酶分子定向進(jìn)化

酶分子定向進(jìn)化第一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五天然酶的應(yīng)用及局限性

酶的定向進(jìn)化的思想

酶的定向進(jìn)化的策略和方法

酶的定向進(jìn)化技術(shù)的展望

第二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五生物體系之所以能夠相對獨立地存在于自然界中,并維持其獨立性和生命的延續(xù)性,都是因為生物體內(nèi)的一系列酶在發(fā)揮著作用.

酶保證了生物體內(nèi)組成生命活動的大量生化反應(yīng)得以按照預(yù)定的方向有序,精確而順利地進(jìn)行,幾乎所有生物的生理現(xiàn)象都與酶的作用緊密相關(guān),可以這樣說,沒有酶的存在,就沒有生物體的一切生命活動.

第三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五

天然酶的局限性

隨著酶催化應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大和研究的逐步深入,研究者發(fā)現(xiàn),酶催化的精確性和有效性常常不能很好地滿足酶學(xué)研究和工業(yè)化應(yīng)用的要求,而且天然酶的穩(wěn)定性差,活性低使催化效率很低,還缺乏有商業(yè)價值的催化功能

天然酶的局限性源于酶的自然進(jìn)化過程.

第四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五現(xiàn)代生物工程對酶的要求

能具備長期穩(wěn)定性和活性

能適用于水及非水相環(huán)境

能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物

進(jìn)一步增強酶對多種底物的分解能力如何利用相對簡單的方法以達(dá)到對天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶就顯得非常有研究意義和應(yīng)用前景.

第五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五1993年,美國科學(xué)家ArnoldFH首先提出酶分子的定向進(jìn)化的概念,并用于天然酶的改造或構(gòu)建新的非天然酶.

第六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五定向進(jìn)化定向進(jìn)化是模擬自然進(jìn)化的過程，進(jìn)行人工隨機突變，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇，使進(jìn)化朝著人們所需要的方向發(fā)展的技術(shù)過程。分為分子定向進(jìn)化和細(xì)胞定向進(jìn)化第七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五細(xì)胞定向進(jìn)化細(xì)胞定向進(jìn)化是在細(xì)胞水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過程，以各種細(xì)胞為進(jìn)化對象，目的是改良細(xì)胞的各種特征，主要包括微生物細(xì)胞的定向進(jìn)化、動物細(xì)胞的定向進(jìn)化、植物細(xì)胞的定向進(jìn)化等。隨機突變方法有全基因組重排技術(shù)。基因組重排技術(shù)通過把誘變與細(xì)胞融合技術(shù)相結(jié)合，對細(xì)胞進(jìn)行基因組重排，從而大幅度增加細(xì)胞的正突變頻率。第八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五分子定向進(jìn)化分子定向進(jìn)化是在分子水平上進(jìn)行定向進(jìn)化的過程。分子定向進(jìn)化首先要通過從細(xì)胞內(nèi)提取或者通過PCR等方法獲得目標(biāo)分子的基因，在體外采用易錯PCR、ＤＮＡ重排、基因家族重排等技術(shù)進(jìn)行人工突變，然后進(jìn)行定向選擇而獲得所需突變體。第九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五酶分子定向進(jìn)化簡稱酶定向進(jìn)化，是模擬自然進(jìn)化過程（隨機突變和自然選擇），在體外進(jìn)行酶基因的人工隨機突變，建立突變基因文庫，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定向選擇得到具有優(yōu)良催化特征的酶的突變體的技術(shù)過程。第十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五酶定向進(jìn)化的基本過程隨機突變、構(gòu)建突變基因文庫、定向選擇酶定向進(jìn)化的基本過程：酶基因隨機突變構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶反復(fù)進(jìn)行第十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五隨機突變的策略

易錯PCR技術(shù)(error-pronePCR)

DNA改組(DNAshuflling):由美國Stemmer于1994年首次提出一項體外重組技術(shù)

隨機引發(fā)重組(RPR)1998年,Arnold提出了一種有效的新方法

交錯延伸技術(shù)(StEP):由Zhao等提出,是一種簡化的DNAshuffling技術(shù)基因家族重排技術(shù)

第十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五酶定向進(jìn)化的特點1適應(yīng)面廣2目的性強3效果顯著第十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五第二節(jié)酶基因的隨機突變體外隨機突變的方法：PCR技術(shù)、DNA重排技術(shù)、基因家族重排技術(shù)基因隨機突變方法的特點P207表8－1隨機突變方法可以聯(lián)合使用，交叉進(jìn)行，通過多次試驗，反復(fù)篩選，以完成對酶的定向進(jìn)化。第十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五一易錯PCR技術(shù)在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過改變反應(yīng)條件，增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率，就成為易錯PCR技術(shù)?？梢酝ㄟ^提高鎂離子濃度、添加一定濃度的錳離子、改變4種底物（dAMP、dTMP、dCMP、dGMP）的濃度比等反應(yīng)條件，使DNA聚合酶在催化基因擴(kuò)增時，增加堿基配對錯誤的出現(xiàn)頻率，而引起基因突變。第十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五特點正突變的概率低，突變基因文庫較大，文庫篩選的工作量大，一般適用于較小基因的定向進(jìn)化。第十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五二DNA重排技術(shù)概念：又稱為DNA改組技術(shù)，是從正突變基因文庫中分離得到的同源DNA，用酶切割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。第十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五DNA重排技術(shù)的基本過程兩條以上正突變基因DNA隨機片斷突變基因構(gòu)建突變基因文庫篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶酶切（反復(fù)進(jìn)行）無引物PCR基因重組酶切第十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五DNA重排技術(shù)將兩條或多條正突變基因通過脫氧核糖核算酶Ⅰ（DNaseⅠ)等酶的作用，隨機切割成若干DNA片斷，然后將這些隨機片斷在不加引物的條件下經(jīng)過多次PCR循環(huán)，使這些DNA隨機片斷互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增、延伸，再加入適宜的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得全長基因。這些全長基因由于是在不加引物的條件下由DNA隨機片斷互為模板和引物擴(kuò)增而成的，其堿基序列經(jīng)過重新排布而形成眾多的突變基因。第十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五1）交錯延伸PCR技術(shù)：在同一個反應(yīng)體系中以兩個或多個相關(guān)的DNA片斷為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，把PCR反應(yīng)中常規(guī)的退火和延伸合并為一步，并且大大縮短了反應(yīng)時間（55℃，5s)。在反應(yīng)過程中，引物先與一個模板結(jié)合，進(jìn)行延伸，隨之進(jìn)行多次變性和短時的退火－－延伸反應(yīng)循環(huán)，在每個循環(huán)中，不同長度的延伸片斷在變性時與原先的模板分開，退火時與另一個模板結(jié)合，再進(jìn)行延伸。通過在不同的模板上交替延伸，所合成的DNA片斷中包含有不同模板上的信息，直到獲得全長的突變基因為止。第二十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五2）隨機引物體外重組技術(shù)采用單鏈DNA為模板，配合若干條隨機序列的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，產(chǎn)生若干個與模板不同部分的序列互補DNA小片斷，然后除去模板，這些DNA小片斷互為模板和引物進(jìn)行擴(kuò)增，通過堿基序列的重新排布而獲得全長突變基因。第二十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五三基因家族重排技術(shù)概念又稱為基因家族改組技術(shù)，是從基因家族的若干同源基因出發(fā)，用酶(DNaseⅠ)切割成隨機片斷，經(jīng)過不加引物的多次PCR循環(huán)，使DNA的堿基序列發(fā)生重新排布而引起基因突變的技術(shù)過程。第二十二頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五基因家族重排技術(shù)的基本過程基因家族若干同源基因酶切DNA隨機片斷突變基因突變基因文庫基因重組篩選負(fù)突變基因正突變基因進(jìn)化酶無引物PCR酶切反復(fù)進(jìn)行第二十三頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的異同點相同點：DNA家族重排技術(shù)與DNA重排技術(shù)的過程大致相同，都要經(jīng)過基因的隨機切割、無引物PCR等步驟以獲得突變基因，然后經(jīng)過構(gòu)建突變基因文庫、采用高通量篩選技術(shù)篩選獲得正突變基因。不同點：DNA家族重排技術(shù)從基因家族的若干同源基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布，而后者則從采用易錯PCR等技術(shù)所獲得的兩個以上的正突變基因出發(fā)進(jìn)行DNA序列的重新排布。第二十四頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五第三節(jié)酶突變基因的定向選擇突變基因的定向選擇基本過程突變基因基因載體突變基因文庫基因重組篩選目的基因第二十五頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五一酶突變基因文庫的構(gòu)建（一）構(gòu)建基因文庫的質(zhì)量要求1文庫的包容性:指構(gòu)建的文庫必須盡可能地包含基因的任何一種可能的突變信息。2文庫的完整性：指文庫中包含的DNA片斷必須盡可能完整地反應(yīng)基因的結(jié)構(gòu)和功能信息，以便通過篩選得到的突變基因能夠通過表達(dá)獲得完整的具有催化功能的進(jìn)化酶。第二十六頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五（二）構(gòu)建突變基因文庫的主要過程載體的選擇1）質(zhì)粒載體：微生物細(xì)胞染色體外，閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子。2）噬菌體DNA載體：由噬菌體DNA改造而成的具有自我復(fù)制能力的載體。3）黏粒載體：是一類人工構(gòu)建的含有λDNA黏性末端和質(zhì)粒復(fù)制子的質(zhì)粒載體，又稱為柯斯質(zhì)粒。4）噬菌粒載體：是一類人工構(gòu)建的由M13噬菌體單鏈DNA的基因間隔區(qū)與質(zhì)粒載體結(jié)合而成的基因載體。第二十七頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五基因重組

在體外通過DNA連接酶的作用，將基因與載體連接在一起形成重組DNA的技術(shù)過程。黏性末端連接平頭末端連接修飾末端連接第二十八頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五形成基因文庫將重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞或包裝成有感染活性的噬菌體的過程。重組質(zhì)粒載體：轉(zhuǎn)化重組噬菌體DNA載體：需要用噬菌體外殼蛋白將重組DNA進(jìn)行包裝，稱為有感染活性的重組噬菌體，而形成基因文庫。第二十九頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五二突變基因的篩選（一）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定（1）提高酶的穩(wěn)定性，高溫篩選重組細(xì)胞，每一次突變－篩選的循環(huán)中逐步提高重組細(xì)胞的培養(yǎng)溫度。（2）如果定向進(jìn)化的目的是提高β－內(nèi)酰胺酶的活性，從而提高對β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的耐受性，可以通過在含有一定濃度的β－內(nèi)酰胺酶類抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組細(xì)胞，并在每一次突變－篩選循環(huán)中逐步提高抗生素的濃度。（二）高通量篩選技術(shù)P217表8－2第三十頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五一平板篩選法平板篩選法所依據(jù)的重組細(xì)胞的表型包括細(xì)胞生長情況、顏色變化情況、透明圈情況。1）依據(jù)細(xì)胞生長情況篩選突變基因在提高酶的熱穩(wěn)定性、抗生素耐受性、pH穩(wěn)定性和對其他極端環(huán)境條件的耐受能力等方面有廣泛應(yīng)用。第三十一頁，共三十四頁，編輯于2023年，星期五2）依據(jù)顏色變化篩選突變基因（1）在采用噬菌體DNA載體構(gòu)建突變基因文庫時，可以用大腸桿菌β－半乳糖苷酶的基因片斷（lacZ′）插入到噬菌體DNA的間隔區(qū)域中，當(dāng)它感染了相應(yīng)的大腸桿菌宿主細(xì)胞時，在含有IPTG和底物X－gal的平板培養(yǎng)基上可以形成藍(lán)色噬菌斑。（2）在對磷酸酯酶進(jìn)行定向進(jìn)化的過程中，可以在平板培養(yǎng)基中加入硝基酚磷酸，接種重組細(xì)胞