第六章聚合酶鏈反應技術

第六章聚合酶鏈反應技術第一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五提要聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR）技術是生物技術領域中最重要的四項生物技術（即細胞融合技術、分子克隆術、蛋白工程技術和基因擴增技術）之一。由于通過體外（試管內(nèi)）擴增，可以將目的基因（或靶基因）片段百萬倍的放大，從而達到極大地提高核酸分子檢測的靈敏度，理論上其檢測的靈敏度可以達到一個細胞、甚至一個分子的水平。第二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五本章內(nèi)容第一節(jié)聚合酶鏈反應技術的原理第二節(jié)聚合酶鏈反應技術的常見問題及體系優(yōu)化第三節(jié)聚合酶鏈反應技術的方法發(fā)展及相關技術第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應技術第五節(jié)聚合酶鏈反應方法的標準化第三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五第一節(jié)聚合酶鏈反應技術的原理第四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一.聚合酶鏈反應技術的簡史二.聚合酶鏈反應技術的原理PCR技術實際上是在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應。PCR由變性－退火－延伸三個基本反應步驟構成。第五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五模板DNA94℃變性55℃退火72℃引物延伸第二次循環(huán)模板變性退火延伸經(jīng)25-30次循環(huán)，目的DNA增加106-7圖6-1PCR原理示意圖第六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五以上為一個循環(huán)。在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步,模板DNA數(shù)量翻一倍(假設擴增效率為100%)。如此反復循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進行擴增。每完成一個循環(huán)需2~4min，2~3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。第七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五nyny圖6-2-1

圖6-2-2圖6-2PCR擴增效率圖第八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五

三.PCR反應體系PCR反應五要素：（一）模板（template）（二）引物（primers）引物設計一般需考慮以下因素：1．引物長度2．分布的均衡性3．引物二聚體及二級結構4．引物3′端5.引物的特異性6．擴增區(qū)域的二級結構第九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（三）DNA聚合酶（DNApolymerase）（四）dNTP（五）PCR緩沖液（PCRbuffer）第十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（六）PCR一般方案1．50ulPCR反應體系的組成1）組成：①樣品DNA0.1~1ug；②正鏈引物（25umol/L）1.0ul；③負鏈引物（25umol/L）1.0ul；④脫氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；⑤10×PCR緩沖液5.0ul；⑥MgCl2（25mmol/L）3.0ul；⑦TaqDNA聚合酶1~2.5u；⑧蒸餾的去離子水補至50ul。加入30ul石蠟油，短暫離心混勻。2）對照：陽性對照、空白對照分別以陽性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。第十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2．PCR儀工作參數(shù)的設置94℃30~60sec，55℃30~60sec，72℃30~60sec，循環(huán)30次，最后72℃延伸5min。3．PCR產(chǎn)物的保存與檢測PCR產(chǎn)物于4℃保存，PCR產(chǎn)物檢測。第十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五四.PCR擴增產(chǎn)物的檢測方法(一)凝膠電泳1．瓊脂糖凝膠電泳法瓊脂糖凝膠電泳法的操作方法簡單，能對PCR產(chǎn)物的長度進行粗略的鑒定，是應用最廣泛的檢測PCR產(chǎn)物的方法。不同濃度的凝膠分辨DNA的有效范圍不同，如表6.1所示：2．聚丙烯酰胺凝膠電泳法表6.2丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍第十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五表6.1瓊脂糖濃度與分離線狀DNA的有效范圍

瓊脂糖含量(%)分離線狀DNA的有效范圍(kb)

0.51-300.70.8-121.00.5-101.20.4-71.50.2-32.00.1-2第十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五表6.2丙烯酰胺濃度與分離DNA分子的有效范圍丙烯酰胺(%)

有效分離范圍(bp)溴酚藍位置(bp)二甲苯藍位置(bp)3.51000-20001004605.080-500652608.060-4004510012.040-200207015.025-150156020.05-1001245第十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五(二)PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析法（polymerasechainreactionbasedonrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸內(nèi)切酶有具識別的特異DNA序列，所以用特定的限制性核酸內(nèi)切酶對目的DNA分子進行消化，得到的酶切片段其大小和數(shù)量可以在一定程度上反應出目的DNA分子的序列信息。(三)核酸探針雜交法1．點雜交（dotblot）2．反向點雜交（reversedotblot）

3．微孔板雜交（microplatehybridization）4．PCR-EIA：（RNAprobehybridizationenzymeimmunoassay,RPEIA）5．Southern印跡雜交（Southernblot）第十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五(四)PCR-ELISA引物采用雙標記，通過修飾其中一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基團(如生物素)，而通過另一引物的5′端的修飾使產(chǎn)物便于檢測，（如地高辛、熒光素等）。本法避免了電泳和雜交的步驟，適用于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。(五)單鏈構型多態(tài)性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism，簡稱PCR-SSCP）本法就是將PCR產(chǎn)物雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），加樣于變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，由于DNA分子在凝膠中的電泳遷移率與其分子量和空間結構有關，而空間結構又與ssDNA序列有關。因此，電泳結束后，ssDNA帶位置的差異即可反映出PCR產(chǎn)物序列的差異。第十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五㈥PCR-OLA法已弄清的遺傳病的基因變異中，絕大部分屬于堿基替換，因此，基因檢測技術的一個重要要求就是能很容易檢出單一核苷酸變異。寡核苷酸連接試驗（OLA）就是為此目的而設計的。(七)PCR產(chǎn)物測序?qū)CR產(chǎn)物進行測序是檢測PCR產(chǎn)物特異性最可靠的方法，可將PCR產(chǎn)物克隆到載體上進行測序，也可對直接PCR產(chǎn)物進行測序。測序常用的方法為雙脫氧核苷酸鏈末端終止法和化學裂解法。第十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)聚合酶鏈反應技術的常見問題及體系優(yōu)化第十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一.常見問題及其分析1．假陽性①PCR產(chǎn)物是最主要的污染源。②含有靶DNA序列的質(zhì)粒的污染。③陽性對照的污染。④標本之間的交叉污染。⑤在采集標本時，其他污染源帶來的污染。⑥Taq聚合酶中帶有細菌DNA，當PCR擴增片段為保守的rRNA序列時，易造成假陽性。第二十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2．假陰性假陰性是PCR反應中另一個易出現(xiàn)的問題。造成的原因也比較多。可以歸納以下幾方面原因。(1)標本處理的原因。①處理標本時，靶DNA丟失。②處理標本時，雜質(zhì)成分沒有去除干凈，帶入PCR反應中抑制了Taq酶活性。③標本放置不當，模板發(fā)生降解（尤其是RNA）。第二十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五(2)PCR試劑問題。①TaqDNA聚合酶失活。②Mg2+濃度過低或是沒有加。(3)PCR擴增過程中的問題①PCR擴增儀故障。②PCR擴增反應液沒有加液體石蠟油。(4)PCR產(chǎn)物鑒定中的問題①電泳時沒有加溴化乙錠。②電泳緩沖液和凝膠使用次數(shù)過多。③凝膠濃度過低，使擴增帶跑散。第二十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3．引物二聚體形成引物二聚體的原因有：⑴兩個相同的或不同的引物分子之間有較多的堿基配對，特別是引物3′端有互補區(qū)。⑵引物模板比例太高，可增加模板用量。⑶退火溫度過低。⑷熱循環(huán)次數(shù)過多。第二十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五4．非特異性PCR產(chǎn)物1)造成非特異性PCR產(chǎn)物的常見原因及其預防措施2）提高PCR反應特異性的辦法5．PCR污染及預防措施6．RT-PCR中避免RNA酶（RNase）的污染（1）去除外源RNase污染（2）抑制內(nèi)源性RNase的活性第二十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五二.PCR反應體系的優(yōu)化1．模板核酸2．引物PCR擴增產(chǎn)物的大小是由特異引物限定的，因此引物的設計與合成對PCR的成功與否有著決定性的意義。3．緩沖液4．Mg2+Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，也影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，則酶催化非特異的擴增。5．三磷酸脫氧核苷酸6．耐熱DNA聚合酶酶的需要量可根據(jù)不同的模板分子或引物而變化。當優(yōu)化PCR時，最好在每100μ1反應體積中加入0.5~5U酶的范圍內(nèi)試驗最佳酶濃度。如果酶濃度太高，則瓊脂糖凝膠電泳中會出現(xiàn)非特異擴增帶；過低時，則靶序列產(chǎn)量很低。第二十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五7．溫度循環(huán)參數(shù)（1）變性溫度與時間（2）復性溫度與時間（3）延伸溫度與時間（4）循環(huán)數(shù)和擴增效率：循環(huán)數(shù)決定著擴增程度。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列的初始濃度。起始模板DNA分子數(shù)與達到足量產(chǎn)物的熱循環(huán)次數(shù)如表6.3所示。第二十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五表6.3起始模板數(shù)量與足量產(chǎn)物的熱循環(huán)次數(shù)起始模板DNA分子數(shù)循環(huán)次數(shù)5040-451.0×10335-401.5×10430-353.0×105

25-30第二十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（5）其它因素1）剃度PCR（TDPCR

Touch-downPCR）根據(jù)引物Tm值，選定一個退火溫度范圍（跨越10~20℃的溫度范圍，引物Tm值在這個范圍之內(nèi)）。在設置循環(huán)參數(shù)時，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1~5℃），最后結束在選定范圍的最低溫度。在每一個退火溫度上循環(huán)2~5次。2）熱啟動PCR（hotstartPCR）由于TaqDNA聚合酶在低溫時仍有一定的聚合酶活性，第一輪PCR反應前的升溫過程中會出現(xiàn)非特異產(chǎn)物，而降低了PCR反應的特異性?？梢酝ㄟ^所謂的“熱啟動”方式克服這一問題。第二十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)聚合酶鏈反應技術的方法發(fā)展及相關技術第二十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一.PCR技術的發(fā)展（一）巢式PCR（nestedPCR）巢式PCR是用兩對引物，一對引物序列在模板的外側，另一對引物序列在模板內(nèi)側（相對于第一對引物）。第一對引物做PCR的擴增產(chǎn)物作為第二對引物退火的模板，再做PCR。這樣經(jīng)過兩次PCR放大，靈敏度得以提高。由于使用兩對引物與模板結合，第一對引物的非特異擴增往往不可能作為第二對引物的模板，而只有特異性擴增才能作為第二對引物的模板，從而大大提高PCR的特異性。第三十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五圖6-3巢式PCR原理示意圖外引物1外引物2內(nèi)引物1內(nèi)引物2第一次PCR第二次PCR第三十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）逆轉錄PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）檢測RNA病毒、細胞因子mRNA時，一般不能以RNA為模板直接擴增，應用逆轉錄PCR方法對RNA進行分析可以使敏感性提高幾個數(shù)量級。原理是先將RNA用逆轉錄酶逆轉錄成cDNA，然后再加入特異引物對目標片段進行擴增，擴增產(chǎn)物的分析與其他常見PCR方法類似。常用的逆轉錄酶有AMV逆轉錄酶（最適溫度為42℃）和MoMLV逆轉錄酶（最適溫度為37℃），常用的逆轉錄引物有三種：①隨機引物；②Oligo（dT），只適合于3′端帶有poly(A)尾的mRNA；③特異性引物，只適合于逆轉錄目的RNA序列。以逆轉錄產(chǎn)物cDNA為模板，再做PCR。第三十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（三）多重PCR（multiplexPCR）PCR一般由一對引物擴增產(chǎn)生一個核酸片段，以此手段診斷疾病的效率太低。為提高效率，常采用多重PCR技術。該技術是在一個反應體系中加入多對引物，同時擴增出多個核酸片段，由于每對引物擴增的片段長度不同，可用電泳加以鑒別。多重PCR主要用于多種病原微生物的同時檢測或病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定。第三十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（四）重組PCR（recombinantPCR）設計兩對引物a和b，c和d，引物b、c5′端有部分堿基互補，并將突變堿基、插入片段、缺失片段或不相鄰的兩個基因片段的部分堿基設計在引物b和引物c5′端序列中。先分段對模板擴增，即用引物a和b擴增一個片段，用引物c和d擴增另一個片段。除去多余的引物后，將兩對擴增片段混合，由于兩個片段中各有一條鏈3′端有部分堿基互補，它們變性并復性后必然有部分DNA鏈發(fā)生重組，即3′端形成異源部分雙鏈DNA。重組的異源DNA雙鏈可以互為模板互為引物，在DNA聚合酶的作用下進行延伸，得到兩個擴增片段連接起來的完整DNA雙鏈。再以此片段為模板，用引物a和d進行PCR擴增，即可得到大量的重組DNA片段。第三十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五引物a引物c引物b引物d5'3'PCR混合，變性和復性延伸異源部分雙鏈DNA形成5'5'5'5’5'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'3'5'5'5'5'5'5'PCR引物a引物d

再次PCR5'5'3'3'圖6-4重組PCR原理示意圖第三十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（五）錨定PCR（anchoredPCR，APCR）錨定PCR屬于單特異引物PCR方法，用于擴增一側序列已知，而另一側序列未知的核酸片段。其基本原理是：抽提細胞總RNA或mRNA，在逆轉錄酶作用下合成cDNA，通過DNA末端轉移酶在cDNA3′端加上poly（dG）。據(jù)此設計錨定引物poly（dC），為提高擴增特異性，poly（dC）在十二聚以上，錨定引物5′端可加上某些限制性內(nèi)切酶識別序列或其它序列信息。根據(jù)已知的3′端序列設計基因特異性引物，與錨定引物一起進行PCR擴增。第三十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（六）不對稱PCR（asymmetricPCR）在基因分析中，常常需要單鏈DNA，不對稱PCR可產(chǎn)生大量單鏈DNA。其基本原理是：采用兩條不同濃度的引物，即非限制引物（高濃度引物）與限制性引物（低濃度引物），二者之比為50~100:1。在PCR最初10-15個循環(huán)中，擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA（dsDNA）；第15個循環(huán)以后，限制性引物已被耗盡，非限制性引物介導的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ssDNA）。盡管此時單鏈DNA僅以線性速率遞增，但其濃度已能滿足雙脫氧鏈終止法測定DNA序列的要求。第三十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（七）反向PCR（inversePCR）通常，PCR反應是對一對引物之間的序列進行擴增，而反向PCR用于快速擴增已知序列以外的未知DNA片段，從而對未知序進行分析研究。該法首先用已知序列和待擴增序列都沒有切點的限制性核酸內(nèi)切酶將模板DNA消化，再用連接酶使酶切產(chǎn)物環(huán)化，使已知的和待擴增的未知序列都包含在環(huán)中。在已知序列內(nèi)設計一對反向的引物，即可擴增已知序列以外的區(qū)域。第三十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（八）免疫PCR（immunolPCR）免疫PCR是利用抗原抗體反應的特異性和PCR擴增反應的極高靈敏性而建立的一種微量抗原檢測技術。用抗體檢測抗原是免疫學的最基本方法，用酶或同位素標記抗體可使檢測的敏感性提高。在免疫PCR中，連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗體結合，另一個與DNA分子結合。免疫PCR的原理是：免疫PCR主要由兩個部分組成，第一部分的免疫反應類似于普通的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）的測定過程；第二部分即通常的PCR檢測，抗原分子的量最終由PCR產(chǎn)物的多少來反映。第三十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五Ag＋Ab生物素化的DNAAg-Ab復合物DNA-連接分子復合物連接分子檢測PCR＋Ag-Ab-連接分子-DNA-復合物圖6-5免疫PCR原理示意圖第四十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（九）原位PCR（insituPCR）原位PCR技術是PCR技術和原位雜交技術結合的產(chǎn)物，其基本過程是，先用合適的固定劑（通常為甲醛固定劑如中性甲醛）對組織或細胞進行固定，然后用蛋白酶對細胞進行通透處理，以確保PCR試劑進入細胞并同靶序列接觸，最后于Eppendorf管中或載玻片對DNA和RNA進行細胞內(nèi)原位擴增。然后進行產(chǎn)物分析并用顯微鏡觀察結果。第四十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（十）定量PCR（QuantitivePolymeraseChainReaction，QPCR）1．PCR定量DNA用PCR技術來定量DNA較為容易，因為很容易獲得非常精確的標準作為對照。只含一個或兩個拷貝的特定靶序列的細胞株即是標準的一個理想來源，也可使用含特定靶序列的質(zhì)粒DNA作為對照，將待檢樣品與一系列稀釋的標準對照一起擴增，檢測PCR產(chǎn)物，即可推知靶序列的含量。2．PCR定量mRNA(1)mRNA相對定量(2)競爭性PCR定量mRNA(3)cRNA標準曲線法定量mRNA第四十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五二.PCR相關技術（一）核酸序列依賴性擴增（nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA）核酸序列依賴性擴增，又稱自主序列復制（self-sustainedsequencereplication，SSR），主要用于RNA的擴增、檢測及測序。反應體系包括：逆轉錄酶、核酸酶H（RNaseH）、T7RNA聚合酶、dNTP、NTP、兩種特殊的引物（A和B）和緩沖液。引物A5′端帶有T7RNA聚合酶結合位點，3′端堿基與靶RNA3′端序列互補，引物B的堿基序列與cDNA3′端序列互補第四十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA擴增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA圖6-6NASBA原理示意圖第四十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（二）連接酶鏈反應（ligasechainreaction，LCR）

連接酶鏈反應，又稱連接酶擴增反應（ligaseamplificationreaction,LAR），是一種新的DNA體外擴增技術。第四十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3'5'5'3'5'3'5'3'5'3'5'3'引物A引物B引物A'引物B'連接產(chǎn)物5'5'3'3'3'5'圖6-7LCR示意圖第四十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五在分子生物學工作中，常用到PCR產(chǎn)物克隆技術，以便對PCR產(chǎn)物進行進一步研究，如測序、轉錄分析、RNase保護測定等。PCR產(chǎn)物克隆常用的方法有：平端克隆法、粘端克隆法、無連接酶亞克隆法，下面分別作一簡要介紹。三.PCR產(chǎn)物的克隆第四十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五（一）平端克隆法（二）粘端克隆法1.引物5′端引入限制性核酸內(nèi)切酶位點2.T4DNA聚合酶回切產(chǎn)生粘端如圖6-8所示3.T載體（T－vector）法（三）無連接酶亞克隆法（ligase-freesubcloning，LFS）該方法無需使用連接酶，直接用PCR將PCR產(chǎn)物構建到載體上去，故稱無連接酶亞克隆法。如圖5-9所示第四十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五20bp引物25'CGATTTC……CCGGTGC……5'20bp引物1CGATTTC……GCACCGGGCTAAAG……CGTGGCC5'3'3'5'CGATTTC……GCATAAAG……CGTGGCC5'3'3'5'PCR及PCR產(chǎn)物純化在僅有dATP和dTTP存在時，T4DNA聚合酶切除產(chǎn)物3‘端的C和GXmaI粘性末端AccI粘性末端圖6-8T4DNA聚合酶回切產(chǎn)生粘端示意圖第四十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'5'3'5'3'3'5'5'3'3'5'3'5'5'3'3'5'5'3'3'5'5'3'引物a引物bPCR異源部分雙鏈DNA的形成A管B管PCR(循環(huán)1)引物a

引物c引物d引物bPCR(循環(huán)2-15)混合AB兩管，變性和復性環(huán)化轉化大腸桿菌圖6-9無連接酶亞克隆法示意圖第五十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五第四節(jié)熒光定量聚合酶鏈反應技術第五十一頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五熒光定量PCR（FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReactionFQ-PCR）基于熒光能量傳遞技術（FluorescenceresonanceenergytransferFRET）,通過受體發(fā)色團之間偶極-偶極相互作用,能量從供體發(fā)色團轉移到受體發(fā)色團,轉移效率與兩個發(fā)色團之間距離的6次冪倒數(shù)成比例，受體熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測PCR過程的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度。在PCR反應體系中，F(xiàn)Q-PCR的熒光標記物可分為兩種：熒光染料標記和熒光探針標記。第五十二頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五一.熒光染料法SYBR熒光染料SYBR熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈，發(fā)出熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法未使用目的特異性探針，其特異性完全由引物決定。在有非特異雙鏈DNA產(chǎn)生時，其熒光也同樣增強，此法與常規(guī)PCR的特異性差別不大。第五十三頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五圖6-10SYBR-GreenI熒光染料原理示意圖5’3’激發(fā)5’3’SG發(fā)射SGSGSGSG5’3’5’3’激發(fā)SGSGSG發(fā)射SGSG不摻入雙鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)出任何熒光信號SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈,發(fā)出熒光信號第五十四頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五1．Taqman技術

Taqman技術的延伸在Taqman探針的基礎上，出現(xiàn)了一系列的技術進展。雙探針技術的特點是將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針。雜交時兩探針的熒光分子和淬滅分子緊密相鄰，從而發(fā)生FRET使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成正比，以此可進行PCR定量分析。最近廣泛應用的另外一個新技術就是TaqMan-小溝結合物（minorgroovebinder，MGB）探針。二.熒光探針法第五十五頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五圖6-11TaqMan技術原理示意圖3’端的熒光Q分子吸收5’端熒光R分子的熒光信號

探針5’端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來

熒光R分子發(fā)出熒光,切割的熒光分子數(shù)與PCR數(shù)量成比例5’3’5’3’QRQ5’3’R5’3’激發(fā)5’3’5’3’激發(fā)RQ引物Taq酶第五十六頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五圖6-12雙探針技術原理示意圖熒光淬滅的程度與起始模板數(shù)的量成正比RQXQ淬滅探針R發(fā)光探針第五十七頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五圖6-13TaqMan-MGB探針示意圖MGB:MinorGrooveBinder(Tmenhancer)MGBQR第五十八頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五2．Molecularbeacon技術Molecularbeacon技術亦稱分子燈塔法，分子燈塔是一段熒光標記的單鏈寡核苷酸探針，其鏈由兩部分組成，一部分是能與靶基因堿基序列互補的寡核苷酸序列，是檢測靶基因的部分，位于探針的中間位置,探針形成后構成探針的環(huán)部，另一部分是分別在5′和3′端的熒光標記物質(zhì)和熒光淬滅劑。5′和3′端有幾個互補的堿基存在，因而可形成兩端反轉配對，構成探針的莖部。在游離狀態(tài)下，分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結構,使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導致熒光淬滅，此時莖環(huán)結構的分子燈塔發(fā)出的熒光檢測不到。第五十九頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五RQX激發(fā)RQQR激發(fā)發(fā)射分子燈塔形成莖環(huán)發(fā)夾結構,使熒光劑和淬滅劑緊密接觸,導致熒光淬滅單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補而與之雜交探針5’和3’端分離,淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失,產(chǎn)生熒光圖6-14Molecularbeacon技術原理示意圖第六十頁，共六十八頁，編輯于2023年，星期五3．復合探針法（complexprobes）該法的基本原理是首先合成兩個探針，一是熒光探針（25bp），5′端接一熒光分子，另一為淬滅探針（15bp），3′端接一淬滅分子，淬滅探針能與熒光探針5′端雜交。當兩探針結合時，熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸收，溶液中沒有熒光產(chǎn)生，但兩探針分離時，熒光探針發(fā)出