冰凍切片的免疫熒光

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科試驗(yàn)室中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科試驗(yàn)室免疫熒光通用操作規(guī)程冰凍切片的免疫熒光1，OCT包埋，或灌流后的組織30%4℃過(guò)夜后，OCT包埋。-203月，-80℃長(zhǎng)期保存。請(qǐng)勿保存于液氮。2，10um2分鐘后，-20℃儲(chǔ)存3，切片從-2010-30分鐘以去除水汽，4%PFA15分鐘，或-20152小時(shí)4,1XPBS清洗玻片，3X5min從今請(qǐng)保持玻片潮濕3小時(shí)會(huì)得到更好的結(jié)果。為此請(qǐng)：選用穩(wěn)定的〔抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間選擇不同PH值的修復(fù)液〔A液枸鹽酸緩沖液PH6.0，B液EDTA-Na緩沖液PH8.0， C液枸鹽酸緩沖液PH4.5〕封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS胞因子，無(wú)需封閉的蛋白請(qǐng)用封閉液稀釋一抗8, 其次天Wash,1XPBS,2x1min9, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔dyelight)in封閉液，避光室1小時(shí)10, Wash,1XPBS,3x5min11, DAPI5min，12，DDWRinse1〔避開氣泡〕避光置于通風(fēng)櫥過(guò)夜石蠟切片的免疫熒光1，動(dòng)物組織取出后經(jīng)固定-脫水-包埋〔見隨后操作步驟)，制成石蠟包塊2，組織學(xué)染色切片厚度2um，免疫熒光染色切片厚度至少6um，切片復(fù)水： 58℃20min-xylene2x10min-100%EtoH2x10min95%EtoH2x10min-70%EtoH10min-，DDW5min4, Rinse玻片1xPBS,從今請(qǐng)保持玻片潮濕5，〔真空負(fù)壓.微波修復(fù).高壓修復(fù).隔水加熱.電爐加熱〕…關(guān)注修復(fù)的溫度，時(shí)間〔抗原修復(fù)時(shí)在有效的溫度范圍內(nèi)所持續(xù)的時(shí)間，抗原修復(fù)液必需…選擇不同PH值的修復(fù)液〔APH6.0，B液EDTA-Na緩沖液PH8.0，CPH4.5〕封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS胞因子，無(wú)需封閉的蛋白請(qǐng)用封閉液稀釋一抗，假設(shè)沒有二抗種屬來(lái)源的正常血清，細(xì)胞1%BSA封閉，同時(shí)肯定要有一個(gè)陰性比照。8, 其次天Wash,1XPBS,2x1min9, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔Dyelight)in封閉液，避光室1小時(shí)10, Wash,1XPBS,3x5min11,DDWRinse,DAPI5min，12，DDWRinse1〔避開氣泡〕避光置于通風(fēng)櫥過(guò)夜14，4℃保存?zhèn)渥ⅲ?多重?zé)晒馊旧瓌tA:盡量選擇不同種屬來(lái)源的一抗：可同時(shí)染B:假設(shè)種屬來(lái)源一樣的一抗：可順次染色，抗原修復(fù):O/N第一個(gè)一抗：4O/N,其次天對(duì)應(yīng)二抗@RT1hr紅光短暫地封閉其次個(gè)一抗：@RT2hr，對(duì)應(yīng)二抗@RT1hr綠光：DAPI封片備注： 比照試驗(yàn)A:陰性比照：組織免疫熒光必做一樣標(biāo)本：只加熒光二抗:排解非特異性染色B：陽(yáng)性比照：承受確定含有一抗對(duì)應(yīng)抗原的標(biāo)本TUNEL與免疫熒光共染時(shí)細(xì)胞的免疫熒光1，80%融合，倒掉細(xì)胞培育液2，Rinse，用固定劑rinse一到兩次4%15min，0.2%TritonX-1005-10min；或者選用不同的固定方式：〔orHPLC)-20℃10min丙酮〔HPLC〕-20℃10min4%多聚甲醛+0.2%TritonX-10010min4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min細(xì)胞核核膜15min+-205min細(xì)胞膜15min+-205min細(xì)胞骨架/微管蛋白℃10min+-201min細(xì)胞膜+胞漿蛋白+細(xì)胞核4,Wash,1xPBS,2x1min從今請(qǐng)保持細(xì)胞潮濕5,1小時(shí)封閉液：5%BSA+10%二抗種屬來(lái)源的正常血清in1xPBS條件封閉液：1%BSA+3%in1xPBS請(qǐng)用封閉液稀釋一抗7, 其次天Wash,1XPBS,2x1min8, 二抗，1:1000〔alexa系列〕1:300〔Dyeligh