第十三章 聚合酶鏈式反應CR

第十三章聚合酶鏈式反應

(PCR)1第一節(jié)聚合酶鏈式反應(PCR)PCR是一種選擇性擴增目的DNA(或RNA)的方法.2一、PCR的基本原理和反應過程1.PCR的基本原理原理:DNA的變性、復性、半保留復制。2.PCR的基本過程基本過程:變性、退火、延伸三個基本反應步驟3①變性:DNA高溫變性，加熱至90－95℃并維持一定時間，使雙鏈DNA氫鍵斷裂，解離成為單鏈，成為模板。

4②退火:變性DNA分子在溫度降至適當時，重新形成雙螺旋結構，該過程稱為退火。在PCR過程中,當溫度降至45-55℃時，單鏈DNA模板與人工合成的引物DNA結合.5③延伸:當PCR溫度升至70-75℃度時，在加入的DNA聚合酶的催化作用下，體系中的4種游離的dNTP遵循堿基互補原則，按引物5'→3'方向合成模板DNA新的互補鏈。6高溫變性低溫復性適溫延伸95℃55℃72℃78整個PCR過程一般需要30次循環(huán)，從理論上講能將目的DNA擴增230倍，約為109倍.PCR的平均擴增效率約為75%～85％，完成一次循環(huán)需2-3分鐘，經過n次循環(huán)后擴增的倍數(shù)約為(1+75%)n。2-3小時就能將目的DNA擴增幾百萬倍。9二、PC虧R的特楊點⒈特異絮性強問擴增亮的目只的DN邁A，可失以是DN烘A混合窗物中肅的某寧個特脅定分斑子，傭也可游以是DN塘A大分宿子的梨某段恰特定品序列10⒉靈敏坑度高皮應用PC隆R技術件可以宅對一綱根毛守發(fā)、擔一滴沿血、北甚至霞一個種細胞盟中得反到的DN趙A片段診進行原擴增需、分誘析和陡鑒定程。在氣病毒漆學檢之測中吵，PC厘R的靈樣敏度桃可達3個RF通U(空斑歉形成代單位)；在摟細菌煩學檢愧測中鞠，PC廟R的最帥小檢坐出率克為3個細考菌。11⒊簡便戲快捷PC科R技術卵使用劑的是州耐高膀溫的Ta鄭qDN煌A聚合懷酶，牙且已受有各告種PC錫R擴增桃儀供包應。夏只需攪將反李應液報一次濃性地幼加好涼，然逆后設裁置一嬸定程過序，嫩即可勾在DN講A擴增冊儀中橋進行變性-退火-延伸反應盞，一戚般在2-姥4小時議就能席完成12⒋對樣賀品要缸求低奶病毒蹄細章菌澤培養(yǎng)涂細胞仍，其DN遣A或RN購A粗制酷品均單可作握為擴贏增模洪板。醉擴增蔥樣品嘉可以宴是新蒸鮮的諷，也重可以叫是陳雜舊的否；可絹直接李用臨障床標雄本進漸行擴喪增，循如血佳液、蓮體腔飛液、途洗嗽違液、俘毛發(fā)勤、細殼胞、岔活組挺織等臺。13三、PC漲R的體議系組餡成和扮反應隊條件（一捏）體貼系組臣成:模板鉛（目呢的DN峽A(盤RN灶A)）耐熱DN遲A聚合既酶寡核災苷酸僵引物原料:dN匯TP緩沖背液和Mg文Cl2反應調體積千一般暫選用50進-1友00寶μl141.引物:決定PC很R的特軋異性PC廁R產物偽的特墨異性異取決奴于引千物與彎模板DN蛙A結合云的特姨異性組。故伙引物核設計笛在PC退R技術芒中十腸分重低要。PC曉R擴增暮的是狹一個勒雙鏈作目的DN瞎A，所噴以需設要兩違條引隸物，閑分別擁與目每的DN柏A的兩途股鏈衣的3’端互依補。引物騙合成燈方法:化學顫的方窄法合毅成，原則倦如下陳：15⒈引物樓長度隆合適:不少惰于15個核額苷酸跑，一密般為15－30個核與苷酸⒉引物艙堿基握組成碑與分胖布隨爪機:種AT蛇CG隨機判分布,避免5個以生上嘌鐘呤或烤嘧啶匪串聯(lián)趴排列,C機+G含量托以40戰(zhàn)%-海60修%為宜16⒊兩豎條引酷物的塞堿基勾組成角一致:堿基護組成委影響翁退火食溫度其，兩肉條引部物的施堿基壇組成尿一致陸，可捆以確咳保適震用相踐同的唯退火輝溫度⒋引懇物內盾部避苗免出霞現(xiàn)二謠級結據(jù)構:引物話自身狀互補昏序列遺不能爽超過3b恭p，以吸防止駱形成悄莖環(huán)鉤結構17⒌引物串之間裝不應類互補:特別樂是3’端的溪互補竿，否期則會股形成販引物槐二聚思體⒍引物3’端喉堿基洲要求淺嚴格班配對:特別圈是最損末及摔倒數(shù)供第二氧個堿乎基,以避翼免因朽末端永堿基妨不配植對而痰導致PC紐奉R失敗18⒎引娛物的5’端可屈以修滾飾:引物5’端不領互補劫不影醉響PC理R，可針以修辨飾，俗包括比加接插限制歡酶識或別序曉列或京密碼煎子序燦列，泄引入極突變浩位點缸或末紹端標太記⒏引槍物應曬嚴格俱特異:為防保止非自特異旨性擴豈增，毫引物刪與樣驗品中桐的其詞他序列列應訂無明勾顯同蘋源性脂，一進般同削源性投不超滾過70午%。19⒐引物頑量合她適雙在PC端R體系還中，赴每條朱引物嘉的濃因度應盾為0.稍1-莖1μ潛mo格l或10齊-1懂00浴pm為ol。引抱物濃略度過遷高會蔥引起講錯配面和增網(wǎng)加引包物之建間形賞成二逐聚體透的機稈會，濕發(fā)生捉非特橋異性宗擴增采。⒑引物易質量柱好:需要畝純化攔，聚分丙烯勿酰胺檔凝膠座電泳淘法或禿反向暴高壓威液向俊層析割法。20㈡酶及姨其濃餅度Ta填qDN指A聚合柔酶是從火水生居棲熱托菌(Th吉er臨mu誘saq妖ua繼ti維cu蛛s，Ta架q)分離眾出來璃的，街故Ta晴qDN待A聚合香酶有鋪良好舞的熱牙穩(wěn)定笛性，暮在92并.5螞℃、95紗℃和97正.5竊℃下的場半衰燈期分棟別為13靜0、40和5－6分鐘除。其浮催化DN葉A合成泳的活網(wǎng)性可困適應雜相當縮慧寬的零溫度帶范圍咐，但境在75塌℃－80逼℃活性萌最高構，降賠低溫宋度則慢擴增進效率資隨之櫻降低病。21特點：①以DN婚A為模拿板，dN娛TP為底核物，尿與目偉的DN米A結合妨的引陽物的3’端為吃起點攀，遵爭循堿蓋基互諷補原嶼則，睬按5’淚→3'的方瞞向合萌成DN瞞A新鏈胞。②有5'怖→3圾'外切戴酶的茫活性械，但妹無3'畫→5炭'外切健酶的交活性諒，所蘭以沒趕有校潤對功孔能，凡其錯鑒誤率紅為0.森25節(jié)%，即善擴增亭產物敢中每40假0個堿團基可蓬能出叮現(xiàn)一稿個錯威誤摻什入的給堿基惠。22③具毯有反漏轉錄研酶活碌性，認可直敏接用禍于從RN員A擴增cD賺NA，使RT懼-P液CR技術雄簡化撤，但命該活膏性依毀賴Mg2+或Mn2+。④具左有類衰似末蟻端轉覽移酶硬的活豎性，霧可在迎新合頃成鏈管的3'端加沙上一富個不慕依賴烈模板摟的核延苷酸儲，而椅且優(yōu)裳先加封接dA維TP，利優(yōu)用這合一性競質可獸以構緊建載劫體,克隆機帶dA廈TP尾的PC兵R產物遞。23濃度益：催化愛一典絞型的PC訴R所需疤酶量鄉(xiāng)豐約為2.榆5U馳(指總旺反應路體積忽為10句0μ吊l時)，濃是度過帥高可父發(fā)生甘非特墓異性核擴增悠，濃坊度過弟低則蠢降低游擴增嶼效率妖。24㈢dN垃TPdN嶺TP是PC蒜R的底脫物，纏其濃叼度、蝴比例閉和質齊量與集反應關密切詳相關痕：濃滴度應膀根據(jù)乓靶序蠢列的幟長度優(yōu)和組施成確缺定，禁一般坐在20傅-2佛00資μm便ol調/L之間慈，并籠且4種dN智TP的摩箭爾濃用度要棄相等掌。過高穴反殖應速牽度饒堿基盒錯配相率過低罰反貞應的露準確堡性粒擴衣增效雞率25㈣待擴梢增樣壁品PC嘴R的樣妹品可奸以是DN導A或RN繪A如為RN轎A時，據(jù)應先擾逆轉肺錄生秤成cD歐NA，然夸后再賓進行講正?；畹腜C綢R循環(huán)病原名體標召本：拴如病僅毒、也細菌螞、真太菌、天支原騙體、盆衣原狼體、壯立克蔑次氏杏體等臨床部標本茄：如沙細胞蒼、血尊液、攔尿液梢、分貸泌物右、羊貓水等法醫(yī)笑學標晉本：貨犯罪叉現(xiàn)場打的血外跡、根精斑職、毛概發(fā)等考古框標本根：26㈤Mg2+濃度Mg2+可以航影響骨解鏈俊溫度城、退漸火溫陸度、珠影響得酶活武性、美產物剪的特負異性付、引降物二磁聚體罰的形裝成等一般斜在0.宮2－2.秀5m絹mo遵l/聲L之間挨，常見用1.詳5m屋mo拆l/齊L。27組成量10×擴增緩沖液10μl4種dNTP混合物各200μmol/L引物各10-100pmol模板DNA0.1-2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L加雙或三蒸水至100μlPC賤R體系棟組成28（二煩）反誦應條福件1.反應曲溫度襲與時起間①變性迫溫度濱與時天間：95班℃、30秒鐘頂或97獅℃、15秒鐘巡壽（拿第一辱次變圍性5～7分鐘飯）②退火奴溫度樂與時喇間：45陣℃－55搶℃，30－60秒鐘③延伸錫溫度振與時翼間：70－75慣℃，30－60秒鐘陜（最昂后一地次延咽伸延捷長5分鐘褲）29Ta軋qDN翻A聚合否酶的快活性域受溫幣度影破響：蹤蝶在70－80托℃時，訊每個型酶分焰子每甩秒鐘筑可催板化延形伸約15條0個核迷苷酸濫，在70堅℃時為60個核攝苷酸涂，在55努℃時為24個核辦苷酸鴿，高信于90皂℃時幾肢乎完隊全失蝦活。30PC完R的延巖伸時飽間可船以根表據(jù)目蛙的DN癢A的長義度確蓬定：1k津b以內棟一般將延伸1分鐘大，3－4k子b需延暫伸3－4分鐘顏，10籌kb需延蠻伸15分鐘馳。延捉伸時徒間過廊長會面降低宰擴增例特異析性。孤如果拘模板濱濃度暫太低斧，延燦伸時悶間要毛稍長飾些。312.緩沖飛液：詢提供PC腔R反應右合適垮的酸維堿度藝和某脅些離扮子（玻主要眉是Mg2+）。剃常用10－50政mm債ol蓮/LTr件is遙-H蘿Cl(2良0℃時，pH附=8勿.3－8.慚8，72瞎℃時pH彈=7呢.2錄)緩沖悟液。323.循環(huán)愁次數(shù)PC胳R循環(huán)屑次數(shù)贏的設邀定主丟要取夫決于余初始鋪目的DN云A的濃邁度。本一般散的循穿環(huán)次燈數(shù)選妙在30－40次之財間。酒循環(huán)朽次數(shù)盜太少感，產螺物的桃量不票夠多游；循刮環(huán)次像數(shù)越規(guī)多，隱由于括各種醫(yī)原因焰越容趟易發(fā)若生錯爐誤摻肯入，猛從而誘降低陸擴增球特異枕性。33原則勺是：殼在滿駕足產鐵量的欲前提圖下，望應盡習量減牙少循啊環(huán)次永數(shù)。弊如果燒產量俱不夠銹，可敞將產守物適謀當稀絲式釋，從再繼窄續(xù)擴臉增。34四、PC柿R擴增基產物挽的分方析㈠凝膠親電泳音分析凝膠旨電泳括可幫禍助判勞斷擴脊增產緣瑞物的紅大小潮、檢眉測擴就增情耀況，摟從而值對擴燒增產都物進眠行鑒持定3536㈡酶活切分躍析根據(jù)PC稅R產物手中存因在的港限制晃性內備切酶撫的識惱別位牌點，繁用相懶應的茅限制盛性內饅切酶形切割職，電哀泳分墳析酶驢切片普段，輕對產但物進印行鑒也定，傭靶基糧因分喊型，驚還能霧進行惱變異匪性研叨究。37㈢分子撞雜交分子暮雜交熊是即掏可檢料測PC畏R產物蜻的特閣異性合，也聰可檢傻測PC棵R產物槍的堿頸基突賄變。出包括So變ut散he鹿rn印跡謝法，珠斑點其雜交參，微增孔板民雜交殲法等38㈣DN遙A測序測序娘是檢守測PC弓R產物繡特異薯性的繁最可尊靠方揭法。倆能對鳴靶基僑因分老型，誦還能準進行倘變異展性研昨究。39第二廈節(jié)PC徹R技術趙的發(fā)薦展⒈逆轉掏錄PC女R逆轉跪錄PC盆R(錦RT檔-P列CR古)是以mR程NA為模碼板，揉由逆喝轉錄竟酶催銅化合cD紛NA，將cD肢NA通過PC輔R擴增匙，擴閘增產搞物再灘走凝漁膠電踢泳，爐通過屋分析瘦電泳聽圖譜罰可以刑鑒定cD百NA的長炸度，cD填NA的長越度即汗為mR貧NA的長兩度，糕進而捕推斷熄是否璃存在?；蛉廊笔Я粱虿迥?，溫以及mR棗NA加工慈過程舌是否曉異常悉。40如果擠對電趕泳圖浮譜進嬸行光烘密度決掃描選，還多可以歡計算銀出相蜻應的mR證NA量。RT礎-P腔CR使微強量mR靈NA的信威息迅年速擴蹈增，緣瑞大大稱提高吵了mR躍NA檢測咱的靈偽敏度漿。41⒉定量PC佳R應用狠定量PC撓R技術酸可以歇定量的檢測稼樣品尺中目路的DN輪A的拷輪貝數(shù)喜。通夸過測么定PC丹R擴增奮產物結的量預推測扣出原親始樣奧品中蠶目的DN孕A的拷挨貝數(shù)更。42必須珍設立革內參肆照。古具體顆的方刑法是濱，將扯目的DN猾A和一芒個單釣拷貝并對照DN奇A放在盒同一典試管斬中進五行PC贏R擴增梅；然層后將洽擴增賣產物確走電孝泳，詠使擴居增的升目的DN宅A和對漆照DN口A分離蕩，呈煮現(xiàn)兩階條區(qū)趕帶；蔥通過爹比較興兩區(qū)霞帶的叼度，屋或測恥定兩世區(qū)帶經的放轟射性經強度偷，即解可推西算出揪目的DN醋A的拷株貝數(shù)毛。43定量PC匹R技術特：競帶爭定腰量PC轉R實時掌熒光續(xù)定量PC租R定量PC全R技術期與逆誕轉錄呀結合無，可翠以檢測mR徐NA的絕圣對含疤量。4445⒊多重PC頸R被檢距基因計太長(2鏡kb以上)存在體多個滲位置枯的缺夢失和鍋突變方法克：用多對引物潑同時元擴增址一份DN您A樣品堂的不滅同序雀列區(qū)雁域，掉每對總引物馳所擴鑒增產虎物長維度不量同，防根據(jù)飽電泳輕結果譯判斷圈是否鋒存在咽某些析基因宣片段昆得缺恰失或巡壽長度滲改變蒙。這書樣一揪次反莖應就棕可以膊檢測蛋多個胞變異形位點腸。46⒋重組PC摩R研究糠基因恥結構糠與功板能的寶關系篇，常桑需要塌突變漂基因增結構保，如蜜堿基給替代漿、缺媽失或科插入弦等，停以觀爽察基板因功勉能的賀改變究。通常貫的方泛法是避用合輛成帶丙突變掙的引袍物，輕復制降完整再的突互變基晝因。PC肺R能使偷體外堵定點挑突變恐簡便息快捷峽，PC油R參與掉的體搏外基續(xù)因突仆變過訓程稱痰為重氧組PC維R，。47⒌不對子稱PC瀉R典型哪的PC批R擴增遮產物屋是特污異的襪雙鏈DN包A分子奔。如態(tài)在反直應體暢系中慚加入餡不同蓮濃度帽（兩傘條引適物的斷濃度摩比一名般為50－10史0:靠1）的迎兩條攜引物揀即可使獲得梳特定糟的單惡鏈DN愁A，稱享為不剩對稱PC侍R。DN再A測序合及基形因診斃斷中博常常督需要壤大量胖單鏈DN陶A48⒍原位PC殼R將組贊織或度細胞勢經過跟固定在處理谷，使詢細胞赤膜具召有一霧定的鼓通性疾，然價后在富細胞醬內建渾立PC獎R體系僻，擴把增細妄胞內換的DN艦A或RN