備課素材：赫爾希和蔡斯的噬菌體侵染細菌實驗 高一下學期生物人教版必修2

赫爾希和蔡斯的噬菌體侵染細菌實驗材料和方法噬菌體T2指的是一個叫T2H的變種（Hershey，1946）；T2h指的是T2的一個寄主范圍改變的突變體；uv-

噬菌體指的是噬菌體用一滅菌的紫外燈（通用電器公司）照射，使存活率為10-5

。敏感細菌指的是大腸桿菌的一個對T2及T2的h突變體敏感的菌株H；抗性菌B/2指的是一個抗T2、但對T2的h突變體敏感的菌株；抗性菌株B/2h指的是一個對這兩者都抗的菌株。這些細菌不能吸附它們所能抵抗的噬菌體。低鹽肉湯培養(yǎng)基，每升含有bacto-蛋白胨10克、葡萄糖1克、NaCl1克。肉湯培養(yǎng)基除了這些成分外，還含有bacto-牛肉浸汁3克、NaCl4克。甘油-乳酸鹽培養(yǎng)基每升含有乳酸鈉70mM

、甘油4克、NaCl5克、KCl2克、NH4

Cl1克、MgCl2

1mM、CaCl2

0.1mM、明膠0.01克、磷（如正磷酸鹽）10毫克、硫（如MgSO4

）10毫克、pH7.0。吸附培養(yǎng)基每升含有NaCl4克、K2

SO4

5克、KH2

PO4

1.5克、Na2

HPO4

3克、MgSO4

1mM、CaCl2

0.1mM、明膠0.01克、pH7.0。佛羅那（Veronal）緩沖液每升含有二乙基巴比土酸鈉1克、MgSO4

3mM、明膠1克、pH8.0。HCN是由氰化鈉溶液組成，使用時用磷酸中和。把培養(yǎng)18小時的細菌，在37℃熱處理10分鐘，并用吸附培養(yǎng)基洗滌，然后與同位素樣品在吸附培養(yǎng)基中混合，測定細菌吸附的同位素，混合物在37℃保溫5分鐘，再用水稀釋、離心。分別對沉淀和上清液進行分析。用抗血清沉淀的同位素測定方法，是在每毫升約含1011

無放射性噬菌體的0.5％鹽溶液中，把同位素樣品和稍多于最低量的抗噬菌體血清（最后稀釋度為1∶160）混合，會產(chǎn)生明顯的沉淀?；旌衔镌?7℃保溫2小時后離心。DNase試驗的做法是：用佛羅那緩沖液稀釋過的樣品，經(jīng)過預(yù)熱，每毫升加0.1毫克晶體的DNase（華盛頓生化實驗室），37℃保溫15分鐘。樣品冷卻后，用5％TCA（每毫升中含有1毫克血清白蛋白）沉淀，離心。然后測定酸溶性同位素。在離心分離過程中得到的所有沉淀都未經(jīng)洗滌，因此含有5％的上清液。沉淀和上清液都進行分析。用一個在末端開口的Geiger計數(shù)器來測定放射性，為了避免樣品本身吸附作用造成的損失，采用的樣品要少，而且要充分干燥。在測定32

P絕對值時，使用的32

P溶液，以及標準溶液，都是從國家標準局得到的。在測定35

S的絕對值時，我們采用了供給同位素單位（美國橡樹嶺國家實驗室）提供的分析（±20％）。用甘油-乳酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，在磷和硫的濃度低時，pH比較穩(wěn)定，這種培養(yǎng)基對于本文中提到的其他一些實驗也是有用的。在這種培養(yǎng)基中，敏感菌的18小時培養(yǎng)物，每毫升約有2×109

個菌，在對數(shù)生長時沒有延遲期，而且在同種培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)時，不管接種量的大小，每個細胞都沒有光散射的改變。在37℃增殖一代的時間是1.5小時。這種細胞要比在肉湯中培養(yǎng)的細胞小些。在這種培養(yǎng)基中，T2表現(xiàn)出有22～25分鐘的潛伏期。用氰化物和UV-噬菌體（在文章內(nèi)容中將敘述）的溶菌作用得到的噬菌體產(chǎn)量：在15分鐘的時候，每個細菌1個；在25分鐘的時候，每個細菌16個。在稀釋培養(yǎng)物中，50分鐘的時候，達到最終釋放量是每個細菌有30～40個噬菌體。在每毫升為2×108

個細菌時，培養(yǎng)物慢慢地溶菌，每個細菌可產(chǎn)生140個噬菌體。在這種培養(yǎng)基中，細菌和噬菌體的生長都和在肉湯中一樣，重復(fù)性很好。為了制備同位素標記的噬菌體，把比活性為0.5毫居里／毫克的32

P或比活性為8.0毫居里／毫克的35

S加入甘油-乳酸鹽培養(yǎng)基中，先讓細菌至少生長4個小時，然后加進噬菌體。噬菌體感染后，將培養(yǎng)物通氣培養(yǎng)過夜，用低速（2000×g）和高速（12000×g）交替離心各三次，分離出同位素標記的噬菌體，噬菌體懸液貯存時，濃度不要超過4微居里／毫升。這種制品中每個活的噬菌體顆粒含有（1.0～3.0）×10-12

微克的硫和（2.5～3.5）×10-11

微克的磷，有時制品含硫量過多，可用熱處理殺死了的、不能吸附噬菌體的細菌的吸附作用來改良。由于存在失活的噬菌體顆粒和空的噬菌體“外膜”，影響了制品的放射化學純度。制品中的硫（約20％）可以被抗噬菌體血清沉淀（見表1），也可以被抗噬菌體的細菌吸附，但不能被對噬菌體敏感的細菌吸附（見表7），這說明制品中污染有“外膜”物質(zhì)。表1的資料表明，就我們的研究目的來看，細菌原來的污染可以忽略不計。為了證實我們的主要發(fā)現(xiàn)反映的確實是活噬菌體的特性，在本文末尾引用了用失活噬菌體做的一些實驗。靜止噬菌體顆粒的化學形態(tài)Anderson（1949）發(fā)現(xiàn)將T2噬菌體顆粒懸浮在高濃度的氯化鈉中，再用水把懸浮液快速稀釋，可使噬菌體失活。在電子顯微鏡下可見這種失活的噬菌體好像是蝌蚪形的“空胞”。假定慢慢稀釋，就不會引起噬菌體失活，因此認為這種失活是由于滲透壓驟變造成的。并且推論，這種顆粒具有一種滲透膜。Herriott（1951）發(fā)現(xiàn)滲透壓驟變能使噬菌體顆粒的DNA釋放到溶液中，“空胞”可以吸附到細菌上，并使細菌溶解。他指出這是用病毒物質(zhì)鑒定病毒功能的一個開端。室溫下，將噬菌體（1011

個／毫升）在3M的NaCl溶液中懸浮5分鐘，并迅速在懸液中注入40倍體積的蒸餾水，能使同位素標記過的T2發(fā)生質(zhì)壁分離。這種質(zhì)壁分離的噬菌體，存活者不到2％，然后用表1的幾種方法分析磷和硫。結(jié)果從以下幾點證實并發(fā)展了以前的發(fā)現(xiàn)：（1）質(zhì)壁分離將噬菌體T2分離成“空胞”和溶液兩部分，整個噬菌體顆粒所含的硫幾乎全在“空胞”中，而DNA則幾乎全在溶液中。（2）“空胞”含有噬菌體顆粒的主要抗原，這種抗原用抗血清可以檢查出來。DNA釋放出來后成為游離酸，也可能與不含硫、也無抗原活性的物質(zhì)結(jié)合在一起。（3）“空胞”能特異性吸附到對噬菌體敏感的細菌上去；DNA則不能。（4）“空胞”是蛋白質(zhì)外殼，它裹在整個噬菌體顆粒DNA的外面，能與抗血清起反應(yīng)，能保護DNA免受DNase破壞，它帶有能吸附到細菌上去的“器官”。（5）噬菌體的質(zhì)壁分離是由于滲透壓驟變造成的，因為如果將噬菌體懸浮在鹽溶液中緩慢地稀釋，就不能使它失活，而且它的DNA也不會暴露在DNase中。噬菌體吸附到細菌上后，其DNA變得對DNase敏感了上述的靜止噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)說明，噬菌體的增殖可能首先要改變或除去這種病毒顆粒的保護性外殼。估計這種改變本身就說明噬菌體DNA變得對DNase敏感了。表2列出的實驗說明了這一點。這些結(jié)果可歸納為以下幾點：（1）噬菌體吸附到加熱殺死的細菌上后，其DNA變得對DNase非常敏感。（2）噬菌體吸附到活細菌上后，放在80℃加熱10分鐘，其DNA也變得對DNase敏感了。在這個溫度下不發(fā)生吸附的噬菌體，對DNase是不敏感的。（3）吸附到未經(jīng)加熱的細菌上去的噬菌體DNA，對DNase是有抗性的，推測是因為酶透不過細胞結(jié)構(gòu)，因而起了保護作用。在吸附培養(yǎng)基中，37℃5分鐘，使噬菌體吸附到細菌上去，隨后就洗滌。細菌在吸附培養(yǎng)基中（侵染前）或佛羅那緩沖液中（侵染后），80℃熱處理10分鐘。不能吸附的噬菌體是在佛羅那緩沖液中加熱，并用DNase處理，用TCA沉淀。分離供試樣品，都是在1300×g離心10分鐘。噬菌體吸附到加熱殺死的細菌上后，其DNA變得對DNase敏感了。這一現(xiàn)象首先是Graham和他的同事（私人通信）發(fā)現(xiàn)的。通過凍融交替（隨后用甲醛固定，使細胞的酶失活），可以使被侵染細胞中的DNA容易受到DNase的影響。只用甲醛固定也有一定作用，這可由下面的實驗來說明。將細菌培養(yǎng)在肉湯中達5×107

細菌／毫升，離心，再懸浮在吸附培養(yǎng)基中，每個細菌用大約2個32

P標記過的噬菌體來侵染。吸附5分鐘后，用每升含有MgSO4

1.0mM；CaCl2

0.1mM；明膠10毫克的水溶液來稀釋此懸浮液，再次離心收集菌體。菌體再懸浮在剛才提到的這種溶液中，濃度為5×108

個細菌／毫升。置于-15℃冰凍，而后用最小熱量使之融化，這樣冰凍、融化連續(xù)進行3次。第三次融化后，立刻加進0.5％（V/V）的甲醛（35％甲醛），將菌固定。在室溫下30分鐘后，透析除去甲醛，懸液在2200×g離心15分鐘，用經(jīng)過凍、融、固定、透析的32

P標記噬菌體和經(jīng)過固定、透析的被侵染細菌作為對照。分析表3給出的資料可以看出，冰凍和融化的效應(yīng)是：使胞內(nèi)的DNA對DNase不穩(wěn)定了，而不是使大量的DNA濾出細胞。凍融和甲醛固定對未被吸附的噬菌體沒有什么影響，單獨的甲醛固定對于被侵染過的細胞只有溫和的影響。數(shù)字表示在原來的噬菌體或其被吸附的部分中，32P的百分數(shù)。胞內(nèi)的32P變得對DNase敏感，以及DNA不透出細胞，這兩點都是這類試驗的恒定特性，和見到的溶菌現(xiàn)象無關(guān)。在剛才敘述過的實驗中，冰凍過的懸液在透析過程中變清了。相差顯微鏡檢查看到：這種細胞基本上都是空的，顯然大多數(shù)都破裂了。另一個實驗中，在低鹽肉湯中培養(yǎng)的細菌，經(jīng)噬菌體侵染后，在噬菌體生長潛伏期的不同時間，經(jīng)過反復(fù)凍、融，并用甲醛固定，然后離心洗滌。清楚可見的溶菌作用和在顯微鏡下才能看到的溶菌作用，只發(fā)生在潛伏期后半期的冰凍菌懸液中，在第一次或第二次融化時，從菌懸液中都可以看到這種現(xiàn)象；在這種情況下，溶解的細胞全是由完整的外膜組成的，除了附著在細胞壁上的幾個小的、相當有特色的折射體外，其他顯然都是空的。從表3看出，不論在溶菌或不溶菌的細胞中，胞內(nèi)的32P對DNase的行為都沒有很大差異，只是溶菌之后，32P的含量稍有降低。本實驗中，對凍融期間釋放出來的噬菌體的滴度，也進行了測定。在噬菌體侵染后，第16分鐘及16分鐘以前冰凍的菌懸液，溶菌時基本上不釋放噬菌體；第20分鐘冰凍的菌懸液，溶菌時每個細菌只產(chǎn)生5個噬菌體；第30分鐘用甲醛處理的菌懸液，在常溫下離心，不能沉降的部分中含有66％的32P；第30分鐘冰凍的菌懸液，每個細菌產(chǎn)生的胞外噬菌體是108個，沉降下來的物質(zhì)大部分是不成型的碎片，但也含有很多完整的外膜。用32P標記的噬菌體侵染細菌，隨后進行凍融處理，用這樣的菌體所做的實驗可以得出如下結(jié)論：（1）噬菌體吸附到細菌上去之后，在不引起生長的緩沖液中，噬菌體DNA會變得對DNase敏感了（Benzer1952；Dulbecco1952）。（2）在不允許胞內(nèi)32P或細胞內(nèi)含物跑出去的條件下，外膜可變得對DNase有透性。（3）即使由于凍融造成細胞溶菌，細胞的其他成分逸出胞外，但由噬菌體帶進來的32P大部分仍留在外膜內(nèi)，形成成熟的子代噬菌體。（4）在發(fā)生自發(fā)溶菌時，隨著噬菌體的釋放，由噬菌體帶進細胞的32P也大部分釋放出去了。我們對這些事實所做的解釋是：從噬菌體帶進細菌細胞內(nèi)的DNA，不單單是能在溶液中存在，而且在整個潛伏期中都是組織結(jié)構(gòu)的一部分。噬菌體吸附到細菌的碎片上后，其DNA從噬菌體顆粒中釋放出來噬菌體吸附到細菌上去以后，其DNA對特異的解聚酶變得敏感了，這可能意味著在吸附后，噬菌體DNA就從其保護外殼中排出。下面的實驗證明：實驗中，當噬菌體吸附到破碎的細菌細胞上去時，確實會發(fā)生這種情況。在吸附培養(yǎng)基中，每個細菌用4個T2噬菌體顆粒進行侵染，來制備細菌碎片。在37℃，把這些細胞轉(zhuǎn)到低鹽肉湯中，培養(yǎng)物通氣培養(yǎng)60分鐘，加入0.02MHCN，繼續(xù)保溫培養(yǎng)30分鐘以上，這時，胞外噬菌體產(chǎn)量可以達到每個細菌有400個顆粒，只是因為電解質(zhì)的濃度低，所以不能吸附。溶解細胞的碎片在1700×g離心洗滌，再懸浮在吸附培養(yǎng)基中，使其濃度相當于3×109

個溶解細胞／毫升。這種懸液主要含有崩潰的、破碎外膜。同位素標記的噬菌體吸附到這些材料上面去的情況見表4。下面幾點值得注意。35S和32P標記過的T2噬菌體與相應(yīng)的細胞碎片樣品，在吸附培養(yǎng)基中混合，在37℃保溫30分鐘，混合物在2200×g離心15分鐘，然后對沉淀和上清液部分分別進行分析，結(jié)果用進入細胞碎片的噬菌體或同位素的百分數(shù)來表示。（1）在未吸附部分中，只含有5％原來的侵染型噬菌體顆粒，占13％的總硫量（這些硫多數(shù)是在不能被完整的細菌吸附的物質(zhì)中）。（2）約有80％的噬菌體失活了。這種噬菌體的大部分硫，以及大部分存活的噬菌體是在沉淀中。（3）上清液中除了含有未被吸附的存活噬菌體外，還含有總噬菌體DNA的40％（以對DNase敏感的形式存在）。這種對DNase敏感的DNA，數(shù)量約為失活噬菌體顆粒的DNA數(shù)量的一半，它們的硫與細菌碎片一起沉降。（4）大多數(shù)可沉淀的DNA可能是存活的噬菌體，也可能是對DNase敏感的DNA，后者的數(shù)量約相當于失活顆粒DNA的一半。這類實驗有一個方面是不能令人滿意的，人們不清楚，釋放出來的DNA是代表失活顆粒的全部DNA呢？還是只是其中的一部分？當細菌（菌株B）用大量的、紫外線殺死的噬菌體T2或T4溶菌后，再用32P標記的T2和T4來測定，也得到了同樣的結(jié)果。這個實驗中，最有意義的一點是：用紫外線殺死的T2飽和的細菌碎片，吸附T4要比吸附T2好；用T4飽和的細菌碎片吸附T2要比吸附T4好。和前面的實驗一樣，某些噬菌體在吸附之后并不失去活性，某些失活噬菌體的DNA也沒有從這些細菌碎片中釋放出來。這些實驗表明：細菌對T2的某些接受器和對T4的某些接受器是不同的。而且，吸附到這些特異性的接受器上的噬菌體和吸附到非選擇性接受器上的噬菌體的失活機制是一樣的。顯然，這種機制是很有效的，它的作用不單單是封阻噬菌體吸附到細菌上去的位點，可能還有其他作用。從受侵染的細菌上去掉噬菌體外殼Anderson（1951）得到的電子顯微照片表明：噬菌體T2靠它的尾部吸附到細菌上去。假定在侵染過程中，這種不穩(wěn)定的吸附受到保護；再假定上面得到的結(jié)論是正確的，那么噬菌體把DNA注入細菌細胞內(nèi)，空的噬菌體外殼斷離受侵染細胞，應(yīng)該是一件簡單的事。下面的實驗表明，用很強的、就像剪刀剪東西般的力量作用于受侵染的細菌懸液，就很容易從受侵染菌體上去掉噬菌體外殼；而且實驗還說明：去掉了親本病毒80％的硫的受侵染細胞，仍能形成子代噬菌體。把在肉湯中培養(yǎng)的細菌，放在吸附培養(yǎng)基中用35S或32P標記的噬菌體進行侵染，離心除去未被吸附的噬菌體，把菌重新懸浮在含有下列物質(zhì)的水中：MgSO4

1mM；CaCl2

0.1mM；明膠0.1克；水1升。懸液放在Waring搗碎器（半微量）中攪拌（10000rpm）。攪拌時，每隔60秒，把懸液放在冰水中冷卻一會兒，隔一定時間取樣，用抗噬菌體血清進行滴定，測出細菌產(chǎn)生的噬菌體數(shù)目，并離心測定細胞釋放出的同位素的比例。圖1表示用同位素所作的一次實驗結(jié)果。被侵染細菌的35S和存活率，是從同一實驗得到的，從直接滴定法測出：在這個實驗中加入的噬菌體與細菌的比例為0.28，細菌的總濃度為9.7×108

/毫升，其中受到侵染的為2.5×108

/毫升。用32P標記噬菌體所作的實驗與這個實驗十分相似。從這些結(jié)果，會使人回想起Anderson（1949）的發(fā)現(xiàn)，即：快速攪拌菌懸液可以防止噬菌體吸附到細菌上。圖1

在Waring搗碎器中攪拌時，同位素標記噬菌體侵染過的細菌中，35S和32P的去除以及受侵染細菌的存活曲線雖然32P的洗脫和受侵染細胞的存活不受侵染倍數(shù)的影響，但在這些實驗條件下，當侵染倍數(shù)較高時，有相當數(shù)量的噬菌體硫從這些細胞中自發(fā)地洗脫下來（見表5）。這表明了各個噬菌體顆粒通過互相協(xié)作引起細菌細胞膜產(chǎn)生改變，從而減弱了噬菌體的吸附。用這種方法檢查出來的這些細胞變化，可能與從被侵染的細菌中釋放出細菌成分的那些變化是有關(guān)的（Prater，1951；Price，1952）。被侵染細菌以109

/毫升的濃度懸浮在每升含有：MgSO4

1mM；CaCl2

0.1mM；明膠0.1克的水溶液中。取樣，分析胞外同位素及懸液在攪拌前后被侵染細胞的數(shù)目。在這兩種情況下，細胞都要在洗脫液中停留15分鐘（室溫）。為了測定在噬菌體生長后期細菌的情況，對以前的實驗作了某些改動。從這個目的出發(fā)，把被侵染細菌在肉湯中通氣培養(yǎng)5或15分鐘，加入0.5％（V/V）的商品甲醛進行固定、離心，再次懸浮于0.1％的甲醛水溶液中，其后的處理同以前所述。結(jié)果與以前十分相似，只是從細菌中釋放出來的32

P稍微少些，受侵染細胞的滴度沒有測定。按照前面敘述的方法，從被侵染細菌剝離下來的這種35S標記的物質(zhì)，具有下列性質(zhì)：在12000×g離心時，它沉降得不如完整的噬菌體顆粒那么完全；在用完整噬菌體做載體時，它能全部地被抗噬菌體血清沉淀；在37℃5分鐘，它的40％～50％能夠再次吸附到敏感細菌上去，當細菌濃度為2×108

～2×109

/毫升時，它的吸附幾乎與細菌濃度無關(guān)，這種吸附不是十分特異的，在同樣條件下，有10％～25％能吸附到抗噬菌體的細菌上去。吸附作用需要鹽，為此，只要在一種缺乏電解質(zhì)的液體中，便可以從被侵染細菌上有效地除去35S。這些實驗的結(jié)果總結(jié)如下：（1）激烈振蕩懸液可以把噬菌體75％～80％的硫從受侵染細胞上剝落下來。在侵染倍數(shù)高時，大約有50％的35S能自發(fā)的洗脫下來。35S標記材料的這種性質(zhì)表明，它在不同程度上含有完整的噬菌體外殼。這些35S標記的材料，大部分已失去特異性地吸附到細菌上去的能力。（2）在這些硫釋放出來的同時，噬菌體磷的釋放只有21％～35％，其中半數(shù)在不用機械攪拌的情況下就可自發(fā)釋放出來。（3）實驗所用的處理不會造成胞內(nèi)噬菌體的明顯失活。（4）這些事實表明：在侵染過程中，噬菌體所含的硫，大部分仍留在細菌的表面，不參與胞內(nèi)噬菌體的復(fù)制。相反，噬菌體的大部分DNA，在噬菌體吸附到細菌上后，很快就進入細胞。硫和磷從親代噬菌體向子代噬菌體的傳遞上面我們已經(jīng)推斷：靜止期噬菌體顆粒蛋白質(zhì)所含的大部分硫不參與噬菌體的復(fù)制，事實上也不進入細菌。因此，親本噬菌體的硫也不可能傳遞給子代。下述實驗說明這個推測是正確的，這種傳遞的最大值不超過1％。把細菌在甘油-乳酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后再在同種培養(yǎng)基中，在37℃繼代培養(yǎng)2小時，接種量調(diào)到能使繼代培養(yǎng)物產(chǎn)生2×108

個細菌／毫升。把細菌沉淀下來，再懸于吸附培養(yǎng)基中（濃度為109

細菌／毫升），再用35S標記的噬菌體T2進行侵染。37℃5分鐘后，用2倍體積的水來稀釋懸浮液，離心，除去未被吸附的噬菌體（占滴度的5％～10％）和35S（約15％）。隨后把細菌懸浮在甘油-乳酸鹽培養(yǎng)基中，濃度為2×108

/毫升，37℃通氣培養(yǎng)。在指定時間，快速連續(xù)地加入0.02mMHCN和2×1011

/毫升紫外線殺死的噬菌體，停止噬菌體的生長。氰化物能停止胞內(nèi)噬菌體的成熟（Doermann，1948），紫外線殺死的噬菌體能吸附到細胞碎片上，使子代噬菌體損失減到最小，并促進細菌的溶解（Maal?e&Watson，1951）。正如在別處提到的，在這些實驗中也注意到了，為了防止由于吸附到細菌碎片上造成子代噬菌體失活，溶菌噬菌體與經(jīng)過增殖的噬菌體必須有密切關(guān)系［例如：在這種情況下應(yīng)該用T2H（T2的h突變體）或T2L，但不應(yīng)該用T4或T6］。為了得到通常所說的噬菌體的最高產(chǎn)量，把被侵染細菌放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)25分鐘后，再加入溶菌噬菌體，而氰化物是在第二小時末尾加入。在這些條件下，侵染細胞的溶菌作用是相當慢的。加入氰化物時立即停止通氣，培養(yǎng)物在37℃放置過夜。然后經(jīng)過離心分離把溶菌產(chǎn)物分離成以下幾部分：第一次低速離心（2500×g，20分鐘）沉淀物；高速離心（12000×g，30分鐘）上清液；高速離心沉淀物重懸在吸附培養(yǎng)基中，再進行低速離心，得到第二次低速離心的沉淀和澄清了的高速離心沉淀。用35S標記的噬菌體T2侵染時，每個細菌平均為0.8個噬菌體顆粒。溶菌噬菌體是紫外線殺死的T2的h突變體。在t=0溶菌后，每個受侵染的細菌產(chǎn)生的噬菌體數(shù)量＜0.1；在t=10時，溶菌后，則為0.12；最大值為29。35S的回收指的是在4個部分中，回收量和吸附了的加入量的百分比；噬菌體的回收指的是根據(jù)各部分滴度來測定回收噬菌體量和總噬菌體量（分離前用噬菌斑計數(shù)）的百分比。這個實驗的顯著結(jié)果是：不帶有子代噬菌體的早期溶菌產(chǎn)物和含有子代噬菌體的晚期溶菌產(chǎn)物各部分中35

S的分布是一樣的。這說明在成熟的子代噬菌體中幾乎不含35S。通過子代噬菌體吸附到細菌上去所起到的進一步分離作用，更證實了這一說法。為此目的制備的吸附混合物，每毫升吸附培養(yǎng)基中含有：18小時肉湯培養(yǎng)物經(jīng)熱處理（70℃，10分鐘）殺死的細菌約5×109個，噬菌體約1011個（紫外線殺死的溶菌噬菌體和測定噬菌體的總量）。37℃加熱5分鐘后，混合物用2倍體積的水稀釋，并離心。對上清液和未經(jīng)洗滌重新懸浮的沉淀分別進行分析。表7表示35S和噬菌體吸附到下面幾種細菌上去的試驗結(jié)果：①既能吸附T2子代噬菌體也能吸附h突變體溶菌噬菌體的細菌（H）；②只能吸附溶菌噬菌體的細菌（B/2）；③兩種噬菌體都不能吸附的細菌（B/2h）。用3

S標記噬菌體做出可靠平行試驗的結(jié)果也列于表7中。統(tǒng)一的標記噬菌體和由它們得到的培養(yǎng)物，分別是種子噬菌體和表6實驗的高速沉淀部分。測定統(tǒng)一的標記噬菌體是在噬菌體和細菌的比例較低的情況下進行的。加UV-h意思是加入紫外線殺死的h突變體（濃度和在其他試驗中是相同的）。按常規(guī)方法，噬菌體的吸附作用是根據(jù)上消液噬菌斑計數(shù)來測定的；在抗性細菌的情況下，也用沉淀物噬菌斑計數(shù)來測定。吸附試驗表明：接種噬菌體中的35S與這種噬菌體特異地結(jié)合在一起，而這種噬菌體侵染過的細菌溶菌產(chǎn)物中的35S，表現(xiàn)出的行為更為復(fù)雜。它與既能吸附子代噬菌體也能吸附溶菌噬菌體的細菌牢牢地結(jié)合在一起；但與不能吸附這種噬菌體的細菌則結(jié)合得很微弱；它與能吸附溶菌噬菌體而不吸附子代噬菌體的細菌的結(jié)合情況，居于前二者中間。后面的測定表明：在子代噬菌體中沒有35S，而且還說明在早期溶菌產(chǎn)物中的35S沒有子代噬菌體的行為。污染有35S標記物質(zhì)的子代噬菌體吸附作用的特異性，顯然是由于溶菌噬菌體造成的，這種溶菌噬菌體吸附到菌株H上要比吸附到B/2上強烈得多，這可以從對它們各自的測定以及混合物上清液的Tyndall散射明顯降低（由于溶菌噬菌體引起）看出來。下列事實進一步證實了這個結(jié)論。（1）如果細菌經(jīng)35S標記噬菌體侵染，然后在潛伏期的中點附近只用氰化物溶菌（在低鹽肉湯中，防止35S再吸附到細菌碎片上去），這時高速沉降部分含有的35

S，只能微弱地、非特異性地吸附到細菌上去。（2）假定溶菌噬菌體和35S標記的侵染噬菌體是相同的（T2），或者假定在低鹽肉湯中的這種培養(yǎng)物能自發(fā)溶菌（因此能得到大量的后代），這樣，在高速沉淀物中的35S與子代噬菌體就能特異性地結(jié)合在一起（微弱的非特異性吸附除外）。表7中吸附到H和B/2h上去的情況說明了這一點。必須注意：一個從35S標記噬菌體培養(yǎng)得到的、而且或多或少有放射性的子代噬菌體與一個真正的35S標記的噬菌體，用已知的方法是不能區(qū)別的，只有通過吸附到抗噬菌體的細菌上去，才能把這種少量的污染物除去。除了已經(jīng)提到的這些性質(zhì)外，污染的35S能與噬菌體一起被抗血清完全沉淀，不管在高濃度還是低濃度電解質(zhì)中，用進一步分離沉淀的方法不能把它和噬菌體分離開。另一方面，這種來源的化學污染，在適宜環(huán)境條件下是很小的，因為一個噬菌體顆粒產(chǎn)生的子代是很多的，而污染物顯然只能來自親本。35S標記污染物的性質(zhì)表明，它是由親本噬菌體顆粒外殼的殘留物組成的，推測它和在Waring搗碎器中能夠從未溶菌細胞上除去的物質(zhì)是一樣的。它沒有發(fā)生化學變化，這是不足為奇的，因為它根本就沒進入被侵染的細胞。敘述的這些性質(zhì)說明，最初有關(guān)35S從親本噬菌體傳遞到子代噬菌體的報告（Hershey等，1951）是錯誤的。用32P標記的噬菌體做了和表6、表7所示相似的實驗，實驗結(jié)果表明：有30％的磷從親代噬菌體傳遞到子代噬菌體中去了，每個受侵染細菌產(chǎn)生約30個噬菌體，在過早溶菌的培養(yǎng)物中，32P幾乎全部都是不能沉淀的，而在成熟后溶菌的培養(yǎng)物中，32P事實上變成酸溶性的了。Putnam和Kozloff（1950）等人也發(fā)表了有關(guān)32P轉(zhuǎn)移的類似測定結(jié)果。Watson和Maal?e（1952）總結(jié)了這項工作，并報道了磷和腺嘌呤的轉(zhuǎn)移相等（接近50％）。35S標記的子代噬菌體幾乎沒有其親本的標記下列實驗清楚表明：從親代噬菌體傳遞給子代噬菌體的硫低于1％，還可能更少。作實驗的時候，在一個Waring搗碎器中，將35S標記的噬菌體外殼剝落下來，再從這樣的受侵染的細菌獲得噬菌體，直接測定其35S含量。在肉湯中培養(yǎng)的敏感菌，每個菌用5個35S標記的噬菌體顆粒來侵染，從分析目的出發(fā)，必須采用這種高比例的侵染。侵染了的細菌，去掉吸附的噬菌體，再懸在每升含有MgSO4

1mM、CaCl2

0.1mM、明膠1克的水溶液中。從這種懸液取樣，第一個樣品在Waring搗碎器中攪拌2.5分鐘，離心除去胞外的35S。第二個樣品放在搗碎器中，但不攪拌，在同樣的時間也離心。兩個樣品的細菌都重懸在保溫的低鹽肉湯中（濃度為108個細菌／毫升），通氣培養(yǎng)80分鐘。然后每毫升培養(yǎng)物中加入HCN0.02mM、紫外線殺死的T2噬菌體2×1011個、NaCl6毫克進行溶菌。在這時加入鹽，使35S不容易被洗脫（Hershey等1951），仍舊吸附在細菌碎片上。按前面敘述的方法分離和測定溶菌產(chǎn)物，結(jié)果見表8。在這兩種培養(yǎng)物的潛伏期測定受侵染細胞時，回收了全部加入的細菌。在離心分離前測出每個細菌產(chǎn)生的噬菌體產(chǎn)量，分別是270（剝落了噬菌體外殼的細菌）和200個。括號中的數(shù)字是從接近于本底的計算比率得到的。這些資料表明：剝落噬菌體外殼，能在不同程度上降低各個部分中35S含量，尤其是含有大量子代噬菌體的部分降低最為明顯，從最初所吸附同位素的大約10％降低到1％以下。這個實驗說明：在溶菌產(chǎn)物各