流式細(xì)胞術(shù)在臨床和科研中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)（FLOWCYTOMETRY）是利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞或其它顆粒性物質(zhì)的物理、化學(xué)特性。它借鑒了熒光顯微鏡技術(shù)與血球計數(shù)原理,同時利用熒光染料,激光技術(shù),單抗技術(shù)以及計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展,大大提高了檢測速度與統(tǒng)計精確性,而且從同一個細(xì)胞中可以同時測得多種參數(shù),為生物醫(yī)學(xué)與臨床檢驗學(xué)發(fā)展提供了一個全新的視角和強(qiáng)有力的手段。

FCM在生命科學(xué)中的應(yīng)用,標(biāo)志著細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等進(jìn)入了細(xì)胞和分子水平的研究。為從微觀認(rèn)識細(xì)胞及橫向比較特征提供了精密、準(zhǔn)確的方法和儀器.

流式細(xì)胞術(shù)EPICSXL流式細(xì)胞分析儀FC500常用熒光染料的特性熒光染料激發(fā)波長(nm)發(fā)射波長(nm)用途顏色FITC488525免疫熒光綠色PE(RD1)488575免疫熒光橙色ECD488620免疫熒光橙紅PeCy5488675免疫熒光紅PI488620DNA染色橙紅PECy7488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670免疫熒光紅TO488 525RNA染色綠DualParameterHistograms應(yīng)用分類1、免疫表型分析2、DNA含量及細(xì)胞周期分析3、定量分析4、細(xì)胞功能分析5、凋亡研究6、其它方面免疫表型分析1993年在波士頓召開的人類白細(xì)胞分化抗原會議（leukocytedifferentiationantigen,HLDA）將CD抗原(clusterofdifferentiation)分為T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、活化抗原、黏附因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體等九個組，確立了48種新抗原。1996年11月在神戶召開的第六屆HLDA會議上，又有30多種新抗原被確認(rèn)，CD編號已達(dá)166個，CD抗原有197種。2000年7月，第七屆人類白細(xì)胞分化抗原會議的召開，CD抗原已達(dá)247種。生物學(xué)我們想做什么?細(xì)胞群–淋巴細(xì)胞,單核細(xì)胞,粒細(xì)胞,血小板,etc.抗原組合多少?共表達(dá)?表達(dá)密度?抗原分布表面胞內(nèi)CD3CD8需要用多少的標(biāo)志來確證感興趣的細(xì)胞群?它們在細(xì)胞上的分布是不是很近?它們是構(gòu)成性表達(dá)和調(diào)節(jié)性表達(dá)?它們是否在不同的細(xì)胞上表達(dá)不同?他們表達(dá)強(qiáng)還是弱?抗原表達(dá):

ImportantforoptimalconfigurationCD3CD4CD3CD8抗原分布:

Importantformethodoptimization表面,胞漿,核內(nèi)是共同檢測還是分別檢測?表面胞漿核內(nèi)CD3,CD4,CD8,tetramercytokinesDNACD3,4,8,tetramer+CytokinesCD3,4,8,tetramer+DNACytokines+DNACD3,4,8,tetramer+Cytokines+DNACD系列在免疫學(xué)中常被用于：

（1）CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配體的發(fā)現(xiàn)；（2）CD抗原功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系（3）細(xì)胞激活途徑和膜信號的傳遞；（4）細(xì)胞分化過程中的調(diào)控；（5）細(xì)胞亞群的功能。

1.檢測淋巴細(xì)胞亞群，監(jiān)測細(xì)胞免疫狀態(tài)2.白血病/淋巴瘤免疫分型3.HLA組織配型及HLA與某些疾病的關(guān)系4.干祖細(xì)胞的定量及成分分析.5.其它:血小板PAIg：粘附分子;TCR多態(tài)性檢測;腫瘤癌基因及抑癌基因蛋白產(chǎn)物的檢測;細(xì)胞內(nèi)酶;耐藥蛋白的分析等等。臨床與科研常見應(yīng)用淋巴細(xì)胞亞群T淋巴細(xì)胞(CD3+)名稱功能CD3+CD4+輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Th/Ti)輔助和誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫

CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-輔助性T細(xì)胞(Th)誘導(dǎo)性T細(xì)胞(Ti)輔助細(xì)胞免疫和體液免疫誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫CD3+CD8+抑制性/殺傷性T細(xì)胞(Ts/Tc)抑制免疫反應(yīng)/殺傷異源細(xì)胞

CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T細(xì)胞(Ts)殺傷性T細(xì)胞(Tc)抑制細(xì)胞和體液免疫細(xì)胞毒性T細(xì)胞CD3+CD4+CD8+活化的T細(xì)胞在T細(xì)胞惡性增生時升高

CD3+CD4-CD8-有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞,其表達(dá)

/T細(xì)胞受體(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/靜止的T淋巴細(xì)胞

當(dāng)免疫系統(tǒng)沒有能力更新輔助性或抑制性/細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的祖細(xì)胞時此細(xì)胞亞群較低

CD45RA-CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞

病菌感染時升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T細(xì)胞,感染時升高

感染時升高淋巴細(xì)胞亞群活化T淋巴細(xì)胞名稱功能CD3+HLA-DR+活化T細(xì)胞CD4+HLA-DR+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞CD4+CD25+活化的輔助性/誘導(dǎo)性T細(xì)胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/殺傷性T細(xì)胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味著HIV患者的預(yù)后較差B淋巴細(xì)胞(19+)CD19+CD23+活化的B細(xì)胞過敏患者中升高

CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高

CD19+CD5+CD23+慢性B細(xì)胞白血病及單克隆B淋巴細(xì)胞

NK細(xì)胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病時降低,而病毒感染時升高

CD3+CD57+CMV(巨細(xì)胞病毒)感染的強(qiáng)烈征兆

淋巴細(xì)胞亞群與疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫性溶血性貧血重癥肌無力免疫缺陷病愛滋病病毒感染傳染性單核細(xì)胞增多癥慢性活動性肝炎活動性肝硬化腫瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障礙性貧血粒細(xì)胞減少癥監(jiān)測細(xì)胞免疫狀態(tài)

1.CD4+、CD8+T細(xì)胞減少：見于r免疫球蛋白缺乏癥、胸腺

發(fā)育不良、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病。2.CD8+T細(xì)胞增多見于病毒感染：HBV、CMV、EB等。3.CD4+/CD8+比例異常：進(jìn)展期AIDS：CD4+細(xì)胞減少，CD8+細(xì)胞可以正常、增高或降低，比值下降；身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化，CD4+/CD8+升高，CD8+減少；SLE病人的淋巴細(xì)胞變化可以反映該病的活動情況和器官的侵犯程度。

ABMT后免疫重建期間可有CD4減少，比值下降。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中CD4+CD29+細(xì)胞增多。多發(fā)性硬化（MS）、SLE患者外周血CD4+CD45RA+細(xì)胞減少。

4，CD3/HLA-DR：同時計數(shù)外周血靜止T細(xì)胞（CD3+HLA-DR-）、B細(xì)胞（CD3-HLA-DR+）及活化T細(xì)胞（CD3+HLA-DR+）。

5，CD3/CD16+56：計數(shù)總NK細(xì)胞群（CD3-CD[16+56]+）。NK細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤、寄生蟲、病毒等感染的重要免疫因素，也參與第II型超敏反應(yīng)和移植物抗宿主反應(yīng)，IL-2治療后，外周血NK細(xì)胞增加。

6，移植后免疫監(jiān)測：測定細(xì)胞表面活化抗原的表達(dá),可以預(yù)測移植排斥和移植后感染:

CD25+高于正常5--10%,表明即將發(fā)生或已發(fā)生排斥;

CD4/CD8比值下降提示并發(fā)兇險感染,比值<0.2必須停用免疫抑制劑.

CD2+HLA-DR+增加5--10%,且不伴有CD25的增加,提示巨細(xì)胞病毒感染.變態(tài)反應(yīng)性疾病CD19與CD23的檢測鑒別支氣管炎與哮喘CD203變態(tài)反應(yīng)性疾病CD203增強(qiáng)CD63CD63與支氣管炎的疾病進(jìn)程黏附分子

白血病免疫分型的價值確定ALL的細(xì)胞類型（B細(xì)胞或T細(xì)胞）和ALL的分化階段。鑒定AML的特征。對形態(tài)學(xué)上未分化的急性白血病有助于鑒定細(xì)胞類型。診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。

診斷雙表型/混合細(xì)胞型急性白血病。鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達(dá)（My+）或AML伴有淋系抗原表達(dá)（Ly+）。鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關(guān)的亞型。如：M3/t(15;17);M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。HLA-B27檢測

外周血HLAB27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)生有很大程度的相關(guān)性.循環(huán)血中活化血小板（CD62P、CD63）：

糖尿病伴微血管病變、冠心病、高血壓病、高脂血癥、腦血栓形成、短暫性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化患者活化血小板百分率和絕對值顯著高于正常人。而糖尿病無微血管病變、周圍血管病變以及深靜脈血栓形成患者活化血小板水平與正常人無顯著差異。PTCA后24小時發(fā)展成急性血管閉塞或高度再狹窄的患者活化血小板CD62p、CD63增多，可以用于預(yù)測PTCA后急性缺血再發(fā)作的危險性。

PNH(陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿)HbF(胎兒血紅蛋白)檢測HbF(胎兒血紅蛋白)檢測熱門研究抗原特異性T細(xì)胞檢測樹突狀細(xì)胞（DC）循環(huán)微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4等MHCTetramerTechnology微轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞靈敏度:10-7

臨床應(yīng)用疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)免疫調(diào)節(jié)：細(xì)胞因子/受體的相互作用共刺激分子受體/配體的相互作用

發(fā)病機(jī)理：腫瘤的發(fā)病與機(jī)體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關(guān)藥物/疫苗效果的評價：腫瘤生物治療的時機(jī)選擇、以及效果的監(jiān)測免疫狀態(tài)評價：移植、放化療等.細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細(xì)胞周期分析G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle0

200

400

600

80010002N4NCountsG0/G1G2/MS異倍體PI熒光強(qiáng)度(DNA含量)流式DNA周期示意圖淋巴瘤組織學(xué)分級與DNA倍體及

S期細(xì)胞關(guān)系HistologyDNAAnalysisS期比值(%)Low-gradeDiploid/Aneuploid1~5Intermediate-gradeFrequentlyAneuploid5~15High-gradeFrequentlyAneuploid>15

依據(jù)Workingformulation之分類，Low-gradeNHL中有47%為Aneuploid在Intermediate-gradeNHL中有71%為Aneuploid；而High-gradeNHL中有90%為Aneuploid

DNA含量；很顯然使用FCM也有助于NHL的診斷與分類，不過Aneuploid是否對預(yù)后有影響，則仍有待研究。有人認(rèn)為高SPF是最重要的不良預(yù)后指標(biāo)。癌前病變

人體組織細(xì)胞在轉(zhuǎn)化過程中，均伴隨著細(xì)胞DNA含量的異常改變，癌前病變的癌變率與病變的增生程度一致，而增生程度與DNA含量的異常改變又呈平衡關(guān)系，F(xiàn)CM通過精確確定DNA含量，能對癌前病變的性質(zhì)和發(fā)展趨勢作出判斷，有助于癌變的早期診斷。

DNA非整倍體的出現(xiàn)可能是惡變細(xì)胞的重要標(biāo)志，目前病理學(xué)尚無法從中發(fā)現(xiàn)癌變和即將癌變的細(xì)胞，而FCM檢測中細(xì)胞DNA非整倍體的出現(xiàn)可做為一個有價值的參數(shù)。1.腫瘤的早期診斷。2.腫瘤的良惡性判斷。3.觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及周期分布。4.療效監(jiān)測細(xì)胞功能分析

1.吞噬功能試驗

2.氧爆發(fā)試驗3.根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同將CD4+或CD8+分為介導(dǎo)細(xì)胞免疫的I型細(xì)胞和介導(dǎo)體液免疫的II型細(xì)胞.4.藥物泵的功能檢測

5.NK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性檢測6.血小板的粘附,聚集功能檢測：

纖原或GPIIb-IIIa上纖原受體的缺陷均可引起血小板聚集障礙而出血。應(yīng)用纖原單抗(如SZ65)及ADP等誘導(dǎo)劑，在FCM上觀察纖原結(jié)合的百分率及熒光強(qiáng)度，可為該疾病的診斷提供參考依據(jù).細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，貫穿于個體的生長、發(fā)育直至死亡的整個生理過程。它與細(xì)胞增殖、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用，且在胚胎發(fā)育、免疫系統(tǒng)的克隆選擇、神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)的發(fā)育過程中扮演至關(guān)重要的角色；其病理學(xué)作用可涉及癌癥、自身免疫疾病、HIV及退行性神經(jīng)疾病如Alzheimer和Parkinson病等。正因為如此，與其相關(guān)的基因和分子的研究成為當(dāng)今生命科學(xué)領(lǐng)域的一個焦點Introductionofapoptosispathway細(xì)胞凋亡研究

1.鑒別凋亡與壞死:AnnexinⅤ