第十三講蛋白質分子設計

一、抗體剪裁抗體的基本結構：四鏈結構四肽鏈：由2條重鏈（H鏈），2條輕鏈（L鏈）組成；結構域：IgG——H鏈4個，L鏈2個；抗體識別位點組成：由輕、重二鏈1個結構域的高可變區(qū)共同構成?？乖瓫Q定子互補區(qū)：抗體分子可變區(qū)的一些環(huán)狀肽段組成的?？乖砦豢贵w識別位點本文檔共31頁；當前第1頁；編輯于星期三\14點7分一、抗體剪裁人—鼠嵌合抗體的制備（思路）利用分子剪裁技術對抗體分子進行剪裁的成功實例——實驗英國劍橋大學的Winter等。將小鼠單抗的V區(qū)，換到人抗體分子的相應部位上，使小鼠單抗所具備的抗原結合專一性轉移到人的抗體分子上。單克隆抗體（單抗，McAb）？抗體剪裁的醫(yī)學價值與人McAb相比，小鼠McAb容易制備，抗原性強，但易導致人體過敏反應。將鼠McAb抗原結合部位轉移到人抗體上，達到與人McAb同樣的效果。抗體剪裁本文檔共31頁；當前第2頁；編輯于星期三\14點7分1、抗體的人源化新的挑戰(zhàn)：改造鼠源McAb基因，綜合人—鼠嵌合McAb的優(yōu)點；獲得特異性高、異源性小的，具有臨床應用價值的抗體。為何要人源化？相對于“人”雜交瘤細胞系統(tǒng)，“鼠”雜交瘤細胞生長快，產生抗體量大。鼠McAb用于人體，免疫原性和相對缺乏恒定區(qū)依賴的功能效應，使它的應用受到了一定的限制。改造的必要性：對鼠源McAb進行蛋白質工程改造，合成人源化單抗。Ab的作用（補充）：識別作用：特異性與抗原分子結合生物效應：調理作用、免疫粘聯(lián)、激活補體本文檔共31頁；當前第3頁；編輯于星期三\14點7分（1）鼠單克隆抗體恒定區(qū)的人源化將小鼠McAb恒定區(qū)用人抗體恒定區(qū)代替而拼接成嵌合抗體，既具有抗原結合特異性，又極大地降低了鼠單克隆抗體的異源性。改造策略和程序：①克隆鼠McAb可變區(qū)基因——從鼠雜交瘤提取mRNA→可變區(qū)基因cDNA文庫→表達載體→抗原特異性篩選→可變區(qū)基因；②選擇合適的人恒定區(qū)基因；恒定區(qū)基因比較保守，易于克隆獲得③重組載體的構建與表達抗體分子的糖基化和可變區(qū)的折疊、鏈內二硫鍵形成，以及重鏈和輕鏈相互作用形成正確的立體構象。常用哺乳類細胞表達系統(tǒng)本文檔共31頁；當前第4頁；編輯于星期三\14點7分CH3MouseHumanChimericCH3VHCH1VLCLCH2HCLC本文檔共31頁；當前第5頁；編輯于星期三\14點7分（2）人改型抗體（互補決定區(qū)移植）問題提出：人源化嵌合抗體的可變區(qū)仍具有抗原性。能誘發(fā)人產生抗小鼠抗體，導致過敏反應，需對人源化抗體的可變區(qū)再進行改造?？贵w可變區(qū)組成：互補決定區(qū)（CDR）和骨架區(qū)組成。CDR：識別抗原表位的區(qū)域，直接決定了抗體的特異性；骨架區(qū)——維持CDR構象骨架區(qū)序列及其立體結構較為保守，是嵌合抗體誘導人抗小鼠抗體的主要原因；將鼠McAbCDR移植到人McAb的可變區(qū)的骨架上，使人McAb獲得鼠McAb結合特異性，進一步減少異源性?；パa決定區(qū)移植的設計簡單地將CDR序列移植到人源抗體中，甚至完全喪失親和力。必須進行互補決定區(qū)序列與框架結構的移植設計。本文檔共31頁；當前第6頁；編輯于星期三\14點7分移植設計的原則將CDR序列和緊鄰兩側的骨架序列一起移植；對骨架區(qū)中影響抗原結合部位的aa殘基改為鼠源McAb的殘基；人McAb可變區(qū)序列的選擇：抗體可變區(qū)序列數(shù)據(jù)庫分析，選擇與鼠單克隆抗體同源性高的人源序列；保留可變區(qū)N末端aa序列，尤其是輕鏈可變區(qū)N末端序列。將人改型可變區(qū)基因與人lg恒定區(qū)基因連接，構成完整的人改型基因進行表達。本文檔共31頁；當前第7頁；編輯于星期三\14點7分2、抗體的小分子化改造小分子抗體？能與抗原結合的抗體小分子V區(qū)片段——稱~，具識別活性 主要包括4類

Fab抗體：酶水解法：用木瓜水解酶消化抗體可獲得2個Fab片段。2條肽鏈

基因工程方法：在Fab基因表達Fab片段的功能。H鏈和L鏈基因分別構建，在2個載體上，共轉染細胞，或者構建在一個載體上轉染細胞進行表達。

Fv抗體：Fv是由輕鏈和重鏈可變區(qū)組成的單價小分子，是與抗原結合的最小功能片段。2條肽鏈

分別構建含H和L可變區(qū)基因的載體，共轉染細胞，使之各自表達后組裝成功能性Fv分子；或在一個載體中H可變區(qū)和L可變區(qū)基因之間設置終止密碼子，分別表達2個小分子片段。單鏈抗體（ScFv）：將輕鏈和重鏈的可變區(qū)連接起來的抗體。1條肽鏈單價抗體的特點：優(yōu)點：分子量小，免疫原性弱、滲透力強，并可用于藥物導向、中和毒素等功能。缺點：無抗體C區(qū)，不能介導抗體的其他生物學效應。雙價抗體片段：利用單價抗體片段構建雙價單特異性抗體和雙價多特異性抗體。本文檔共31頁；當前第8頁；編輯于星期三\14點7分

3、雙特異性抗體（完整抗體）雙特異性抗體(BsAb)？也稱雙功能抗體或雜交抗體，為非天然抗體。2個抗原結合部位，具有不同的特異性化學結構上是雙價的，結合抗原的功能上是單價的；不同于天然抗體（在化學結構及功能上均是雙價的）BsAb具有雙特異性，能交聯(lián)2種抗原，可介導標記物與靶抗原結合（造影）。雙特異性抗體制備方法化學交聯(lián)雙特異性抗體：制備單價抗體，雙功能交聯(lián)劑交聯(lián)。細胞工程雙特異性抗體：通過細胞融合的方法制備雙特異性抗體。可將分泌單抗的雜交瘤與經免疫的脾細胞融合，或使兩種分泌不同特異性單抗的雜交瘤彼此融合?；蚬こ屉p特異性抗體：體外組裝表達分泌型的雙特異性抗體。藥物—靶細胞本文檔共31頁；當前第9頁；編輯于星期三\14點7分

4、基因工程抗體基因的表達概述：蛋白質的表達系統(tǒng)有很多，其中主要包括大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物類細胞、昆蟲細胞及植物細胞等表達系統(tǒng)?？贵w分子表達：常用大腸桿菌和哺乳類細胞。大腸桿菌：原核細胞表達系統(tǒng)。成熟的基因克隆、蛋白表達體系，具有繁殖迅速、易于操作控制等優(yōu)點。缺乏蛋白質加工系統(tǒng)，內源性蛋白酶易降解外源蛋白，內毒素導致人體熱源反應僅可用于表達抗體片段，如單鏈抗體等。難以表達完成的抗體哺乳類細胞：真核細胞表達體系，可完成正確的蛋白質修飾和裝配，更接近天然抗體，具有正常的生物活性；缺點是成本高，操作相對煩瑣。本文檔共31頁；當前第10頁；編輯于星期三\14點7分二、蛋白質關鍵殘基嫁接蛋白質之間相互作用，往往只有幾個非常關鍵的aa殘基對結合起到主要作用，并不是全部蛋白分子參與。思考——如何證明這一命題？基于這種情況，我國科學家來魯華教授課題組發(fā)展了一種“蛋白質關鍵殘基嫁接”的方法。成功地將EPO的關鍵殘基“嫁接”到一個結構完全不同的PH蛋白結構域上，ERPH1蛋白具有了和EPOR結合的功能。促紅細胞生成素(EPO)—受體(EPOR)相互作用，促進紅細胞的分化和成熟。來魯華教授北京大學化學學院長江特聘教授本文檔共31頁；當前第11頁；編輯于星期三\14點7分1987年開始從事化學與生物學的交叉研究，特別是生物信息學研究，在蛋白質結構預測及分子設計方面做過大量工作。近年的主要工作方向為蛋白質-蛋白質相互作用研究，發(fā)展了用于蛋白質-蛋白質相互作用定量研究的平均勢方法。有關蛋白質表面環(huán)區(qū)結構預測及蛋白質設計、基于結構的藥物設計等程序目前在國際上擁有900多家注冊用戶。

來魯華教授北京大學化學學院長江學者特聘教授，北京大學理論生物學中心常務副主任，分子動態(tài)與穩(wěn)態(tài)國家重點實驗室主任，國家杰出青年基金獲得者。來魯華，博士，教授1984年，本科畢業(yè)于北京大學化學系。1989年，在北京大學化學系獲博士學位。1998-1999年，美國加州大學伯克萊分校伯克萊學者。承擔過國家自然科學青年基金，國家杰出青年基金，攀登計劃（國家基礎研究重大計劃）項目，八六三項目等。國家自然科學三等獎1次，求是基金會青年科學家獎勵，中國科協(xié)青年科技獎等。發(fā)表論文近百篇，其中SCI收錄論文80余篇。頭銜學歷進修貢獻研究方向與興趣個人簡歷是自己的經歷！如何寫好，關鍵做好！詳細情況加附頁——略長江學者獎勵計劃：國家教育部與香港愛國實業(yè)家李嘉誠基金會本文檔共31頁；當前第12頁；編輯于星期三\14點7分本節(jié)小結天然蛋白質的剪裁，又稱蛋白結構的“中改”，是指在蛋白質中肽段或者結構域替換和拼接。蛋白質的立體結構是由結構元件組裝而成的，通過不同蛋白質之間結構元件替換和拼接。期望能夠轉移相應的功能和特性。本節(jié)主要通過抗體分子的拼接和改進進行了論述?？贵w的人源化（恒定區(qū)，CDR區(qū)）抗體的小分子化：雙鏈（Fab和Fv）、單鏈（Fab和Fv）、雙價抗體片段雙特異性抗體蛋白質關鍵殘基嫁接——實例（方法建立——來魯華教授）本文檔共31頁；當前第13頁；編輯于星期三\14點7分第四節(jié)蛋白質分子全新設計一、蛋白質分子全新設計的程序全新設計？：基于天然蛋白質結構，以及對蛋白質結構與功能關系的認識為基礎。根據(jù)期望的結構和功能來設計全新序列的分子。全新設計流程（7）確定設計目標生成初始序列結構預測構建模型對序列進行初步的優(yōu)化基因表達全新蛋白質結構和功能檢測進一步設計蛋白質設計一般都要經過反復多次設計一合成一檢測一再設計的過程。主要介紹三個環(huán)節(jié)→設計目標的選擇設計方法結構檢測本文檔共31頁；當前第14頁；編輯于星期三\14點7分1、設計目標的選擇蛋白質全新設計分類：（兩個方面）。功能設計和結構設計。重點和難點：結構設計。Why？設計思路：結構設計方面：從最簡單的二級結構開始，摸索蛋白質結構穩(wěn)定的規(guī)律。設計目標：在超二級結構和三級結構設計中，一般選擇天然蛋白質結構中一些比較穩(wěn)定的模塊。如：四螺旋束和鋅指結構等。功能設計方面：主要進行天然蛋白質功能的模擬，如：金屬結合蛋白和離子通道等。本文檔共31頁；當前第15頁；編輯于星期三\14點7分2、設計方法（3種）序列最簡化法：蛋白質分子全新設計的一種基本方法，理解蛋白結構形成的基本規(guī)律。盡量使設計序列的復雜性最小，一般僅用很少幾種氨基酸，從簡單到復雜設計的多肽序列具有一定的對稱性或周期性。。用來理解蛋白質的折疊規(guī)律，如：HP模型法（蛋白質折疊研究模型）。模板組裝合成法

（Mutter，1988）：其思路是將各種二級結構片段通過共價鍵連接到一個剛性的模板分子上，形成一定的三級結構。模板組裝合成法——繞過了蛋白質三級結構設計的難關，再通過改變二級結構中的AA殘基來研究蛋白質中AA間的長程作用力揭示蛋白質折疊規(guī)律，也是探索蛋白質全新設計規(guī)律的有效手段。自動設計方法——提高了設計的速度和效率，已發(fā)展多種方法。結合一定的規(guī)則和算法，由計算機完成設計。如：運用蛋白質反向折疊方法結合遺傳算法建立自動設計方法—Jones運用三維剖面技術結合遺傳算法發(fā)展的自動設計方法——來魯華等本文檔共31頁；當前第16頁；編輯于星期三\14點7分3、結構檢測（設計蛋白質）只有實踐檢驗，才能判斷設計是否與預想結構（結果）符合。檢測項目和方法：（一般從三方面）設計的蛋白質是否為多聚體排阻色譜法——判斷分子以幾聚體形式二級結構含量是否與目標符合CD法——檢測各二級結構的大致含量是否具有預定的三級結構。主要依靠NMR技術和熒光分析（下面介紹）；也可使用X射線晶體衍射技術分析。本文檔共31頁；當前第17頁；編輯于星期三\14點7分二、蛋白質結構的全新設計核心問題：如何確定一個既非常穩(wěn)定而又具有獨特的空間結構的序列?？朔幕菊系K：線性聚合鏈的構象熵。熵增（ΔS）？序列（正確）折疊的相互作用（力），必須超過（大于）構象熵。？設計時，使具有相互作用力的AA數(shù)目與強度達到最大。設計原則和經驗：Cys殘基形成二硫鍵的配對無法預測，一般都盡量少用甚至不用，特別是在自動設計方法中。序列完成預定折疊后，再引入二硫鍵來穩(wěn)定蛋白質的三級結構。色氨酸吲哚環(huán)具有生色性，與其所處環(huán)境有關，常以Trp做探針？Trp在天然態(tài)蛋白質分子內部，其熒光光譜發(fā)生藍移。（？）在全新設計中常引入Trp作為熒光探針以檢驗設計蛋白質的三級結構。下面介紹各級結構設計的原則從四個方面講述本文檔共31頁；當前第18頁；編輯于星期三\14點7分1、二級結構的設計（α、β、T）（1）螺旋的設計α螺旋的設計——研究較早而且研究得較多的結構。Why？由于a螺旋結構簡單，規(guī)律性強，在溶液中比較穩(wěn)定。設計指導原則（4個）：選擇氨基酸：形成α螺旋傾向性比較大的殘基，如：Leu、Glu、Ala和Met等；氨基酸排列：螺旋每圈平均3.6個殘基，設計的兩親性螺旋，其結構中形成一個親水面和一個疏水面，疏水性AA殘基應按3或4的間隔排列；氫鍵的指向：α螺旋中所有的氫鍵指向同一方向，沿螺旋軸形成一個由N端指向C端的偶極矩，因而設計α螺旋時，常使帶正電荷的AA殘基靠近C端，帶負電荷的AA殘基靠近N端；帽子結構：由于a螺旋兩端各有3個殘基的氫鍵能力未得到全部滿足，為穩(wěn)定a螺旋，常常在其兩端各加一個N帽和C帽。形成N帽的氨基酸殘基有Gly、Asn、Ser和Met等，形成C帽的有Gly、Ser、Arg和Gln等。本文檔共31頁；當前第19頁；編輯于星期三\14點7分（2）β折疊片結構設計β折疊片的設計比α螺旋困難。Why？β折疊片的氫鍵在不同的β折疊股間形成，由此β折疊片的形成與序列的“上下文”的關系更密切。單個氨基酸殘基平均形成的氫鍵數(shù)較螺旋中少，結構穩(wěn)定性較差。單條β折疊股結構不能穩(wěn)定存在。如何來研究？有了方法才能進行研究——模板組裝合成法

將序列固定在一個模板上，來研究其形成規(guī)律。β折疊片的設計原則：根據(jù)模型肽、全β結構、α/β結構蛋白質設計的經驗選擇形成β折疊片傾向性較大的氨基酸殘基(如Val、Ile、Tyr)使親水性殘基和疏水性殘基相間排列。本文檔共31頁；當前第20頁；編輯于星期三\14點7分（3）轉角的設計：轉角的作用：連接不同二級結構的常見單元，對維持各種二級結構的空間相對位置和穩(wěn)定蛋白質的三級結構起著重要的作用。不同類的轉角對每個位置的氨基酸殘基的二面角有一定的要求。二面角決定連接的兩個二級結構的空間關系。轉角設計的關鍵選擇合適的轉角類型。某些氨基酸殘基對蛋白質的二級結構有終止作用如：Pro和Gly是α螺旋的中斷者；Glu是β—折疊的中斷者；設計時可利用這些氨基酸殘基來終止和分隔不同的二級結構。本文檔共31頁；當前第21頁；編輯于星期三\14點7分2、超二級結構和三級結構的設計主要結構類別：α-α；β

-

β，β-發(fā)夾；三級結構；全蛋白。設計的重要問題（兩個）氨基酸選擇：根據(jù)AA形成二級結構的傾向性，選擇各二級結構片段的氨基酸殘基疏水中心的形成：最重要的一點就是考慮疏水中心的形成。螺旋—螺旋結構：很多跨膜蛋白中存在，是研究得比較多的超二級結構。序列有一個明顯的結構特征，即存在一個周期性重復的七肽例如：七肽abcdefg，其中a和d位置處于螺旋間的界面因而設計時應選擇疏水性氨基酸殘基，其他位置暴露的表面，應選擇親水的氨基酸殘基。本文檔共31頁；當前第22頁；編輯于星期三\14點7分β-發(fā)夾結構（另一種常見的超二級結構）合成β-發(fā)夾模型的重要性，Why？β-發(fā)夾在β-折疊片形成中具有成核作用。單獨β-發(fā)夾結構，不能穩(wěn)定存在，形成分子間β-折疊片才能穩(wěn)定。若能合成β-發(fā)夾模型肽，才能對β-折疊片中各種穩(wěn)定因素進行研究。β-發(fā)夾模型的設計與合成研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白B1結構域中的一個片段在水溶液中能夠折疊成單體的天然β-發(fā)夾結構。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，設計出了8個氨基酸殘基組成的具有β-發(fā)夾結構的模型肽。β-發(fā)夾設計的關鍵：β-轉角的設計，特別是選擇合適的轉角類型。本文檔共31頁；當前第23頁；編輯于星期三\14點7分三級結構的設計設計思路：模仿天然蛋白質中較穩(wěn)定的結構模塊。設計較難，但已有多個成功的設計實例，如：Richardson等設計的全β蛋白質—著名的

betabellin（β-桶），由前后兩個β-折疊組成，每個折疊由4股組成。

如：Goraj等設計的octarellin即(α/β)8。結構單元是turn-βstrand-turn-αhelix。構建的合成基因在E.coli中的表達

三級結構設計極為困難，為使結構更穩(wěn)定，設計中常引入二硫鍵或金屬離子。但Struthers等根據(jù)鋅指結構成功地設計了一個23肽ββα三級結構，不含二硫鍵，也沒有金屬離子，其結構通過NMR檢測證實。結構中同時包含了α-螺旋、β-折疊以及轉角，全部使用天然氨基酸。其重要意義——是第一個全自動設計的蛋白質。

是迄今為止幾個成功的三級結構設計實例之一。此外，F(xiàn)edorov等還進行了自然界不存在的全新結構設計的嘗試。在目前的設計中，CD譜計算的二級結構含量與目標基本相符，就算設計成功。正常折疊的問題本文檔共31頁；當前第24頁；編輯于星期三\14點7分全新蛋白設計局限性（對結構和功能關系——認識不足）對一些結構簡單、規(guī)律明顯的蛋白質分子的設計。其中最著名的例子——四螺旋束和β-筒結構。四螺旋束和β-筒結構是自然界中廣泛存在的結構類型，（穩(wěn)定的結構）例如：在細胞色素、蚯蚓血紅蛋白、煙草鑲嵌病毒外殼蛋白等多種蛋白質都含有相連的四螺旋束。為什么要設計這些蛋白結構，具有什么特點？結構非常穩(wěn)定，這些蛋白的同源性很小，具有相似的三維結構，因此，這些結構類型成為從頭設計的目標。Degrado等設計的四螺旋束從頭設計β結構簡要介紹這兩種結構科學研究的切入點和選材非常重要。本文檔共31頁；當前第25頁；編輯于星期三\14點7分四螺旋束結構設計——蛋白質全新分子設計的“里程碑”

Degrado等（杜邦公司）設計合成的四螺旋束結構：4段螺旋的序列完全相同，各由16個氨基酸殘基組成，螺旋之間的3段連接也完全相同，各由3個AA殘基組成，共74個AA殘基。。一級序列：

螺旋(helix):Gly-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Leu-Lys-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Lys-Gly

連接(loop)：Pro-Arg-Arg

肽鏈：NH-Met-Helix-Ioop-Helix-Loop-Helix-Loop-Helix-COOH設計構想一級序列設計，著重選擇了Leu、Lys和Glu三種殘基。其中僅Leu為疏水殘基，排布在螺旋內側，Lys和Glu為帶電荷殘基，排布在螺旋外側，螺旋的兩端各加上1個Gly，中斷螺旋，后面加上連接肽段。整個四螺旋束結構具有對稱性。相鄰螺旋反平行，螺旋軸夾角大約18度。疏水殘基在內部，極性殘基在表面，整個螺旋呈兩性。這個設計實例被譽為蛋白質分子設計的“里程碑”Degrado等設計的四螺旋束本文檔共31頁；當前第26頁；編輯于星期三\14點7分β折疊結構設計舉例β喇叭筒狀蛋白質由2個完全相同的β折疊片層組成，每一片層包含4條β-折疊股。前3條β折疊股各有8個殘基，最后一條由7個殘基，每一片層31個殘基。設計思想：考慮到形成β折疊的傾向性以及肽鏈之間的相互作用，選擇了Thr、Ser、Val、Leu、Ile和Ala等殘基。Thr和Ser是極性殘基，位于表面，以便與溶劑形成氫鍵；Val、Leu和Ile是疏水性殘基，構成β形成體；Ala體積小，有利于內部堆積。殘基位置排布，充分考慮了β鏈之間的成對效應，盡可能地安排疏水殘基與疏水殘基相對排列，帶異性電荷的殘基相對排列，帶有大支鏈的殘基與不帶支鏈的殘基相對排列，這樣的排布使得在肽鏈之間產生最強的相互作用。兩個片層依靠交聯(lián)分子連接在一起，形成了一個筒狀結構。從頭設計β結構本文檔共31頁；當前第27頁；編輯于星期三\14點7分三、蛋白質功能的全新設計模仿特定功能的結構域為基礎 ——進行蛋白質功能的全新設計。蛋白質結構決定蛋白質的功能。因而蛋白質功能的設計也離不開蛋白質的結構特點，目前，以特定的結構域模擬天然蛋白質的功能。最終實現(xiàn)人工設計功能蛋白。

設計思路——舉例本文檔共31頁；當前第28頁；編輯于星期三\14點7分螺旋—螺旋結構——模擬離子通道蛋白?！?/p>