病理解剖技術(shù)

關(guān)于病理解剖技術(shù)第1頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三序：

病理學(xué)的理論和技術(shù)被視為一輛車的兩個(gè)車輪，缺一不可，互為依存，互相促進(jìn)，兩者的結(jié)合決定病理學(xué)的發(fā)展。第2頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三病理學(xué)的技術(shù)主要體現(xiàn)在幾個(gè)結(jié)合上1.傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)與現(xiàn)代生物新技術(shù)相結(jié)合2.宏觀、臟器、組織、細(xì)胞、超微與分子基因不同層次技術(shù)相結(jié)合3.形態(tài)、機(jī)能與代謝變化相結(jié)合4.定性、定位與定量觀測相結(jié)合5.實(shí)驗(yàn)研究技術(shù)與臨床應(yīng)用技術(shù)相結(jié)合6.技術(shù)的基本原理與具體方法相結(jié)合7.基本技術(shù)知識與作者實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)相結(jié)合第3頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三病理學(xué)的發(fā)展與使用的工具和方法的更新密切相關(guān)1.用解剖刀剪等進(jìn)行尸體檢查，開展了器官病理學(xué)2.顯微鏡發(fā)明百年之后，建立了細(xì)胞病理學(xué)3.電子顯微鏡的問世，發(fā)展了超微病理學(xué)4.免疫組織化學(xué)促進(jìn)了免疫病理學(xué)的發(fā)展5.分子生物學(xué)帶動了分子病理學(xué)的興起6.計(jì)算機(jī)及其網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用，將病理學(xué)走向信息病理學(xué)時(shí)代第4頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)：

傳統(tǒng)的Formalin固定，石蠟切片和HE染色技術(shù)仍是病理學(xué)的基本技術(shù)，大量應(yīng)用與基礎(chǔ)和臨床病理學(xué)日常工作中，保證和提高常規(guī)質(zhì)量和現(xiàn)代設(shè)備水平十分重要。第5頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第一章：病理解剖技術(shù)一、病理解剖的意義病理解剖技術(shù)是病理學(xué)的基礎(chǔ)之一，是病理學(xué)不可分割的一部分。通過病理解剖收集病理教學(xué)及科研資料是其中一個(gè)途徑，大量病理資料的積累促進(jìn)了醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步。病理解剖是通過解剖尸體觀察和發(fā)現(xiàn)死者器官、組織的病理變化，找出主要病變，分析判斷直接死亡的一個(gè)重要方法。第6頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三二、病理解剖室的設(shè)備和器械1.設(shè)備：1〕解剖室的設(shè)計(jì)要求最好位于太平間；室內(nèi)面積要大，必須有兩個(gè)門；地面用水磨石，四周有排水溝或地漏；室內(nèi)通風(fēng)好；有消毒室，男女更衣室，浴室等。第7頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕解剖臺的設(shè)計(jì)高低和大小要合適臺面可用水磨石或不銹鋼有條件可購置能夠升降的解剖臺解剖臺可帶有抽氣的功能等

第8頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三水磨石臺面的解剖臺第9頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三水磨石臺面的解剖臺第10頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三不銹鋼臺面的解剖臺第11頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三病理解剖器械2.器械：第12頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3.清潔、消毒和個(gè)人保護(hù)1〕病理解剖室的清潔和消毒2〕病理解剖器械的清潔和消毒3〕個(gè)人保護(hù)等第14頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三三、病理解剖的方法和步驟1.病理解剖前的準(zhǔn)備主要辦理一切手續(xù)，非常重要。2.體表檢查第15頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三體表檢查第16頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三尸斑，尸僵第17頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3.胸腹腔檢查1〕切口2〕腹腔檢查3〕胸腔檢查第18頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三腹腔有滲出液第19頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三心包積液（血液〕第20頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三氣管周圍血液第21頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三液體稱量第22頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三4.內(nèi)臟器官的取出及檢查一般有兩種方法：1〕各臟器分別取出法是病理解剖最常用的方法2〕多臟器聯(lián)合取出法此法比較簡單，可保持各器官的完整性。第23頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三心臟表面充血第24頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三絨毛心第25頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三雙肺和支氣管第26頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝臟表面有結(jié)節(jié)第27頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胰腺，出血改變第28頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三腸管，出血第29頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三腦第30頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三腦干出血第31頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第二章病理大體標(biāo)本的制作一、大體標(biāo)本的收集、取材、固定和保存1.大體標(biāo)本的收集通過尸體解剖和活體組織（包括外科手術(shù)切除標(biāo)本和活體組織穿刺標(biāo)本〕檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)并收集。2.大體標(biāo)本的取材第32頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三取材室條件：通風(fēng)要好，必須有排風(fēng)設(shè)備；固定的組織取材前要用流水充分沖洗；排水要遠(yuǎn)離住宅區(qū)等第33頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三不同器官的取材和固定不同：1〕實(shí)質(zhì)性的器官：如肝、脾等要注意，實(shí)質(zhì)器官不容易被固定液所穿透。第34頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝癌第35頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝癌第36頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝癌第37頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝癌第38頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕空腔器官：如胃、腸等取材時(shí)要看全層，保持粘膜、肌層和漿膜全層的組織。第39頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌，呈菜花狀切面的形狀第40頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌，潰瘍型切面的形狀第41頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三切面的形狀，浸潤性至漿膜潰瘍型胃癌第42頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三潰瘍型胃癌切面的形狀，浸潤性至漿膜第43頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3〕肺肺組織比較疏松，固定液容易滲透。肺組織的取材要清楚的了解各葉肺組織所伴隨的支氣管。

第44頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三A：主支氣管B：葉支氣管第45頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第46頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肺和氣管周圍的淋巴結(jié)第47頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肺癌肺門型第48頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肺癌肺門與周圍之間第49頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肺癌周圍型第50頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肺癌空洞型第51頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三4）其它類型外科手術(shù)標(biāo)本常見：乳腺癌子宮頸癌腸癌卵巢腫瘤等第52頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三乳腺癌第53頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三乳腺癌第54頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三乳腺癌第55頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三乳腺癌第56頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三子宮頸癌第57頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三子宮頸癌第58頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三子宮頸癌第59頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三子宮頸癌，切面第60頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3.大體標(biāo)本的固定1〕固定的目的：將受檢組織盡快地侵入固定液內(nèi)，使組織和細(xì)胞的固有成分迅速凝固，防治自溶和腐敗，使其保持與生活狀態(tài)有相似的結(jié)構(gòu)，以利于切片和觀察。2〕固定液的選擇：A.甲醛（Fomaldehyde〕，又稱福爾馬林，其濃度在4％，它是一種還原劑，極易揮發(fā)，散發(fā)出強(qiáng)烈的刺激性氣體，使人流鼻涕、流眼淚，呼吸道有異物感。B.95％酒精（乙醇〕，除具有固定組織的作用外，尚有脫水作用。第61頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3〕固定液的特性甲醛固定液滲透力強(qiáng)，固定均勻，對組織收縮較小，并能增加組織韌性的優(yōu)點(diǎn)，而且可以保存組織內(nèi)的脂類物質(zhì)，對組織的主要作用為硬化和防腐。酒精可以保存組織內(nèi)的糖類物質(zhì)及尿酸結(jié)晶，不過，它常使組織明顯收縮，且使脂類物質(zhì)溶解。第62頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三4.大體標(biāo)本的脫水、包埋和切片為能制成滿意的切片，固定后的組織還要經(jīng)過脫水、透明、浸蠟及包埋等一系列程序。1〕脫水：目的是將固定了的組織內(nèi)水分除去。以便使切片時(shí)的支撐物（石蠟〕充分進(jìn)入組織內(nèi)。常用的是酒精。2〕透明：目的是使能與石蠟結(jié)合溶解的媒介劑進(jìn)入組織，進(jìn)而將不能與石蠟結(jié)合的脫水劑置換出來，并使組織透明。常用的是二甲苯。第63頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第64頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3〕浸透和包埋：可使組織具有一定的硬度和韌度，便于切成薄的切片。常用的石蠟溶點(diǎn)為60~62℃，有時(shí)為保存更多的抗原成分?？刹捎玫腿茳c(diǎn)石蠟（48~50℃

〕。4〕切片切片機(jī)類型：旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)滑動式切片機(jī)第65頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)第66頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三5.HE（HematoxinEosin,HE〕染色1〕蘇木素染色配方：蘇木素1g

純酒精10ml

鉀明礬20g

蒸餾水200ml

氯化汞0.5g2〕伊紅染色配方：伊紅0.5-1g

蒸餾水99ml第67頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三HE染色法：1〕蘇木素染色5－7分鐘；2〕自來水沖洗多余的染液；3〕1％鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，使細(xì)胞核呈紫藍(lán)色4〕自來水中充分洗滌；5〕1％氨水中數(shù)秒，至返藍(lán)；6〕自來水中至蒸餾水沖洗；7〕1％的伊紅染色，3分鐘左右；結(jié)果：細(xì)胞核呈紫藍(lán)色，細(xì)胞漿呈粉紅色，基底膜，膠原纖維及肌纖維呈粉紅色。第68頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三HE切片第69頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第三章特殊染色

HE染色雖是一種快速、經(jīng)濟(jì)、且易掌握的方法，但它不能回答病因?qū)W、Z組織發(fā)生及發(fā)病機(jī)制等方面的許多問題。而特殊染色可以協(xié)助解決病理診斷問題。第70頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三目前市場上有配制好的特殊染色試劑第71頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三介紹常用的幾種特殊染色1.脂肪染色主要用于心、肝、腎的脂肪變性，動脈粥樣硬化，以及因脂肪栓塞導(dǎo)致的死亡病例鑒定等。1〕試劑配制：蘇丹染液蘇丹III或蘇丹IV0.5g，70%乙醇250ml，丙酮250ml。2〕染色方法：（1〕標(biāo)本常規(guī)甲醛固定后流水沖洗12h；（2〕用濾紙吸干標(biāo)本表面的水分，把標(biāo)本放入蘇丹III染液中浸泡30min；（3〕用70％乙醇分化，以脂肪組織呈橙黃色，其它組織不著色為佳；（4〕水洗后浸存在5％甲醛液中，為了防腐可加入適量的防腐劑。第72頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝脂肪變第73頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三蘇丹III染色第74頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2.過碘酸(periodicacid)-schiff染色，即PAS染色此技術(shù)主要顯示糖原（在淀粉酶消化對照下〕、中性粘液物質(zhì)、基底膜、霉菌和寄生蟲等。1〕schiff氏試劑的配方：（1〕將200ml蒸餾水煮沸；（2〕冷卻至90℃時(shí)，慢慢加入堿性復(fù)紅1g;（3〕攪拌并煮沸5分鐘使其全溶；（4〕冷卻至50℃時(shí)過濾，并加入1N鹽酸20ml；（5〕冷卻至25℃時(shí)，再加入無水亞硝酸鈉1g并攪拌勻。（6〕置入遮光瓶內(nèi)并放入在4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。?5頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕PAS染色方法：（1〕1％過碘酸水溶液染10分鐘，使含有乙二醇的化合物氧化形成醛基；（2〕蒸餾水洗去過碘酸；（3〕schiff氏試劑反應(yīng)15分鐘，使醛基和schiff氏試劑結(jié)合，形成紫紅色產(chǎn)物；（4〕0.5%亞硝酸鈉(NaHSO3)處理三次，每次2分鐘；（5〕流水沖洗5－10分鐘；（6〕用蘇木素染色液復(fù)染細(xì)胞核；〔7〕水洗或1％鹽酸酒精分化。3〕結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，基底膜呈紅色，膠原纖維、肌纖維及細(xì)胞漿呈紅色。第76頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三過碘酸－Schiff反應(yīng)：糖元及其他PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色第77頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三PAS第78頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三念珠菌（PAS染色）第79頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三附：AB/PAS法（阿爾辛藍(lán)過碘酸雪夫染色法〕結(jié)果：中性粘液物質(zhì)呈紅色，酸性粘液物質(zhì)呈藍(lán)色，中性和酸性粘液的混合物質(zhì)呈紫色。第80頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三阿爾辛藍(lán)－阿爾辛黃法：常用于黏液上皮腫瘤的鑒別診斷第81頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三阿爾辛藍(lán)過碘酸雪夫反應(yīng)：是顯示中性和酸性黏液物質(zhì)的有效方法第82頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三HID/AB:高鐵二胺奧新藍(lán)法AB/PAS第83頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第84頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3.六胺銀（PASM〕染色在腎臟活體組織檢查和一些真菌感染的組織選用此方法。1〕PASM染液的配方：

2％硝酸銀水溶液3ml；

3％六次甲基四胺液25ml；

5％硼砂2ml。注：2％硝酸銀配制胺溶液，染色時(shí)間40分鐘，溫度

55~60℃，隨時(shí)鏡下觀察便于控制。

第85頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕PASM染色法：（1〕1％過碘酸水溶液內(nèi)染10分鐘；（2〕自來水沖洗，蒸餾水沖洗；（3〕入5％鉻酸水溶液40分鐘，出此溶液后用1％亞硫酸鈉除掉鉻酸；（4〕自來水洗數(shù)次，蒸餾水洗3－4次；（5〕入六胺銀染液（50－60℃〕40分鐘，20分鐘后，每5分鐘鏡下觀察一次，蒸餾水洗四次；（6〕入0.2%氯化金水溶液1－2分鐘，蒸餾水洗三次；（7〕入5％硫代硫酸鈉水溶液1－2分鐘，蒸餾水洗數(shù)次；（8〕復(fù)染HE，脫水、透明、封片結(jié)果：底膜呈黑色，網(wǎng)狀纖維呈黑色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，背景呈粉紅色。第86頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三PASM染色第87頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三PASM染色第88頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三PASM第89頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三PASM第90頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第91頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三附：PASM對真菌的染色真菌（fungus〕，又稱霉菌，其種類較多。真菌的基本結(jié)構(gòu)成分是含有較多的粘多糖和蛋白質(zhì)。1〕試劑的配制：（1〕六次甲基四胺、硝酸銀原液（簡稱六胺銀原液〕。3％六次甲基四胺水溶液100ml，5％硝酸銀水溶液5ml；（2〕六胺銀硼砂染色液。六胺銀原液25ml，蒸餾水25ml，5％硼砂水溶液2ml；（3〕核固紅染液。核固紅0.1g，硫酸鋁5g，蒸餾水100ml；（4〕亮綠染色液。亮綠0.2g，蒸餾水100ml，冰醋酸0.2ml。第92頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕染色步驟：（1〕5％鉻酸水溶液氧化1小時(shí)，流水洗2分鐘，蒸餾水洗2次；（2〕浸入1％亞硫酸鈉水溶液除掉鉻酸1分鐘，流水洗5分鐘，蒸餾水洗3次；（3〕浸入六胺銀硼砂液染色1－1.5小時(shí)（40－50℃溫箱內(nèi)〕，至切片呈淺棕色，蒸餾水3次；（4〕用0.2%氯化金水溶液調(diào)色3分鐘，蒸餾水稍洗；（5〕核固紅染色細(xì)胞核10分鐘，流水洗，蒸餾水洗；（6〕亮綠染色液30秒，用蒸餾水快速稍洗；（7〕無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：真菌均呈黑色，菌絲和孢子呈黑褐色，細(xì)胞核呈紅色，背景呈淡綠色。第93頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三念珠菌（假菌絲）第94頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三新生隱球菌性腦膜炎第95頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三4.淀粉樣物質(zhì)染色（介紹剛果紅染色）淀粉樣物質(zhì)是一種嗜伊紅性物質(zhì)，性質(zhì)屬于糖蛋白成分。組織出現(xiàn)此物質(zhì)稱為淀粉樣變性。1〕試劑配制：（1〕剛果紅染色液。剛果紅1g，蒸餾水100ml；（2〕Harris蘇木素染色液。第96頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕染色步驟：（1〕蘇木素染色液浸染2分鐘；（2〕0.5%鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；（3〕流水洗，蒸餾水洗2次；（4〕剛果紅染色液中25分鐘；（5〕無水乙醇迅速脫水2次；（6〕二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。第97頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三剛果紅染色第98頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第99頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第100頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第101頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第102頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第103頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第104頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三5.Mallory三色染色法（屬于結(jié)締組織復(fù)合染色法〕1〕試劑配制：（1〕重鉻酸鉀液。重鉻酸鉀2.5g，醋酸5ml，蒸餾水95ml；（2〕苯胺藍(lán)橘黃G液。苯胺藍(lán)0.5g，橘黃2g，磷鎢酸1g，蒸餾水100ml；（3〕酸性復(fù)紅液。酸性復(fù)紅0.5g，蒸餾水100ml。第105頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2〕染色步驟：（1〕重鉻酸鉀液10分鐘；（2〕流水洗2分鐘，蒸餾水洗2次；（3〕酸性復(fù)紅液2分鐘，蒸餾水稍洗；（4〕苯胺藍(lán)液20分鐘，95％乙醇快速分化；（5〕直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。結(jié)果：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍(lán)色，軟骨、粘液、淀粉樣變性物質(zhì)呈淡藍(lán)色，神經(jīng)膠質(zhì)纖維、肌纖維和酸性顆粒呈紅色，髓鞘和紅細(xì)胞呈橘紅色。第106頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三特點(diǎn)：利用酸性復(fù)紅、苯胺藍(lán)、橘黃G這三種染料對結(jié)締組織和非結(jié)締組織進(jìn)行著色。Mallory第107頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三6.Masson三色染色法1〕試劑配制（1〕Masson復(fù)合染色液。堿性復(fù)紅1g，麗春紅2g，橘黃G2g，0.25%醋酸300ml；（2）亮綠染色液。亮綠SF0.1g，0.2%醋酸100ml。2〕染色步驟（1〕Masson復(fù)合染色液5分鐘；（2〕0.2%醋酸水溶液稍洗；（3〕5％磷鎢酸5－10分鐘；（4〕0.2%醋酸水溶液浸洗2次；（5〕亮綠染色液5分鐘；（6〕0.2%醋酸水洗2次；（7〕無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。第108頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三結(jié)果：細(xì)胞核呈紅色，基底膜、膠原纖維呈藍(lán)綠色，免疫復(fù)合物呈紅色。第109頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三

適用于腦垂體、上皮、甲狀腺、神經(jīng)的正常和腫瘤組織Masson第110頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三腎小球第111頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三左：HE染色右：Masson染色，膠原組織呈藍(lán)色，彈力纖維棕色，肌纖維、纖維素、紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈黑藍(lán)色。第112頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三7.彈力纖維染色法

病理診斷應(yīng)用彈力纖維染色，目的是觀察組織內(nèi)彈力纖維是否增生或破壞、斷裂和崩解，從而幫助診斷。試劑配制：地衣紅酒精液1g70%酒精100ml

濃鹽酸1ml結(jié)果：Taner-Unna法，彈力纖維呈深棕紅色。

Verhoeff鐵蘇木素染色法，彈力纖維呈黑色。第113頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三Verhoeff鐵蘇木素染色法：彈力纖維黑色或黑藍(lán)色，胞核黑色，膠原纖維呈紅色Verhoeff鐵蘇木素染色法第114頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三Lendrum纖維素染色法顯示腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)血栓形成第115頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三免疫組織化學(xué)技術(shù)第四章：第116頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）一．定義：應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中的某些化學(xué)成分進(jìn)行原位的定性、定位、或定量研究，這種技術(shù)稱免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）或免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry），簡稱免疫組化。免疫組化技術(shù)是1941年Coons等學(xué)者首創(chuàng)的，隨著其理論及技術(shù)的發(fā)展，目前已發(fā)生了日新月異的變化。第117頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三1．免疫組化的方法：

1）直接法

2）間接法：SPA、PAP、ABC、LAB法等，間接法的靈敏度高于直接法。2．標(biāo)記的物質(zhì)：熒光染料、放射性同位素，酶（辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等）鐵蛋白、膠體金等。3．根據(jù)標(biāo)記物區(qū)分：免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法。其中免疫熒光法和酶標(biāo)法應(yīng)用廣泛。第118頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三反差第119頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三二．免疫組化的基本知識1．原理：抗體與抗原間的結(jié)合具有高度的特異性，免疫紐織化學(xué)正是利用這一特性，即先將組織或細(xì)胞中的某種化學(xué)物質(zhì)提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫后獲得特異性抗體，再以此抗體去探測組織或細(xì)胞中的抗原物質(zhì)。由于抗原與抗體結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的，因此還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原抗體反應(yīng)部位顯示出來，以期達(dá)到對組化或細(xì)胞中的未知抗原進(jìn)行定性、定位甚至定量的研究。組織或細(xì)胞中凡是能作抗原或半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等，都可以用相應(yīng)的特異性抗體進(jìn)行檢測。第120頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2.抗原性的保存：上述談到的抗原或半抗原物質(zhì)，防止在組織或細(xì)胞內(nèi)丟失是非常重要的。在組織處理過程中，如固定、包埋、薄切、反應(yīng)，必須保持其抗原性，特別是選擇的固定液及包埋方法要十分注意。3.抗體：抗體是機(jī)體受抗原刺激后，由B淋巴細(xì)胞、特別是漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種與相應(yīng)抗原發(fā)生反應(yīng)的一種球蛋白，即免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig)，共有五類：IgG,IgA,IgM,IgD,和IgE，主要分布在血清或外分泌物中，以IgG為主，約占70~80％。第121頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三1〕抗體的制備方法：A多克隆抗體（血清抗體〕：指機(jī)體接受抗原主動免疫或被動免疫后從血清中分離提純的抗體。B單克隆抗體：是1975年由KohlenhMilstein發(fā)明的一種新技術(shù)。其原理是將體外培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞和免疫的脾細(xì)胞相融合，產(chǎn)生雜交細(xì)胞。這種融合的雜交細(xì)胞既有骨髓細(xì)胞的無限生長能力，又有漿細(xì)胞分泌單一抗體的能力。將該免疫細(xì)胞純化，成為單克隆系，就能產(chǎn)生大量專一的高純度的抗體，即單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb)第122頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2)單克隆抗體與多克隆抗體特性的比較特性多克隆單克隆組成多種類抗體的混合物單一種類的抗體特異性低針對多個(gè)抗原決定族高針對單一的抗原決定族親和力平均親和力較高不定，較低交叉反應(yīng)高低第123頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三4．抗原與抗體的特異性結(jié)合

抗原與抗體的結(jié)合具有高度的特異性。在抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)中有3個(gè)特殊的易變部位，即在第30位、50一60位和第100位氨基酸殘基附近，這些部位稱為超變區(qū)。超變區(qū)直接參與抗原接合部位的組成，形成的接合部位是一個(gè)淺平穴槽，槽大小約I.5nm×0.6nm×0.6nm抗原決定族在空間呈互補(bǔ)性地嵌入槽內(nèi)，借分子間的范德華力、疏水作用靜電引力以及氫鍵而相互結(jié)合。抗原與抗體分子的結(jié)合不受兩者數(shù)量比例的限制，但如要出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)，則抗原與抗體的量需有一定的適當(dāng)?shù)谋壤駝t在抗原與抗體過量的情況下，不能聚合成大顆粒，因此不能出現(xiàn)肉眼可見的反應(yīng)。第124頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三三．免疫組織化學(xué)的基本技術(shù)（一〕

取材1．實(shí)驗(yàn)動物：麻醉（處死〕，鋒利刀片切成大小適中，厚度3mm～4mm;

小型實(shí)驗(yàn)動物：灌注（流）固定（生理鹽水和4％多聚甲醛〕

取材2．人體材料：活檢組織、手術(shù)標(biāo)本、細(xì)胞和組織

第125頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（二）固定：原則是保持組織形態(tài)良好和被檢測抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時(shí)間，固定時(shí)間一般為1~12h。1．常用的固定劑：1）甲醛緩沖液：廣泛應(yīng)用于病理標(biāo)本的固定，甲醛在很好地保護(hù)組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的同時(shí)也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交聯(lián)作用會影響被固定細(xì)胞膜的通透性不利于染色時(shí)抗體的滲透，因此染色前常用酶進(jìn)行消化以使抗原決定簇充分暴露，固定時(shí)間不直超過24h。第126頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2）4％多聚甲醛磷酸緩沖液：廣泛應(yīng)用于光鏡細(xì)胞化學(xué)研究。3）戊二醛~多聚甲醛緩沖液：適用于光鏡、電鏡免疫組織化學(xué)研究。4）其它：如PLP液（過碘酸~賴AA~多聚甲醛固定液）、丙酮及醇類、鋨酸等。第127頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2．固定注意事項(xiàng)：1）固定液的選擇標(biāo)準(zhǔn)：A.組織形態(tài)結(jié)構(gòu)保存良好；B.最大限度保存抗原的抗原性。中性甲醛和多聚甲醛是應(yīng)用最廣的固定劑。2）組織塊的大?。?.5cm×1.5cm×0.5cm為宜。3）固定時(shí)間：與組織塊大小成正比，與固定液濃度成反比。4）溫度：一般在室溫下進(jìn)行，電鏡標(biāo)本和固定時(shí)間較長時(shí)可放置在4℃冰箱。5〕固定后處理：充分沖洗，除去多余固定劑。第128頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（三）包埋：1.石蠟包埋；2.冷凍包埋；3.環(huán)氧樹脂包理。（四）切片：1.載玻片的處理：1）清洗；2）涂膠（防止脫片）常用粘附劑：①明膠：鉻礬明膠和甲醛明膠；②樹脂膠：也稱白膠；③多聚賴氨酸（PLL）；④商品化粘附劑。2.切片類型：l）石蠟切片：厚約3～5μm放置37℃溫箱烘烤過夜，以減少脫片。2）冷凍切片：2μm。3）振動切片：特點(diǎn)是組織經(jīng)固定后不需包埋，只要用膠水粘在載物臺上即可切片。切片較厚，可將陽性部位作電鏡包埋。神經(jīng)組織應(yīng)用較多。第129頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三四．免疫組化染色過程中的基本技術(shù)（一）蛋白酶消化技術(shù)進(jìn)行固定時(shí)，抗原決定簇有可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前，常用蛋白酶處理組織切片，使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織的通透性增高，以利抗原抗體最大限度地結(jié)合增強(qiáng)特異性染色。1．常用的消化酶：胰蛋白酶、胃蛋白酶2．消化時(shí)間：因組織而異，一般為5~30分鐘，消化時(shí)間不宜太長，以免損傷組織形態(tài)，破壞抗原決定族。消化結(jié)束后要充分洗滌，以除去殘留的蛋白酶。第130頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三1）非特異染色的控制非特異染色或背景染色是指在免疫組化染色過程中凡不屬于特異性抗原抗體反應(yīng)所出現(xiàn)的染色。1．原因分析：組織方面：主要有組織的自發(fā)熒光、內(nèi)源性過氧化物酶或堿性磷酸酶、內(nèi)源性生物素等；試劑方面：因抗體不純、標(biāo)記的酶和熒光不純或標(biāo)記過量等。2．消除方法：

A.加1抗前加正常血清10~30分，以封閉組織中帶電荷的基因，避免與1抗的非特異性結(jié)合。第131頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三B.減少非特異性染色：a免疫酶組化染色時(shí)，在加1抗前，用0.3％的H2O2甲醇溶液將組織切片處理30分（若是3％的H2O2甲醇溶液處理5~10分）。b免疫熒光染色時(shí)，可用0.01~0.05％伊文思藍(lán)稀釋熒光抗體。（二）對照實(shí)驗(yàn)陽性對照片：用已知抗原為陽性的標(biāo)本作對照。陰性對照片：確認(rèn)不含己知抗原的標(biāo)本作對照。第132頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（三）抗體的分裝、稀釋、滴加及保存1．抗體的分裝：不能用完的抗體分裝在小的EP管內(nèi)，保存在

-20～-40℃的低溫冰箱中持用可保持?jǐn)?shù)年有效。2．抗體稀釋：常用0.01MPBS（磷酸緩沖溶液）或BSA

（牛血清白蛋白）3．滴加：滴加的抗體要充分覆蓋組織切片，一般加30～50μl，最好在滴加前，用蠟筆或特制的組化筆在組織周圍畫一圈，以防溶液的擴(kuò)散。4．保存：未用完的抗體可在低溫冰箱或凍干保存，已稀釋未用完的抗體最好在一周內(nèi)用完，不宜長期保存。第133頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（四）免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和酶標(biāo)抗體技術(shù)1．免疫酶染色原理：用酶作為標(biāo)記物，可分為直接法、間接法、補(bǔ)體法、免疫酶橋法、免疫酶雙橋法、過氧化物酶抗過氧化物酶法（PAP法）和雙PAP法等。1）直接法原理：用酶直接標(biāo)記在特異性1抗上，與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，讓酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物，沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位，即可在鏡下對標(biāo)本的抗原進(jìn)行檢測。優(yōu)點(diǎn)：簡便、快速、特異性強(qiáng)；缺點(diǎn)：敏感性差。第134頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2）間接法原理：先用標(biāo)記的特異性1抗與標(biāo)本中相應(yīng)抗原結(jié)合，再用酶標(biāo)記的抗球蛋白抗體（2抗）孵育，然后再加酶的底物，顯示抗原～抗體～抗原抗體復(fù)合物存在的部位，以對抗原進(jìn)行檢測。如：1抗是由免產(chǎn)生的多克隆抗體：則2抗常用羊抗兔IgG；如：1抗是由鼠產(chǎn)生的單克隆抗體：則2抗常用羊或馬抗鼠IgG。以上兩種方法稱為酶標(biāo)抗體法第135頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3）非酶標(biāo)記的抗體酶法：是以酶為抗原免疫動物，產(chǎn)生抗酶的抗體。通過酶與抗體的特異性結(jié)合進(jìn)行標(biāo)記。該方法適用于石蠟包埋的組織切片。原理：首先用酶作為抗原免疫動物，制備效價(jià)高、特異性強(qiáng)的抗酶抗體，然后以2抗為橋梁，將在組織中與抗原結(jié)合的lffo抗酶抗體連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上，經(jīng)呈色反應(yīng)顯示抗原的分布。在這種過程中酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合，避免了酶標(biāo)時(shí)化學(xué)反應(yīng)對抗體和酶活性的破壞。不但提高了敏感性，同時(shí)還節(jié)省了1抗的用量。常用的有PAP、sABC、LsAB法（附圖表說明）。第136頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（酶標(biāo)識特異抗體〕（酶標(biāo)識二次抗體〕第137頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三生物素HRPALP第138頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三1．常用的酶種類：

常用的酶大多為辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）介紹幾種酶的底物及產(chǎn)生沉淀的顏色。常見的幾種酶的一般情況酶底物沉淀顏色HRPA3,3’氨基聯(lián)苯胺DAB＋H2O2深褐色

B5－氨基水楊酸＋H2O2棕色ALPA苯酚磷酸鹽＋重氮鹽紅色

BP－校際酚磷酸鹽黃色酸性磷酸酶Gomoui液葡萄糖氧化酶D－葡萄糖＋MTT＋酚嗪磷酸－甲酯化合物藍(lán)色第139頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三五．免疫組化的實(shí)際操作（一）實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

1.

必須器材：

1）實(shí)驗(yàn)臺：光線充足，方便操作。

2）濕潤盒：放置抗原抗體反應(yīng)過程中反應(yīng)，避免干燥。

3〕微量移液器：1～20μl、20～200μl、100～1000μl必備。

4〕其它：濾紙、紗布、吸頭、EP管、染缸、提籃等。2.試劑藥品

1〕緩沖液：PBS,0.01M磷酸緩沖液（pH7.2）

TBS,0.05MTris鹽酸緩沖液（pH7.6）

2〕抗體稀釋液:1％BSA或0.01MPBS3〕10％2抗免疫動物的正常血清

4〕DBA－H2O2顯色液

5〕核復(fù)染液：蘇木素或甲基綠第140頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三

（二〕

sABC法的操作過程1.基本原理：sABC（strepto-avidin-biotinperoxidasecomplex）鏈球菌～抗生物素（卵白蛋）～生物素～過氧化物酶復(fù)合物

生物素（biotin）：是一種分子量為244da的小分子的維生素?？股锼兀╝vidin）：是一種糖蛋白，分子量為68KDa。生物素與抗生物素有很強(qiáng)的親和力，兩者一旦結(jié)合就很難解離。同時(shí)生物素與抗生物素都有與其它示蹤劑如熒光素，膠體金和過氧化物酶等相結(jié)合的能力。所以生物素---抗生物素系統(tǒng)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)及方便快速等顯著優(yōu)點(diǎn)?；静僮鞑襟E：第141頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第142頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三六．操作過程中的各種注意事項(xiàng)及結(jié)果判定要想得到理想的結(jié)果，組織細(xì)胞形態(tài)的保存、抗原性的保存、充分的顯示是非常必要的。要滿足這些條件，取材、固定、切片厚度、操作過程、抗體濃度及特異性的選擇、操作前蛋白酶的消化、抗原修復(fù)及顯色等各程序的操作不當(dāng)均可導(dǎo)致不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。1．取材固定：標(biāo)本要盡可能新鮮，取材固定要及時(shí)，固定液要新鮮充足，防止組織破壞和抗原性的失活。2．切片：切片不宜過厚，一般4μm左右。切片不宜過大，載玻片要涂粘附劑，以防脫片。切好的切片暫放37℃溫箱保存。第143頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3．脫蠟：脫蠟一定要徹底，新鮮二甲苯5min×3。4．蛋白酶消化：由于組織在固定時(shí)抗原決定簇可能被固定劑所封閉，因此在抗原抗體反應(yīng)前常用蛋白酶處理組織切片（根據(jù)1抗要求），使抗原決定簇充分暴露出來，并使組織通透性增高，使抗體充分結(jié)合抗原，增強(qiáng)特異性染色。一般用0.1%胰蛋白酶或胃蛋白酶消化5～30min。5．抗原修復(fù)：一般在檸檬酸鈉抗原修復(fù)液內(nèi)，微波爐，

85～95℃，10min左右。第144頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三6．抗體的選擇：選擇抗體時(shí)要注意是用于冰凍切片還是用于石蠟切片的抗體，或是二者均可；其次要看抗體說明，是單抗還是多抗；適用于哪些組織；抗體來源于哪種動物，由此來選擇2抗；還有抗體的稀度（在實(shí)驗(yàn)前根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳濃度〕。7．特異性的確定：陰性對照（不加1抗，用PBS或TBS代替），陽性對照（已知確定陽性的組織）或買陽性對照片。第145頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三8．DAB—H2O2顯色：注意H2O2的濃度，必須在顯示前加入

H2O2均勻攪拌，最佳顯色時(shí)間在3～5min，過短或過長都不會出現(xiàn)滿意的效果。

9．復(fù)染：一般用蘇木素30s，過長復(fù)染將掩蓋免疫組化的染色效果。10．結(jié)果判定：以下用圖片說明。第146頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三膜性腎病，IgG染色免疫組織化學(xué)ABC法第147頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移cerbB-2癌基因表達(dá)sABC法HE染色免疫組化染色第148頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌，P53抑癌基因表達(dá)，sABC法第149頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌CerbB-2的表達(dá)，sABC法第150頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃癌cerbB-2的淋巴管侵襲，sABC法第151頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃淋巴組織反應(yīng)性增生，CD20/CD43檢測sABC法第152頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三胃組織中的反應(yīng)性增生的淋巴組織，CD43表達(dá)，sABC法第153頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三骨骼肌營養(yǎng)不良，myosin蛋白表達(dá)，sABC法第154頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN，TGF?2表達(dá)，主要在近曲腎小管內(nèi)，sABC法第155頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN,TGF?2的表達(dá)，sABC法第156頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN，bFGF的表達(dá)，sABC法第157頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN,PDGF的表達(dá)，sABC法第158頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三免疫組織化學(xué)在病理診斷中的應(yīng)用范圍1.腫瘤診斷：未分化惡性腫瘤性質(zhì)判定；圓形、梭形、多形性腫瘤細(xì)胞鑒別；轉(zhuǎn)移腫瘤的原發(fā)部位的確定。2.淋巴瘤的診斷：鑒定反應(yīng)性增生疾病與淋巴瘤；各種淋巴瘤的分型。

第159頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三3.內(nèi)分泌腫瘤的診斷（檢測腫瘤分泌的激素〕4.軟組織腫瘤；神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤5.小活檢組織病理檢查（能明確顯示瘤細(xì)胞存在與否〕6.微小癌、微小轉(zhuǎn)移灶（淋巴結(jié)和骨髓〕7.細(xì)針穿刺（細(xì)胞學(xué)診斷〕第160頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三8.部分腫瘤來源分類9.乳腺癌激素受體檢測（ER，PR〕10.腫瘤基因產(chǎn)物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)11.增殖細(xì)胞核抗原（Ki-67，PCNA)判定腫瘤的預(yù)后12.病因診斷（HBV，HCV，EBV，CMV，HIV等〕第161頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三免疫組織化學(xué)在病理診斷中存在的不足1.與分子生物學(xué)等技術(shù)相比，范圍有限2.并非所有腫瘤均可以做免疫組化，因常無相應(yīng)的抗體3.相當(dāng)多的腫瘤缺乏特異性抗原的表達(dá)，同一種抗體，常?？杀磉_(dá)多種腫瘤4.免疫組織化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化問題第162頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第163頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第164頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第165頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第166頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第167頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第168頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第169頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第170頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第171頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第172頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第173頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第174頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第175頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第176頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三免疫電鏡技術(shù)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)病理教研室金曉明第177頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三一、免疫電鏡技術(shù)(immunoelectionmicroscopy,IEM)

是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的原理，在超微結(jié)構(gòu)水平定位、定性及半定量顯示抗原的技術(shù)方法。從細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原抗體的免疫反應(yīng)，必須使抗體帶上具有高電子密度的標(biāo)記物，這樣才能在電鏡下觀察反應(yīng)分結(jié)果。到目前為止，已有三種標(biāo)記技術(shù)：

(1)鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)

(2)酶標(biāo)記技術(shù)

(3)膠體金標(biāo)記技術(shù)第178頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三二、免疫金標(biāo)記技術(shù)（immunogoldstainingtechnique)

用膠體狀態(tài)的金顆粒，作為抗體的標(biāo)記物，制成免疫膠體金來研究抗原抗體的反應(yīng)。在光鏡下，膠體金呈鮮紅色。電鏡下，金顆粒電子密度大，有利于超微結(jié)構(gòu)的觀察。根據(jù)抗體特異性結(jié)合的原理，在亞細(xì)胞水平定性定位。對抗體加以標(biāo)記，形成高電子密度區(qū)，在電鏡下觀察反應(yīng)過程。在對細(xì)胞內(nèi)抗原定性研究中，還可用不同的金顆粒標(biāo)記同一細(xì)胞內(nèi)不同的抗原。進(jìn)行多重標(biāo)記。第179頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三三、免疫電鏡的基本技術(shù)方法1.標(biāo)本的處理(1)取材:各種培養(yǎng)細(xì)胞和分離的血細(xì)胞應(yīng)隨用隨??；游離的培養(yǎng)細(xì)胞可先進(jìn)行離心；貼壁細(xì)胞可在載玻片上固定，也可用胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來；取組織塊時(shí)應(yīng)做到越快越好，最好在沒有停止血流前取材。第180頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三（2）固定固定液的選擇：既要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，又要盡可能的保存抗原的活性。A.多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液（PG固定液）B.過碘酸鹽～賴氨酸～多聚甲醛混合固定液（PLP固定液）C.苦味酸～多聚甲醛～戊二醛固定液（PAPG固定液)

固定方法與時(shí)間：A.血管灌注固定（最好方法）B.浸泡固定C.微波固定第181頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三2.基本技術(shù)方法（1）包埋前免疫電鏡技術(shù)是指先對標(biāo)本進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、切片、觀察。（2）包埋后免疫電鏡技術(shù)是指組織標(biāo)本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)染色方法。詳見包埋前和包埋后電鏡技術(shù)的比較第182頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三包埋前與包埋后的比較包埋前包埋后優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)修正未經(jīng)鋨酸固定、脫水、樹脂包埋及高溫聚合的過程，標(biāo)記的陽性率高，提高電鏡的檢出率。免疫染色完畢后用戊二醛與鋨酸作后固定，可使抗原抗體結(jié)合的更加牢固，并有利于膜結(jié)構(gòu)的保存。標(biāo)記前細(xì)胞內(nèi)抗原受到標(biāo)記抗體的穿透性限制（因是組織塊）制作厚切片；增加細(xì)胞膜的通透性具有陽性結(jié)果重復(fù)性高、方法簡便可靠的優(yōu)點(diǎn)，可對同一組織塊的連續(xù)切片作各種對照染色，能十分準(zhǔn)確的解釋染色結(jié)果，而且還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫染色?？乖诿撍?、浸透及樹脂包埋過程中可能被破壞，使免疫染色的陽性率下降。細(xì)胞膜保存差（鋨酸作用）固定液選擇苦味酸(保護(hù)細(xì)胞膜)包埋劑協(xié)作低溫樹脂第183頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，可見G-6-P酶陽性反應(yīng)產(chǎn)物。(×32000)第184頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三肝細(xì)胞。箭頭指線粒體，線粒體嵴、內(nèi)膜基質(zhì)側(cè)呈現(xiàn)琥珀酸脫氫酶陽性反應(yīng)顆粒（×36000）第185頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN,TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法第186頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三IgAN,TGFs2的表達(dá)，免疫金銀法第187頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第188頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第189頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第190頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第191頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三第192頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三K4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)聯(lián)合的免疫電鏡法（實(shí)驗(yàn)結(jié)果介紹）

免疫電鏡技術(shù)是從超微結(jié)構(gòu)水平能顯示抗原和抗體結(jié)合后在細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)水平的定位，這一技術(shù)已成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重要研究手段。但是，由于免疫電鏡技術(shù)因多種原因造成的重復(fù)性差或技術(shù)的不穩(wěn)定性，加之目前電鏡包埋所采用的是環(huán)氧樹脂618或812，都需高溫聚合，這樣可使多種抗原活性減低或喪失。本研究組選用了LowicrylsK4M低溫包埋劑和紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17020），對免疫電鏡觀察的標(biāo)本進(jìn)行了處理，目的是更好的保存被檢測組織中抗原的活性，提高檢出率?，F(xiàn)將一些不成熟的經(jīng)驗(yàn)和存在的問題進(jìn)行一下總結(jié)。第193頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三

一、紫外線低溫包埋機(jī)（SPI#17020）

第194頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三

SPI#17020是美國特殊研制的低溫包埋機(jī)，它最主要的特點(diǎn)是采用數(shù)字化溫度控制，通常采用干冰制冷，也可以使用液氮制冷，溫度可以控制在-10℃～-37℃之間。通過溫度控制風(fēng)扇可以使機(jī)內(nèi)的溫度控制在某一恒定溫度，持續(xù)長達(dá)36小時(shí)，完全可以滿足低溫脫水、浸透和包埋所需的時(shí)間。它占地面范圍小，但機(jī)內(nèi)空間較大，可以同時(shí)放入72個(gè)包埋膠囊。而且機(jī)箱上方有兩個(gè)封閉起來的波長為360nm的紫外燈，低溫和室溫下的紫外線聚合都可以在包埋機(jī)中進(jìn)行?？傊?，紫外線低溫包埋機(jī)是很理想的低溫脫水、浸透、聚合的機(jī)器。第195頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三

二、LowicrylsK4M低溫包埋劑

LowicrylsK4M是丙烯酸鹽和甲基丙烯酸鹽化學(xué)物質(zhì)，其特點(diǎn)是能在低溫下保持低粘度，能很快滲入組織以及具有在波長360nm的紫外光照射下聚合的能力，它的光聚合作用與溫度無關(guān)，而且LowicrylsK4M具有親水性，因此它能較好地保持組織結(jié)構(gòu)和抗原性，減少背景染色。第196頁，講稿共206頁，2023年5月2日，星期三三、方法1.包埋劑的配制商品提供的LowicrysK4M包埋劑由三個(gè)部分組成：單體，交聯(lián)劑和引發(fā)劑。調(diào)整單體和交聯(lián)劑的比例，