口腔免疫研究方法

關(guān)于口腔免疫研究方法第1頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三免疫熒光技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗蛋白質(zhì)印跡流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)研究的主要方法第2頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三一、免疫熒光免疫熒光概述免疫熒光基本原理免疫熒光基本操作免疫熒光技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用口腔應(yīng)用實例第3頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

1.概述

免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）又稱熒光抗體技術(shù)。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。該技術(shù)的主要優(yōu)缺點主要優(yōu)點：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。第4頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

2.基本原理

直接免疫熒光法：直接法是將熒光素標(biāo)記在抗體上，直接測定相應(yīng)抗原。標(biāo)記有熒光素的抗體與相應(yīng)的抗原反應(yīng)，在紫外光的照射下，用顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象。優(yōu)點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點：只能檢測一種抗原，靈敏度不高。第5頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

間接免疫熒光法：

間接法與間接ELISA相似，引入標(biāo)記二抗，可以檢測抗原，也可以檢測抗體。優(yōu)點：一抗可以結(jié)合多個標(biāo)記二抗，固靈敏度比直接法高。缺點：比直接法易出現(xiàn)非特異熒光。第6頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三免疫熒光原理示意圖第7頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3.免疫熒光實驗過程

細(xì)胞爬片（多聚賴氨酸處理，生長密度70-80%）細(xì)胞固定（合適的固定液，如4%甲醛溶液等）細(xì)胞膜穿透（TritonX-100等）封閉（3%BSA-PBS等）一抗孵育熒光二抗孵育胞漿/核襯染（鬼筆環(huán)肽/DAPI/PI）封片熒光顯微鏡拍照熒光抗體孵育第8頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三4.免疫熒光技術(shù)的相關(guān)應(yīng)用抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點型)抗核抗體(核膜型)①自身抗體檢測第八節(jié)口腔免疫學(xué)研究的主要方法第9頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三②病原體檢測細(xì)菌（藤黃微球菌）寄生蟲（猴胚腎細(xì)胞內(nèi)弓形蟲）第八節(jié)口腔免疫學(xué)研究的主要方法第10頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三③免疫病理檢測腫瘤（人肝癌細(xì)胞）第八節(jié)口腔免疫學(xué)研究的主要方法第11頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

5.口腔應(yīng)用舉例

天皰瘡患者病損部位自身抗體的檢測1.取天皰瘡患者靜脈血2ml，離心分離血清，-20℃保存。2.取正常皮膚做冰凍切片，加入FITC標(biāo)記的抗人Ig-G、IgA、IgM、C3作間接免疫熒光染色，出現(xiàn)亮綠色熒光為陽性，以顯示熒光的血清最大稀釋度作為抗體的滴度。第12頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三直接免疫熒光IgG

上皮棘層呈翠綠色漁網(wǎng)狀熒光第13頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三細(xì)胞免疫熒光技術(shù)組織免疫熒光技術(shù)直接法間接法小結(jié)第14頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三二、酶聯(lián)免疫吸附試驗ELISA的原理和基本特點ELISA的類型ELISA基本操作步驟數(shù)據(jù)處理結(jié)果判斷口腔應(yīng)用舉例第15頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三1.ELISA的原理ELISA是一種免疫測定（immunoassay，IA），其免疫學(xué)原理:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。其特點：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)的特異性高靈敏度：酶催化底物顯色的高效性，pg水平微量檢測定性定量檢測：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值第16頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2.基本類型

抗體測定法間接法檢測特異性抗體抗原測定法

直接競爭法檢測可溶性抗原雙抗體夾心法檢測可溶性抗原（改良雙抗體夾心法檢測可溶性抗原）應(yīng)用生物素-親和素雙抗體夾心ELISA法第17頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三間接法檢測特異性抗體顯色與待測抗體孵育與酶標(biāo)抗體孵育加入底物包被已知抗原第18頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三優(yōu)點:只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法操作簡單迅捷缺點：可重復(fù)性差通常用于抗體效價的檢測和某些疾病的早期診斷第19頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三雙抗體夾心法檢測可溶性抗原

雙抗夾心法改良雙抗夾心法第20頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三優(yōu)點：待測抗原需要≥2個抗原決定簇，所以適合大分子抗原的檢測，一般在分子量5000D以上；由于增加了一層抗體，提高了特異性檢測的靈敏度，尤其是改良雙抗夾心法；只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物就可以建立此法；重復(fù)性較好；缺點：操作復(fù)雜，費時費力第21頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

3.ELISA基本操作步驟

樣品的保存試劑的準(zhǔn)備固相載體包被加樣孵育(溫育）洗滌顯色和比色

注：每種ELISA試劑盒均有具體步驟說明第22頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

4.ELISA數(shù)據(jù)處理

根據(jù)standard的濃度和對應(yīng)的OD值計算出線性方程將所測定樣品的OD值代入方程計算出相應(yīng)的樣品的濃度第23頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三5.結(jié)果判斷定性實驗:

顯色反應(yīng)后，如液體顏色變成藍(lán)色則為陽性；仍為無色液體，則待測樣品為陰性。第24頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三定量實驗1.標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的OD值減去空白孔的OD值2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測樣品濃度根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及待測樣品的OD值可計算出待測樣品濃度。第25頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

6.口腔應(yīng)用實例

齦溝液中細(xì)胞因子的檢測齦溝液采集：去除待檢牙牙面牙石，隔濕，吹干牙齦并擦干牙面，用2mm×10mmWhatman3M濾紙條兩條，插入取樣部位的牙周袋內(nèi)，30s后取出(若血液和唾液污染，則棄置不用)，3min后在同一位點再次取樣，將兩條濾紙條作為一個標(biāo)本置于同一Eppendorf（EP）管中，用齦溝液測量儀測量齦溝液量，在EP管中加入200μlPBS-T，置于-70℃的冰箱內(nèi)保存。第26頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三ELISA方法檢測齦溝液中細(xì)胞因子（如IL-8/IL-4/TNF-α等）的濃度：將標(biāo)本于冰箱內(nèi)取出，室溫解凍，4℃離心后取上清備用。利用檢測試劑盒，ELISA檢測齦溝液中細(xì)胞因子的濃度。第27頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三用途：血清、血漿、細(xì)胞上清液、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中免疫炎性因子、抗原和抗體的檢測。小結(jié)第28頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

三、WesternBlot

簡介原理操作流程應(yīng)用口腔應(yīng)用舉例第29頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法1.簡介第30頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三2.WesternBlot基本原理蛋白質(zhì)混合樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）后分離為不同的條帶，其中含有能與特異性抗體相結(jié)合的待檢測的蛋白質(zhì)（抗原蛋白）。將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulosefiltermembrane，NC膜)，此過程稱為印跡，以利于隨后檢測反應(yīng)的進(jìn)行。然后，將NC膜與抗體一起孵育，使抗體（一抗）與待檢測的抗原決定簇結(jié)合（電泳分離的特異性蛋白條帶），再與熒光素、酶或核素標(biāo)記的二抗反應(yīng)，即可檢測出樣品中的待測抗原并能對其定量。第31頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

Westernblot原理

第八節(jié)口腔免疫學(xué)研究的主要方法第32頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三Anode-內(nèi)槽緩沖液帶有負(fù)電荷，與凝膠頂部接觸外槽中緩沖液帶有正電荷，與凝膠底部接觸Cathode+帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從上到下運(yùn)動（負(fù)極到正極），分開電泳進(jìn)程可以根據(jù)前沿指示劑來確定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止電泳小分子量蛋白跑的比較快.蛋白根據(jù)分子量大小分開蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，因此電泳時可以從負(fù)極向正極移動標(biāo)本加入到上樣孔中第33頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3.WesternBlot操作流程蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色第35頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

常用儀器

第36頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

4.相關(guān)應(yīng)用

基礎(chǔ)研究：目的蛋白的表達(dá)特性分析目的蛋白與其它蛋白的相互作用目的蛋白的組織定位目的蛋白的表達(dá)量分析

第37頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三臨床：在艾滋病病毒感染中，根據(jù)出現(xiàn)顯色線條的位置可以判斷有無針對病毒的特異性抗體，以此法作為確診試驗。使用印跡抗原來測定各種病人的抗體譜已經(jīng)直接作為臨床免疫檢驗的手段，被稱之為確認(rèn)試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”。

第38頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三5.口腔應(yīng)用實例基質(zhì)金屬蛋白酶-28（MMP-28）在口腔扁平苔蘚中的表達(dá)。取口腔扁平苔蘚患者口腔黏膜，所取新鮮標(biāo)本立即置于液氮中保存。將組織迅速加入預(yù)冷的裂解液中，充分剪碎后，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)一步震碎細(xì)胞，置于冰上裂解30min，4℃離心取上清，置于-20℃保存。采用改良Lowry法測定蛋白濃度。第39頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三取蛋白分別經(jīng)10%SDS、5%PAGE凝膠電泳后，抗原轉(zhuǎn)至NC膜。放入5%脫脂奶粉中封閉，PBS洗膜。加入一抗（鼠抗人MMP-28多克隆抗體）4℃過夜，洗滌后加入二抗（兔抗鼠IgG）37℃下孵育1h，DAB顯色，PBST漂洗，密度掃描并拍照。對MMP-28表達(dá)與OLP臨床參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。第40頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三為什么要作蛋白質(zhì)印跡實驗？

研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達(dá)差異性。小結(jié)第41頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三四、流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)概述流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和基本工作原理流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)檢測時的樣本制備流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用口腔應(yīng)用舉例第42頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

1.流式細(xì)胞術(shù)概述流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動的細(xì)胞或生物顆粒通過熒光標(biāo)記進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析和分選的技術(shù)，目前已在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的科研和臨床廣泛應(yīng)用。流式細(xì)胞儀（FlowCytometer，F(xiàn)CM)是集合光電子物理，光電測量技術(shù)，計算機(jī)技術(shù)，細(xì)胞熒光化學(xué)，抗體技術(shù)等現(xiàn)代高科技技術(shù)為一體的細(xì)胞測量和分析儀器。第八節(jié)口腔免疫學(xué)研究的主要方法第43頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞術(shù)最大的特點是能在保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞的狀態(tài)下，通過熒光探針的協(xié)助，從分子水平上獲取多種信號對細(xì)胞進(jìn)行定量分析或純化分選。流式細(xì)胞術(shù)的特點細(xì)胞不被破壞，測量快速、大量、準(zhǔn)確、靈敏、定性定量第44頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三采用激光作為激發(fā)光源，保證其具有更好的單色性與激發(fā)效率；利用熒光染料與單克隆抗體技術(shù)結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，保證檢測的靈敏度和特異性；用計算機(jī)系統(tǒng)對流動的單細(xì)胞懸液中單個細(xì)胞的多個參數(shù)信號進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，保證了檢測速度與統(tǒng)計分析精確性。

2.流式細(xì)胞儀基本工作原理第45頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀臺式機(jī)——FACSCalibur雙激光

488nm 635nm四熒光參數(shù)分選、濃縮系統(tǒng)第46頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三大型機(jī)——FACSVantageSE科研型八熒光參數(shù)高速分選多路分選第47頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三3.流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造（1）液流系統(tǒng)（2）光學(xué)系統(tǒng)（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第48頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三由樣本和鞘液組成待測細(xì)胞 單個細(xì)胞的懸液 熒光染料標(biāo)記的單抗對其染色受清潔氣體壓力 從樣品管進(jìn)入流動室形成樣本流鞘液：輔助樣本流被正常檢測的基質(zhì)液。主要作用是包裹樣本流的周圍，保持樣本流中細(xì)胞處于噴嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞噴孔。

（1）液流系統(tǒng)第49頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三InjectorTip熒光信號聚焦的激光光束鞘液流動室第50頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三FCM的液流系統(tǒng)（如何形成單個細(xì)胞流）樣本管鞘液管第51頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三激光光源：氣冷式氬離子激光器分色反光鏡：反射長/短波長，通過短/長波長光束成形器：兩十字交叉放置的透鏡透鏡組：形成平行光，除去室內(nèi)光濾片：長通、短通、帶通光電倍增管：FS,SS（散射光），F(xiàn)L1,FL2,FL3,FL4（熒光）（2）光學(xué)系統(tǒng)第52頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三光學(xué)系統(tǒng)第53頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三側(cè)向角散射（SSC,SideScatter）前向角散射光（FSC,ForwardScatter）激光束照射細(xì)胞時，光以相對軸較小角度(0.5°～10°)向前方散射的訊號用于檢測細(xì)胞等粒子的表面屬性，信號強(qiáng)弱與細(xì)胞體積大小成正比，細(xì)胞相對大小及其表面積。

激光束照射細(xì)胞時，光以90°角散射的訊號，用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，細(xì)胞粒度及細(xì)胞內(nèi)相對復(fù)雜性。第54頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三 測得的FS與SS信號通過計算機(jī)處理，可得到FS-SS圖，由此可僅用散射光信號對未染色的活細(xì)胞進(jìn)行分析或分選。此為血細(xì)胞分類的基本原理，但不能分析表面分子。淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞光散射測量最有效用途：從非均一群體中鑒別出某些亞群

第55頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三主要由計算機(jī)及其軟件組成（3）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)第56頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三4.流式細(xì)胞儀分析數(shù)據(jù)常見圖形

直方圖（HistogramPlot）適用于：單參數(shù)分析僅需要觀察某個熒光強(qiáng)度的變化第57頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三二維點陣圖（DotPlot）適用于雙參數(shù)分析人外周全血細(xì)胞雙參數(shù)散點圖第58頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

5.常規(guī)檢測時的樣品制備直接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備DNA熒光染色的樣品制備細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備微量全血法免疫熒光標(biāo)記的樣品制備第59頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三直接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備取1×106個細(xì)胞/100μl單細(xì)胞懸液。一份加入相應(yīng)量的FITC或PE標(biāo)記的特異性熒光直標(biāo)單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗，作為同型對照樣品。室溫下避光反應(yīng)15～30min。加入500μlPBS重懸成單細(xì)胞懸液上機(jī)檢測，陽性者表示有相應(yīng)抗原存在。第60頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備

取1×106個細(xì)胞/100μl，加入一抗混勻，置室溫下避光反應(yīng)30min。PBS洗滌細(xì)胞，離心沉淀棄掉上清液。用100μlPBS重懸細(xì)胞，加入FITC或PE標(biāo)記熒光二抗混勻，室溫下反應(yīng)30min。PBS再洗滌細(xì)胞，加入500μlPBS重懸成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測。第61頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

DNA熒光染色的樣品制備

將固定過的細(xì)胞離心棄上清液，用PBS洗滌。用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，每份為1×106個細(xì)胞/100μl。加入1000μlDNA熒光染料，室溫下避光染色15min后上機(jī)檢測。第62頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備

將10×的結(jié)合緩沖液用蒸餾水稀釋成為1×，冰育。懸浮細(xì)胞在低溫環(huán)境中，用PBS洗滌細(xì)胞。離心后棄上清，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞（細(xì)胞濃度為105～106／ml）。加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI于細(xì)胞懸浮液中，輕輕混勻。將試管置于冰上，避光孵育10分鐘后上機(jī)檢測。

第63頁，講稿共70頁，2023年5月2日，星期三

微量全血法免疫熒光標(biāo)記的樣品制備

微量全血直接熒光染色法取肝素或EDTA抗凝全血（100μl/份），置12×75mm專用塑料試管中。加入20μl特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗作同型對照，室溫下避光染色15min。置Q-PREP