實驗二葉綠體的分離與熒光觀察

關(guān)于實驗二葉綠體的分離與熒光觀察第1頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三實驗?zāi)康?.通過植物細胞葉綠體的分離，了解細胞器分離的一般原理和方法。2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。第2頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三實驗原理細胞器分離的過程包括兩個主要階段：破碎細胞和細胞組分的分離在等滲溶液中進行組織勻漿、分離葉綠體的分離采用差速離心或密度梯度離心法進行利用熒光顯微鏡觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光（次生/誘發(fā)熒光）第3頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三常用的細胞破碎方法方法技術(shù)

原理效果成本舉例機械法勻漿法細胞被攪拌器劈碎或受剪切力而破碎適中適中動植物組織或細胞研磨法細胞被研磨物磨碎適中便宜植物組織超聲波法用超聲波的空穴作用使細胞破碎劇烈昂貴細胞懸浮液小規(guī)模處理珠磨破碎法細胞被玻璃珠或鐵珠搗碎劇烈便宜細胞懸浮液和植物細胞大規(guī)模處理化學(xué)法滲透沖擊滲透壓破壞細胞溫和便宜血紅細胞的破壞酶消化法細胞壁或細胞膜被消化，使細胞破碎溫和昂貴動植物細胞增溶法表面活性劑溶解細胞膜溫和適中破碎大腸桿菌脂溶法有機溶劑溶解細胞壁適中便宜甲苯破碎酵母細胞堿處理法堿的皂化作用使細胞壁溶解劇烈便宜破碎大腸桿菌第4頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三離心分離技術(shù)離心是分離細胞組分和生物大分子最常用的分離方法，因為不同的細胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力不同介質(zhì)沉降分離。分離各種細胞組分的方法主要有：差速離心密度梯度離心速率-區(qū)帶梯度離心等密度離心第5頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三差速離心主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取第6頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三密度梯度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞勻漿液混懸或置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞器分層、分離的方法。這類分離又可分為速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心兩種。優(yōu)點是一次離心可分離提純樣品中幾種組份，用于較精細的分離。第7頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三速率-區(qū)帶梯度離心和等密度梯度離心原理：根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同，通過離心力場的作用，使不同的顆粒在密度梯度層內(nèi)形成一系列區(qū)帶，從而達到彼此分離的方法。A、速率-區(qū)帶梯度離心流程圖B、等密度梯度離心流程圖原理：根據(jù)不同顆粒在密度梯度介質(zhì)中存在著浮力密度差，在離心力場作用下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直移動到與它們各自的密度恰好相等的位置上形成區(qū)帶，從而使不同浮力密度的顆粒得到分離的方法。第8頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三兩種密度梯度離心方法的異同

特點速率-區(qū)帶梯度離心等密度離心分離方法的主要依據(jù)主要依賴分離的粒子在梯度液中沉降速度的不同依賴于樣品顆粒的不同密度來進行離心分離的

介質(zhì)密度梯度選擇最大密度必須小于樣品中粒子的最小密度；梯度平緩覆蓋了待分離物質(zhì)的密度；梯度陡度較高離心介質(zhì)的主要作用減緩顆粒擴散速度阻止顆粒移動；篩選與分離顆粒分辨率范圍沉降系數(shù)相差～20%的物質(zhì)顆粒密度差異大于1%離心后區(qū)帶形成位置易變(樣品易擴散）不變（樣品不擴散）影響樣品區(qū)帶形成的主要因素離心時間（過長或過短都不利）顆粒樣品密度一般操作方法介質(zhì)梯度應(yīng)預(yù)先形成，離心前將樣品小心鋪放在密度梯度溶液表面，離心后形成區(qū)帶。介質(zhì)梯度不需預(yù)先制備，離心時把密度均一的介質(zhì)液和樣品混合后裝入離心管，通過離心自形成梯度，讓顆粒在梯度中進行再分配。常用介質(zhì)蔗糖、甘油蔗糖、甘油、CsCl、硫酸銫、溴化銫、三碘苯衍生物等。第9頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三表1:各種亞細胞構(gòu)造在不同的離心介質(zhì)中分離所需的離心力與時間

結(jié)構(gòu)

差速離心(在0.25M蔗糖溶液中)速率-區(qū)帶梯度離心(5～50%蔗糖)

等密度離心(其他介質(zhì),如CsCl等)

細胞核800-1000g×10min500g×10min4000g×60min

線粒體10,000g×20min5000g×10min80000g×100min

溶酶體10,000g×20min5000g×10min80000g×100min質(zhì)膜(大片)100,000g×15min～100,000g×100min～150,000g×600min內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段150,000g×40min1000g×20min100,000g×200min微粒體100,000g×60min10,000g×30min100,000g×360min小顆粒100,000g×60min第10頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三各種細胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

圖:各種細胞器、大分子和病毒的密度及相應(yīng)的沉降系數(shù)

根據(jù)1924年Svedberg（離心法創(chuàng)始人--瑞典蛋白質(zhì)化學(xué)家）對沉降系數(shù)下的定義：顆粒在單位離心力場中粒子移動的速度。以每單位重力的沉降時間表示，并且通常為1～200×10-13秒范圍，10-13這個因子叫做沉降單位S,即1S=10-13秒看圖思考：要將細胞勻漿液中的得到更純的分離，選用哪種離心方法較好？(線粒體:1.18g/ml、溶酶體:1.12g/ml、微體:1.23g/ml)第11頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三離心力與離心機轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)換公式：圖2:離心力與離心機轉(zhuǎn)數(shù)的轉(zhuǎn)換列線圖RCF＝1.118×10-5×r×(n)２

(×g)式中,RCF表示相對離心力,單位是重力加速度g（980厘米/秒2）,(×g)表示重力加速度的倍數(shù),r為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，指離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，單位為厘米；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。為了便于進行轉(zhuǎn)速和相對離心力之間的換算，人們在此公式的基礎(chǔ)上制作了離心力的列線圖。見圖2.先在離心機半徑標尺上取已知的離心半徑和在轉(zhuǎn)速標尺上取已知的轉(zhuǎn)速，然后在這兩點間取一條直線，與中間RCF標尺上的交叉點，即為相應(yīng)的相對離心力數(shù)值，也是文獻中常用的×g。

r=8cmn=15,000rpmRCF≈20,000×g第12頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三熒光熒光顯微鏡觀察熒光現(xiàn)象：某些物質(zhì)在一定短波長的光（如紫外光）的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時，就能在極短的時間內(nèi)放射出比照射光波長更長的光（如可見光），這種光就稱為熒光。若停止供能，熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光,稱為自發(fā)熒光。如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，稱為間接熒光。如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。第13頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三1.兩組光源:透射照明光源(鹵素?zé)?；熒光光源(超高壓直流汞燈或氙燈)；2.有特殊的濾光片:激發(fā)濾色片和阻斷濾片3.激發(fā)光波長：較短，因此，分辨力高于普通顯微鏡；4.熒光光源照明方式：通常為落射式。紫外光(UV)：激發(fā)光譜區(qū)域：330-400nm;

紫光(V)：激發(fā)光譜區(qū)域：395-415nm;

藍光(B)：激發(fā)光譜區(qū)域：420-485nm;綠光(G)：激發(fā)光譜區(qū)域：460-550nm；熒光顯微鏡的特點：圖：落射式熒光顯微鏡的光路第14頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三熒光染料:吖啶橙(acridineorange)吖啶橙是一種與DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料在紫外光或藍光(330～485nm)激發(fā)下，DNA可被激發(fā)出530nm的熒光發(fā)射峰(細胞核發(fā)亮綠色熒光)，RNA可被激發(fā)出640nm的熒光發(fā)射峰(核仁和胞質(zhì)RNA發(fā)桔紅色熒光)。產(chǎn)生兩種不同熒光是由于吖啶橙與雙鏈DNA

和單鏈DNA或RNA的結(jié)合方式和結(jié)合量不同而決定的。DNA是高度聚合物，它與DNA結(jié)合是潛入雙鏈之間，結(jié)合量相對少；而與單鏈DNA或RNA的結(jié)合則由靜電吸引堆積在磷酸根上，結(jié)合量相對多些。我們推測，葉綠體的次生熒光的來由，大部分來自葉綠體的吸附作用，極少部分來自葉綠體中的RNA.第15頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三加入吖啶橙后葉綠體的自發(fā)熒光（火紅色）消失了？原因：是熒光淬滅現(xiàn)象所致。吖啶橙是一種芳香雜環(huán)陽離子型染料，可透過細胞膜，因此而推測吖啶橙陽離子是進入葉綠體膜內(nèi)通過影響葉綠素分子的結(jié)構(gòu)或所處的化學(xué)環(huán)境使自發(fā)熒光淬滅的。熒光淬滅：在產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的溶液中加入鹽等物質(zhì)會使溶液的吸光度下降而熒光強度變小的現(xiàn)象。

熒光淬滅現(xiàn)象產(chǎn)生原因：分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)環(huán)境是影響物質(zhì)發(fā)射熒光和熒光強度的重要因素（pH、溫度、光、淬滅劑）.第16頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三

實驗用品材料：菠菜葉片試劑：蒸餾水，0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(AO)

儀器：普通離心機，組織搗碎機，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，鑷子，培養(yǎng)皿，紙，移液管，滴管，燒杯，無熒光載片，蓋玻片，離心管,吸水紙等配制方法：稱取0.1g吖啶橙加蒸餾水100ml做干液，放冰箱備用，臨用前取1ml干液加1/15mol/L磷酸緩沖液（pH4.8）9ml。第17頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三菠菜葉片(去葉脈)3g

→0.35mol/L氯化鈉15ml→研磨(冰浴)→勻漿過濾(2層尼龍網(wǎng))→濾液在1000rpm離心2min→棄沉淀，上清液3000rpm離心5min

→去上清液→沉淀為葉綠體(混有部分細胞核)，用0.35mol/L氯化鈉溶液懸浮

→滴片觀察取葉綠體懸液1滴置于載玻片上，加蓋玻片后用分別用普通光學(xué)顯微鏡觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光顯微鏡觀察自發(fā)熒光將葉綠體懸液滴在無熒光的載玻片上,再滴加1滴0.01%吖啶橙熒光染料，蓋上無熒光的蓋玻片,使用熒光顯微鏡觀察間接熒光取葉表皮臨時裝片熒光染色觀察

實驗步驟第18頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三實驗結(jié)果普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖型，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色顆粒，即基粒。熒光顯微鏡下，選用藍色激發(fā)濾光片，葉綠體自發(fā)熒光為火紅色，間接熒光為桔紅色。細胞核呈黃綠色。圖：葉綠體自發(fā)熒光為火紅色第19頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共23頁，2023年5月2日，星期三葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉)中進行,以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。分離過程最好在0~5℃的條件下進行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。離心機使用：離心管要平衡熒光顯微鏡使用熒光顯微鏡檢要在光線盡量暗的環(huán)境下進行使用熒光顯微鏡時要注意不要直接觀察激發(fā)光源，保護眼睛凡是熒光染料都有一定毒性，請