去dCTP*）。將A、B、吹干，測計數(shù)。A、空白對照（本底）B、cDNA*計數(shù)（cpm/ul）C、cDNA*+dCTP*計數(shù)（cpm/ul）

AA在中心滴1ul反應(yīng)前溶液BB在中心滴1ul反應(yīng)后溶液C在中心滴1ul反應(yīng)后溶液cDNA*

合成量（ug）=（B-A）/C×dNTP(四種）質(zhì)量(ng)

第二十七頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五電泳—帶電物質(zhì)在電場中向其相反電極泳動的現(xiàn)象稱為電泳。第二十八頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五DNA的泳動率與MW的關(guān)系第二十九頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三十一頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三十二頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三十三頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五第三十四頁，共三十七頁，編輯于2023年，星期五

分子雜交