免疫組織化學(xué)染色s技術(shù)

免疫組織化學(xué)技術(shù)的定義免疫組織化學(xué)技術(shù)(Immunohistochemistry,IHC)是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)的抗原（或抗體）的分布進(jìn)行定位、定性、定量檢測(cè)，經(jīng)過(guò)組織化學(xué)呈色反應(yīng)在組織原位顯示抗原（或抗體），如各種蛋白質(zhì)、多肽、磷脂和多糖等成分的一門(mén)新技術(shù)。武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)的應(yīng)用IHC通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面或細(xì)胞間的正常或異常的物質(zhì)，以研究組織細(xì)胞的正常生理、代謝及疾病的病因、發(fā)病機(jī)理，廣泛用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)，細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究，以及細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究等。武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)名稱鏈霉菌親和素-過(guò)氧化物酶連結(jié)法(Streptavidin-PeroxidaseConjugatedMethod,簡(jiǎn)稱S-P法)檢測(cè)胃癌組織CK／Vimentin的蛋白表達(dá)武漢大學(xué)病理教研室S-P法原理示意圖過(guò)氧化物酶鏈酶親和素生物素生物素化二抗特異性一抗待測(cè)抗原武漢大學(xué)病理教研室免疫組織化學(xué)基本實(shí)驗(yàn)流程組織、細(xì)胞標(biāo)本

抗原修復(fù)

阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

正常血清封閉

滴加特異性一抗滴加二抗

滴加三抗顯色復(fù)染封片

武漢大學(xué)病理教研室具體步驟如下：1．石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；2．所有組織均采用微波修復(fù)抗原；3．室溫冷卻后，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；4．滴加50μl過(guò)氧化物酶阻斷液（試劑A），37℃濕盒孵育10min；5．0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；6．滴加非免疫性動(dòng)物血清（試劑B），37℃濕盒孵育10min；武漢大學(xué)病理教研室7．甩去多余血清，分別滴加２種抗體，4℃濕盒孵育過(guò)夜，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；8．滴加生物素標(biāo)記的二抗（試劑C），37℃濕盒孵育15min，0.01MPBS（pH7.4）漂洗3×5min；9．滴加鏈親和素-過(guò)氧化物酶溶液（試劑D），37℃濕盒孵育15min，甩去多余液體；10．每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間（約為1-5min），自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染；11．常規(guī)脫水、透明、中性樹(shù)膠封片并鏡檢分析；12．陽(yáng)性對(duì)照采用已知陽(yáng)性片為標(biāo)準(zhǔn)，陰性對(duì)照采用PBS取代第一抗體，其余步驟相同。武漢大學(xué)病理教研室實(shí)驗(yàn)流程中的注意事項(xiàng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的滅活血清封閉沖洗抗體選擇及一抗孵育時(shí)間檢測(cè)及顯色系統(tǒng)復(fù)染武漢大學(xué)病理教研室染色前處理

－取材、脫水、浸蠟組織及時(shí)固定

固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林4%多聚甲醛常規(guī)下固定8-24小時(shí)取材厚度：2mm武漢大學(xué)病理教研室染色赴前處職理膏－預(yù)防笛脫片常選節(jié)用多眉聚耐傭氨酸?。╬毛ol謠y-今L-摘ly戶si璃ne慨）注意鋒：1溜）應(yīng)茅嚴(yán)格候控制受使用君次數(shù)2）苗玻片木潔凈檢度武漢老大學(xué)充病理匯教研縱室染色鼓前處冤理思－包埋臺(tái)與切鄭片包埋綠：選市擇低夕熔點(diǎn)蒙石蠟嗓，溫寧度不到超過(guò)慮62娃℃切片受：厚暗度3-悲4μ幼m烤片紙：溫弟度6爽0℃拉，時(shí)熟間1停小時(shí)跌；或倦60府℃2煩小時(shí)改（邁爹新）訪；或蠟60劇℃過(guò)待夜武漢額大學(xué)臭病理刻教研若室染色漆前處員理仔－切片酸保存切片男不宜納長(zhǎng)時(shí)變間在軟常溫遮下保祥存武漢鍋大學(xué)嶄病理孟教研稿室染色沖前處凝理劍－脫臘原則朋：免以疫組職化的智脫蠟由試劑濤應(yīng)與寺常規(guī)侄HE脫蠟觀分開(kāi)武漢宏大學(xué)梅病理味教研歲室實(shí)驗(yàn)毯操作點(diǎn)中的大應(yīng)用抗原飛修復(fù)實(shí)驗(yàn)孕操作折中的湯注意鋤事項(xiàng)武漢孟大學(xué)是病理馬教研興室抗原趟修復(fù)影響癢染色球結(jié)果迎的最水關(guān)鍵贈(zèng)因素抗原甜修復(fù)雷方法結(jié)分類1）每酶消拾化法2）胃加熱顏法（戀高壓絕法?者水煮宜法?矛微波宮法）抗原艘修復(fù)瓣液的假選擇1）率檸檬掀酸鹽姑緩沖培液（爐）2）蒸Tr鴿is屯（P雁H持7-貌8）3）觸E削DT縫A（伯PH遙8夫.0葉）武漢利大學(xué)執(zhí)病理剃教研誘室內(nèi)源院性過(guò)濁氧化洗物酶乞的滅舒活存在購(gòu)部位趙：紅隔細(xì)胞聽(tīng)、橫許紋肌握細(xì)胞謎、粒王細(xì)胞抬、單核旦細(xì)胞絹、肝托細(xì)胞添及腎億細(xì)胞消除撤方法稅：3說(shuō)%蠻H2O2浸泡釣10秒分鐘武漢跪大學(xué)斗病理稱教研仿室血清醒封閉目的卸：減吸少非秒特異憶性著旬色時(shí)間如：一館般在蠅加載至一抗跨之前墊使用武漢變大學(xué)取病理姐教研劑室沖笑洗一般羽采用廊PB丑S（蔥）充伴分沖罪洗增加題效果更可昌加入蘭Tw醒ee俘n2邪0武漢升大學(xué)與病理帽教研邀室一抗課孵育寧時(shí)間您及抗來(lái)體選受擇應(yīng)選傘擇信閥譽(yù)高存、質(zhì)謀量好畏的試烘劑公盤(pán)司抗體妻切忌擱反復(fù)繞凍融一抗噸為濃唇縮液悔時(shí)，師需選芽擇最棄佳稀起釋濃嬸度按說(shuō)嘴明書(shū)毛可采柔用拿37斬℃放1-傲2役小時(shí)膛或閃4℃毒冰耀箱過(guò)嚇夜武漢呆大學(xué)亡病理匠教研輕室檢測(cè)務(wù)及顯渣色系夢(mèng)統(tǒng)一般荒采用四以生葛物素維標(biāo)記嗓的辣辛根過(guò)鉛氧化靜物酶資為基賣(mài)礎(chǔ)的憑檢測(cè)田方法巴。如S談P、競(jìng)LS俗AB孝C、汗AB肅C等顯色犧方法備：經(jīng)創(chuàng)常采胡用辣市根過(guò)彈氧化偶物酶煙系統(tǒng)飼檢測(cè)武漢乒大學(xué)貪病理瀉教研朝室顯色磁系統(tǒng)常用枕的酶1.勞辣根霸過(guò)氧畜化物守酶(克HR動(dòng)P)A:叛顯色培底物假DA裕B-極--亂--倉(cāng)棕黃舊色敏感縮慧度高換、定抬位清絨晰、搖易于危觀察危、保技存B:揮顯色手底物枝AE挽C-生--設(shè)--陶磚紅份色2.由堿性喪磷酸紙酶(即AP踩)顯色江底物巡壽:B繩CI籌P/輛NB弊T-葉--供-藍(lán)占紫色武漢予大學(xué)府病理蠶教研閘室復(fù)嘆染原則魄：注柄意兩庫(kù)者之興間對(duì)渴比，視突出叉陽(yáng)性默信號(hào)武漢啦大學(xué)腫病理紋教研務(wù)室實(shí)驗(yàn)渡對(duì)照減設(shè)計(jì)原則鄉(xiāng)豐：所典有檢跟測(cè)指物標(biāo)均臣設(shè)陽(yáng)瓦性對(duì)距照、跪陰性蚊對(duì)照武漢墨大學(xué)鋼病理浙教研晃室結(jié)果清分析1.撕特定鞭的定貫位胞膜徹型、移胞漿惰型、艱全漿輔型或躁胞核遠(yuǎn)型，疤局限器性或疫彌散剃性。2.辭染色進(jìn)的不沒(méi)均一吉性陽(yáng)性榴切片煩的染吸色應(yīng)蒙分布茶不均怒，片控狀或襪點(diǎn)狀疼散在傘分布雅；染掀色強(qiáng)互弱也羞不等緣瑞，顏蘋(píng)色深阻淺反際映抗始原量扛的多耀少。武漢萬(wàn)大學(xué)輪病理解教研