第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法演示文稿

第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法演示文稿本文檔共89頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\10點24分優(yōu)選第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法本文檔共89頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\10點24分第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)本文檔共89頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\10點24分一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)最早的光學(xué)顯微鏡是1590年Janssen和他的侄子共同研制的。其后，RobertHooke和Leeuwenhoek對光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)進(jìn)行了極大的改進(jìn)，由此發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞。20世紀(jì)30年代發(fā)展起來的電子顯微鏡導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)生了一次革命，使生物學(xué)家得以從亞顯微水平上重新認(rèn)識細(xì)胞。本文檔共89頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\10點24分光學(xué)和電子顯微鏡成像原理不管是何種顯微鏡，鏡像的形成都需要三個基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)。本文檔共89頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\10點24分透射本文檔共89頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\10點24分●焦距與角孔徑焦距(focallength)是透鏡的中心平面到焦點的距離，而角孔徑(angularaperture)是光從樣品進(jìn)入顯微鏡的物鏡半角α，因此角孔徑實際表示有多少光離開樣品通過透鏡。本文檔共89頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\10點24分角孔徑越大，透過透鏡的信息越多本文檔共89頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\10點24分分辨率:透鏡最重要的性質(zhì)就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式計算:R=0.61λ/nSinα其中:n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長。0.61是一個恒定的參數(shù)，表示成像的點雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度。從上式可知，角孔徑越大，進(jìn)入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能夠區(qū)別兩個點間最近距離的能力，所以R值越小，分辨率越高。從分辨率的表達(dá)式來看，或者波長越短，分辨率越高。

本文檔共89頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\10點24分分辨極限(limitresolution)與放大率(magnification)對可見光來說，能清楚地分辨出相鄰兩點之間的最小間隔是0.2μm，稱之為分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率?？偡糯舐?/p>

=物鏡放大率×目鏡放大率，放大率同樣受分辨極限的限制。一般來說，光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。由于透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是，所以光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為1400倍。本文檔共89頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\10點24分增大角孔徑或縮短波長可提高光學(xué)顯微鏡的分辨率。如果用波長比普通波長短得多的電子波代替光波，分辨率可大大提高，電子顯微鏡就是在這種需求下被發(fā)明的。表電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空光學(xué)顯微鏡300nm可見光玻璃透鏡不需真空200nm(油鏡)可見光玻璃透鏡不需真空100nm紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空本文檔共89頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\10點24分1、

常用的光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)是光學(xué)顯微技術(shù)的主要工具，自問世以來已有400多年歷史。光學(xué)顯微鏡是利用光線照明，使微小物體形成放大影像的儀器?，F(xiàn)今使用的光學(xué)顯微鏡都是由幾個透鏡組合而成，所以又稱為復(fù)合顯微鏡。本文檔共89頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\10點24分普通雙筒顯微鏡比較高級的顯微鏡上都設(shè)有傾斜式的雙目鏡筒。在物鏡轉(zhuǎn)換器上方裝有四個棱鏡，使經(jīng)過物鏡的光線平分為兩路到達(dá)目鏡，故雙筒顯微鏡的亮度要比單筒者為暗。雙筒顯微鏡的優(yōu)點為同時用兩眼觀察，有較強(qiáng)的立體感。本文檔共89頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\10點24分基本構(gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)本文檔共89頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\10點24分石蠟切片技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\10點24分熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）熒光顯微鏡的工作原理是利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源，通過照明設(shè)備把顯微固定的切片或活染的細(xì)胞透視出來。本文檔共89頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\10點24分熒光顯微鏡原理本文檔共89頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\10點24分

相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計，尤其是光學(xué)系統(tǒng)有很大的不同，可用于觀察未染色的活細(xì)胞。相差顯微鏡是能將物體本身的相位差轉(zhuǎn)換為振幅差的顯微鏡。在普通光鏡下觀察標(biāo)本時，是靠顏色（波長）和亮度（振幅）的差別而看到被檢物體的結(jié)構(gòu)，而活細(xì)胞近于無色透明，光波通過不吸收光，振幅變化不大，故人眼感覺不到，為解決這一難題，30年代（1934—1935）荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計制造出相差顯微鏡，并用此而獲1953年諾貝爾獎。

本文檔共89頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\10點24分相差顯微鏡的光學(xué)部件及光線通路本文檔共89頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\10點24分相差顯微鏡觀察的活細(xì)胞本文檔共89頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\10點24分■暗視野顯微鏡(darkfieldmicroscope)暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器使照明光線不能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。本文檔共89頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\10點24分暗視野顯微鏡的光學(xué)本文檔共89頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\10點24分倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成與普通顯微鏡一樣，所不同的只是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來。前者置于載物臺之下，而后者在載物臺的上方。集光器與載物臺之間的工作距離提高?？梢苑胖门囵B(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。本文檔共89頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\10點24分光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察由于大多數(shù)細(xì)胞的成分不影響光線的穿透，無法形成反差，所以在一般光學(xué)顯微鏡下，幾乎看不清未經(jīng)處理的細(xì)胞。為了看清細(xì)胞內(nèi)含物，就必須對細(xì)胞樣品進(jìn)行一些特殊的處理，為此建立和發(fā)展了樣品的各種制備技術(shù)。

樣品的固定(fixation)目的:

生物組織在染色前先進(jìn)行固定的目的是殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時不會受到破壞本文檔共89頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\10點24分做法:

樣品固定的最簡單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起。本文檔共89頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\10點24分包埋和切片樣品制備的第二步是將固定的組織制備成切片。樣品首先要被包埋在介質(zhì)中，通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，然后將之硬化成固體的包埋塊；用專門的切片機(jī)切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為

l-10μm。本文檔共89頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\10點24分染色(staining)大多數(shù)細(xì)胞總重量的70%是水，對可見光幾乎是透明的，只有很少的內(nèi)含物不透光。染色的目的就是給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。19世紀(jì)初，發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)染料可染生物組織，并對細(xì)胞特殊部位的著色具有選擇性。如蘇木精對負(fù)電荷分子有親和性，能顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布；酸性染料如伊紅可使細(xì)胞質(zhì)染色；蘇丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對許多染料的特異性染色機(jī)理尚不清楚。

本文檔共89頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\10點24分激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。本文檔共89頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\10點24分2、電子顯微鏡技術(shù)

自從第一臺電子顯微鏡在德國誕生以來，取得飛躍發(fā)展并在生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。利用電鏡可以觀察到各種病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器的微細(xì)結(jié)構(gòu)，還能觀察到許多生物大分子。目前的電鏡已由單純的形態(tài)描述進(jìn)入了成分分析、定性和定量分析。此外，將電鏡與計算機(jī)連用，對圖象進(jìn)行信息處理也取得了很大進(jìn)展。

總之，電鏡已成為研究生物學(xué)的有力工具，必將發(fā)揮越來越大的作用。本文檔共89頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\10點24分1932年德國學(xué)者M(jìn)axKnolls和ErnstRuska發(fā)明了第一臺電子顯微鏡，開拓了超微世界，發(fā)現(xiàn)了許多光鏡下看不到的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞核、高爾基體、中心粒等細(xì)胞器的細(xì)微結(jié)構(gòu)。將在光學(xué)顯微鏡中觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopestructure)，或超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)。在種類上，電鏡可分為兩大類:透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。本文檔共89頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\10點24分電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差光鏡與電鏡的主要區(qū)別：（1）光源不同：光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同：光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空（4）顯示記錄系統(tǒng)本文檔共89頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\10點24分透射電子顯微鏡(TEM)透射電子顯微鏡主要是讓電子束穿透樣片而成像。電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)由三大部分組成∶電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)、真空系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng))。電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機(jī)等組成。由于電子顯微鏡必需在高度真空條件下進(jìn)行工作，陰極與陽極之間會放電，燈絲也會因受到氧化或被陽離子轟擊而縮短壽命，所以設(shè)計了真空系統(tǒng)。電子學(xué)系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。本文檔共89頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\10點24分電鏡(透射電鏡)與光鏡光路圖比較本文檔共89頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\10點24分電子顯微鏡的基本構(gòu)造本文檔共89頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\10點24分

掃描式電子顯微鏡

1940年，英國劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡。直到1965年，才有英國劍橋科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)出實用性強(qiáng)的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點，因此，幾十年來，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、地質(zhì)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及勘察、冶金，機(jī)械與輕工業(yè)等領(lǐng)域，成為十分有用的研究工具。本文檔共89頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\10點24分電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。本文檔共89頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\10點24分主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

本文檔共89頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\10點24分超薄切片技術(shù)取材—前固定(4%戊二醛)-PBS洗殘余的戊二醛后固定(4°C,鋨酸)--脫水(乙醇或丙酮包埋(環(huán)氧樹脂)修片切片(600埃，銀色)染色(醋酸鈾與鉛鹽)觀察

本文檔共89頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\10點24分●負(fù)染色(negativestainning)一些生物大分子組成的結(jié)構(gòu)，如病毒、線粒體基粒、核糖體和蛋白質(zhì)組成的纖維等可以通過負(fù)染色電鏡技術(shù)觀察其精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以從不同角度觀察三維結(jié)構(gòu)。

負(fù)染原理：又稱陰性反差染色，借助染色劑的襯托，增加背景對電子的散射，使樣品相對地透過較多的電子，最后在熒光屏上形成暗背景下的“亮像”。本文檔共89頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\10點24分●冰凍斷裂復(fù)型和冰凍蝕刻是專門觀察樣品外表面的投影復(fù)型術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\10點24分一、顯微鏡的種類及原理5.透射電子顯微鏡；6.掃描電子顯微鏡能否用掃描電鏡來觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而用透射電鏡來觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)？冰凍蝕刻技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\10點24分電鏡三維重構(gòu)技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\10點24分3、掃描遂道顯微鏡掃描隧道顯微鏡由IBM公司瑞士蘇黎世研究所的兩位學(xué)者BinningG.和RohrerH.等在1981年發(fā)明的具有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理而制成的。這種顯微鏡對生物、物理、化學(xué)等學(xué)科均有推動作用，可用于研究表面的原子結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)，故于1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎。本文檔共89頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\10點24分特點：（1）可對晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為，縱分辨率可達(dá)0.01nm）；（2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。（4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。本文檔共89頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\10點24分掃描隧道顯微鏡DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立是根據(jù)X射線衍射結(jié)果推導(dǎo)出來的，至今還沒有直接觀察DNA結(jié)構(gòu)的方法，所以對其中的微細(xì)結(jié)構(gòu)還不夠了解。用STM觀察了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，見到

DNA分子上的大溝和小溝，并且了解DNA的結(jié)構(gòu)隨染色體長度而異。本文檔共89頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\10點24分第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法離心分離技術(shù)細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性放射自顯影技術(shù)定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\10點24分一、離心分離技術(shù)離心分離細(xì)胞組分是最常用的分離方法，因為不同的細(xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物。差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分。密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離。本文檔共89頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\10點24分●差速離心(differentialcentrifugation)主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。本文檔共89頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\10點24分差速離心本文檔共89頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\10點24分密度梯度離心本文檔共89頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\10點24分二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。本文檔共89頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\10點24分DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。本文檔共89頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第61頁；編輯于星期三\10點24分多糖的顯示方法PAS（過碘酸希夫氏）反應(yīng)利用過碘酸的強(qiáng)氧化作用破壞糖分子的C-C鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物。本文檔共89頁；當(dāng)前第62頁；編輯于星期三\10點24分脂類物質(zhì)的顯示方法對脂類物質(zhì)的染色應(yīng)用的是物理的擴(kuò)散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時，它會脫離酒精而溶于脂類結(jié)構(gòu)中從而顯色。本文檔共89頁；當(dāng)前第63頁；編輯于星期三\10點24分細(xì)胞中各種酶的顯示方法由于酶易受外界條件影響而變性失活。對酶的顯示一般采取間接的方法進(jìn)行，對可以與酶發(fā)生特異性結(jié)合的底物進(jìn)行染色從而達(dá)到顯示酶的目的。在實驗的過程中需在盡量保持酶的活性。本文檔共89頁；當(dāng)前第64頁；編輯于星期三\10點24分三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)：免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。本文檔共89頁；當(dāng)前第65頁；編輯于星期三\10點24分

細(xì)胞內(nèi)對于蛋白質(zhì)分子的定位技術(shù)包括免疫熒光、免疫印跡以及免疫電鏡等，這些技術(shù)都是基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性反應(yīng)的原理而設(shè)計的。將抗體分子上加上不同的可供識別的標(biāo)記，從而顯示出某種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位?？乖乖贵w特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記免疫酶標(biāo)記本文檔共89頁；當(dāng)前第66頁；編輯于星期三\10點24分免疫熒光技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第67頁；編輯于星期三\10點24分本文檔共89頁；當(dāng)前第68頁；編輯于星期三\10點24分免疫電鏡技術(shù)本文檔共89頁；當(dāng)前第69頁；編輯于星期三\10點24分四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

本文檔共89頁；當(dāng)前第70頁；編輯于星期三\10點24分五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影本文檔共89頁；當(dāng)前第71頁；編輯于星期三\10點24分放射自顯影本文檔共89頁；當(dāng)前第72頁；編輯于星期三\10點24分六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度測定術(shù)

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。

包括：紫外光顯微分光光度測定法；可見光顯微分光光度測定法流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測定細(xì)胞群體中不同時相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。本文檔共89頁；當(dāng)前第73頁；編輯于星期三\10點24分流式細(xì)胞儀本文檔共89頁；當(dāng)前第74頁；編輯于星期三\10點24分第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃至整個生命科學(xué)研究與生物工程中最基本的實驗技術(shù)。近年來細(xì)胞生物學(xué)一系列主要理淪研究的進(jìn)展，如細(xì)胞全能性的揭示，細(xì)胞周期及其調(diào)控。癌變機(jī)制與細(xì)胞衰老，基因表達(dá)與調(diào)控，細(xì)胞融合以及一些細(xì)胞工程技