生物分析檢測技術(shù)

關(guān)于生物分析檢測技術(shù)第1頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三實時熒光定量PCR儀、技術(shù)原理及應(yīng)用一、實時熒光定量PCR儀二、實時熒光定量PCR的技術(shù)原理

1.定量與常規(guī)的差別2.熒光擴(kuò)增曲線3.熒光閾值和CT值

4.熔解曲線5.標(biāo)準(zhǔn)曲線

第2頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三6.何為實時？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理9.TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用——基因表達(dá)分析11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹三、實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹1.醫(yī)療方面2.研究方面

3.其它方面四、熒光定量PCR實驗室所需儀器設(shè)備清單五、實時定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究第3頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三一、實時熒光定量PCR儀熱循環(huán)儀（PCR儀）熒光檢測系統(tǒng)計算機(jī)及軟件系統(tǒng)第4頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三不產(chǎn)熱的光源---

發(fā)光二極管（LED）靈敏度高的檢測器---

光電倍增管（PMT）優(yōu)點：

不產(chǎn)熱---無散熱裝置，全封閉無機(jī)械轉(zhuǎn)動裝置---抗震性強(qiáng)無需經(jīng)常校準(zhǔn)，耐用靈敏度高線性范圍廣第5頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

Opticon實時熒光定量PCR儀熒光檢測熱循環(huán)儀光色:藍(lán)色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes

精確性:±0.3°C激發(fā)光波長：450-495nm發(fā)射光波長:515-545nm

升降溫速率:最高3°C/秒.靈敏度:<5nM的熒光素溫度梯度:有檢測范圍:100-108拷貝容量:96樣品反應(yīng)管:0.2mL反應(yīng)管&96孔板操作系統(tǒng):WindowsNT第6頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第7頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三二、實時熒光定量PCR的技術(shù)原理1.定量與常規(guī)的差別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：對PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行定量及定性分析第8頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

SYBRGreenI定量原理

確定初始模板的濃度:

初始DNA量越多,熒光達(dá)到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系：根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量

第9頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三實時熒光定量PCR技術(shù)簡介實時熒光定量PCR技術(shù)簡介

實時熒光定量PCR技術(shù)簡介

實時熒光定量PCR技術(shù)簡介實時熒光定量PCR：其反應(yīng)體系中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。第10頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三2.熒光擴(kuò)增曲線熒光擴(kuò)增曲線可以分三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。熒光背景信號階段：擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺期：擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段：PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。第11頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三3.熒光閾值和CT值

熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。熒光閾值線的位置一般事實上位于減去本底的位置上，這時的熒光信號超過了熒光背景信號并且開始增加。對某一樣品的C（t）值就定義為熒光量與熒光閾值線交叉時的循環(huán)數(shù)。即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。

定量熒光擴(kuò)增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。第12頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第13頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三4.熔解曲線在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過程中的熒光值變化繪出每個樣品的熔解曲線。繪制熔解曲線時，Real-TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完全配對到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化過程。不同的擴(kuò)增產(chǎn)物因為其長度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當(dāng)產(chǎn)物解鏈時，SYBRGreenⅠ的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測到。由此繪制出熒光強(qiáng)度隨溫度變化的負(fù)一次倒數(shù)圖。熒光強(qiáng)度變化的拐點（熔點，Tm）即為熔解峰值。熔解曲線是擴(kuò)增反應(yīng)的質(zhì)控途徑，當(dāng)圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬：表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。第14頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第15頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第16頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

5.標(biāo)準(zhǔn)曲線CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系：起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表CT值，縱坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)（如圖3所示）。因些只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。第17頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Thistechnologyisvery

sensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable)Quantitationcanbe"relative"toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,or"absolute"whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.第18頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三6.何為實時？試劑方面：如何做到相對熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是PCR產(chǎn)物的相對量；如何做到相對熒光強(qiáng)度反應(yīng)的是特定PCR產(chǎn)物的相對量；儀器方面：如何測定相對熒光強(qiáng)度Opticon實時熒光定量實PCR儀試劑工作原理工作原理哪一步可以觀察到熒光信號？變性；復(fù)性；延伸應(yīng)用第19頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三7.SYBRGreenI的工作原理

SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部SYBRGreenI染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。SYBRGreenⅠ的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射強(qiáng)熒光信號;而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微弱熒光信號背景，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步。變性：無熒光信號，未結(jié)合SYBRGreenIDye通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物第22頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第25頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第26頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三SYBRGreenⅠ的特點由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因為模板不同而特別定制，因此通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴(kuò)增。此外，由于一個PCR產(chǎn)物可以與多個分子的染料結(jié)合，因此SYBRGreenⅠ的檢測靈敏度很高。但是，由于SYBRGreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準(zhǔn)確地分析SYBRGreenI。第27頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三CYBRGreenI

的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點起始模板濃度定量融解曲線分析：可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析

使用方便：不必設(shè)計復(fù)雜的引物沒有序列特異性：可以用于不同的模板便宜靈敏與非特異性產(chǎn)物結(jié)合第29頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

環(huán)與目標(biāo)序列完全配對

莖由互補(bǔ)配對的序列組成變性:產(chǎn)生非特異性的熒光延伸:沒有熒光第30頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第32頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三分子Beacons是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中：位于分子一端的熒光基團(tuán)與分子另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團(tuán)被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（FRET）。第33頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu)：是一個具有莖－環(huán)（loop-stem）結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，通常有25～35個核苷酸，兩端分別標(biāo)上一個熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)。分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)的部分用于與靶序列雜交（與目標(biāo)序列互補(bǔ)），通常由15～30個核苷酸組成，要求與靶序列雜交后能形成與探針－靶序列雙螺旋有關(guān)的反式構(gòu)型，并使干的部分打開，盡量得使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分開足夠的距離。一般莖（干的部分）一般5-8個核苷酸長（堿基對），并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。第34頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三熒光基團(tuán)連接在莖臂的一端，一般連在5’端；而淬滅基團(tuán)一般連在3’端。通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團(tuán)。分子Beacons必須非常仔細(xì)的設(shè)計，以致于在復(fù)性溫度下：

模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；

模板存在時則與模板配對。自由狀態(tài)時，分子信標(biāo)呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)靠得很近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（FRET和直接能量轉(zhuǎn)移），熒光基團(tuán)的能量被淬滅基團(tuán)吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅。。第35頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三當(dāng)有靶序列存在的時候，靶序列和分子信標(biāo)的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致分子信標(biāo)的構(gòu)象改變，干的部分打開，熒光基團(tuán)與猝滅基團(tuán)分開，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止；在有相應(yīng)的單色光激活時，熒光基團(tuán)發(fā)出熒光。熒光強(qiáng)度與溶液中靶序列的多少成正比，通過檢測熒光的強(qiáng)度就可以計算出靶序列的量。Beacons與模板配對后：分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團(tuán)與淬滅劑分開；當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。第36頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三分子Beacons不同于SYBRGreen的一個優(yōu)點就是它特異性地檢測感興趣的目標(biāo)DNA。通過精心設(shè)計分子Beacons和優(yōu)化反應(yīng)條件（溫度和緩沖液）后，其靈敏度非常高，可用于單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的檢測。但是，為檢測某一特定的目標(biāo)DNA，每一個探針都必須單獨仔細(xì)地設(shè)計。

分子Beacons是美國紐約公共健康研究學(xué)會的技術(shù)專利。第37頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第40頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三MolecularBeacons

的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點

定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測對目標(biāo)序列有很高的特異性，用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一熒光背景低設(shè)計困難無終點分析功能只能用于一個特定的目標(biāo)價格較高第41頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三9.

TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理

目標(biāo)特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑模板和探針雜交

延伸:聚合反應(yīng)，Taq酶切下5’端熒光素出現(xiàn)熒光第42頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第43頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第44頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第45頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第46頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第47頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第48頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三TaqMan(水解型雜交探針)的應(yīng)用范圍及優(yōu)缺點

定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析對目標(biāo)序列有很高的特異性,特別適合于SNP檢測與MolecularBeacons相比，設(shè)計相對簡單價格較高只適合于一個特定的目標(biāo)

不能進(jìn)行融解曲線分析第49頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetector

DeborahS.Grove

NucleicAcidFacility,LifeScienceConsortium,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA16802

第50頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Probe

Aprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforward

andreverseprimers.Theprobeislabeledatthe5‘endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein[6-FAM]，6-羧基熒光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

[TAMRA],6-羧基-四甲基-若丹明)addedatanyTpositionoratthe3'end.TheprobeisdesignedtohaveahigherTm

thantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridized

forsuccessoftheassay.第51頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter.However,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（內(nèi)在的，固有的）5'to3'nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.

第52頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Fluorogenic5'nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.第53頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.TheCt

isinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.

第54頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.第55頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples.BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.

Turn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequence

specificprobeisrequired.Userswillalsoneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mm

thermalmicroseal

filmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.第56頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（數(shù)不清的）.

DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.

GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.Setupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironment

thantraditionalPCRtechniques.Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.第57頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Allelic(等位基因的)discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.Oneprobelabeledwith6-FAM(6-羧基熒光素)representsoneallele（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.Amismatchleadsto

alessefficientamplification.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.第58頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal.Heterozygotes（雜合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.Allthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication第59頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

10.多色多通道技術(shù)應(yīng)用

——基因表達(dá)分析第60頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第61頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第62頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第63頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三PRIMERANDPROBEDESIGN

Primersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5'and3'ends.

PE/ABDPrimerExpresssoftware,

whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram.TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10°Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58°Cand60°C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5'Gs.第64頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase,andtheprobesonly

havetodifferbythatbase.AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.

第65頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa"probeless"alternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.第66頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

11.內(nèi)標(biāo)技術(shù)介紹第67頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第68頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第69頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三三、實時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用介紹第70頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用對DNA、RNA樣品進(jìn)行定量和定性分析定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。可以不定期對PCR產(chǎn)物或樣品進(jìn)行定性分析如：利用熔解曲線分析識別擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴(kuò)增；利用特異性探針進(jìn)行基因型分析及SNP檢測等。第71頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三目前實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應(yīng)用集中在以下幾個方面：比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等），及特定基因在不同相的表達(dá)差異；比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達(dá)量差異；驗證基因芯片實驗結(jié)果；驗證RNA干擾實驗結(jié)果。第72頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第73頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第74頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第75頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第76頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第77頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三四、熒光定量PCR實驗室所需儀器設(shè)備清單專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）

以上物品各一套。2~8℃和-20℃或-80℃冰箱混勻器耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心）高速臺式冷凍離心機(jī)第78頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三五、實時定量PCR及應(yīng)用于植物分子生物學(xué)的研究Microarray最強(qiáng)大的功能是平行分析，在單次實驗中同時觀察上萬種RNA的相對量變，也因為平行處理之故，無法對每一個probe做最佳化、標(biāo)準(zhǔn)化，所以目前大部份結(jié)果都會再以

NorthernblotorReal-timequantitativePCR再做確認(rèn)。雖然Northernblot在過去曾扮演十分稱職的角色，但有時microarray篩選出來的基因常有上千個譜，以傳統(tǒng)方法來驗證，仍是耗費(fèi)人力物力的苦差事。

Real-timequantitativePCR

在近年來迅速普及，原因在其高靈敏度、快速及精確，樣品需求量少也是很重要的優(yōu)勢，是最適合承接microarray驗證的工具。第79頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

LaserCapturedMicrodissection(LCM)

RealTimeQuantitativePCR：量化組織中特定基因之表現(xiàn)共聚焦顯微影像系統(tǒng)(ConfocalImagingSystem)流速細(xì)胞篩選分析系統(tǒng)(FlowCytometry)以上技術(shù)就基因表現(xiàn)之各個面相作系統(tǒng)探討。

第80頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三第81頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

實驗程序（舉例）RNA的定量：RNA的測量儀上，以NonoDrop軟件進(jìn)行RNA的定量(ng/μl)。如濃度過高必須稀釋后再定量，以便定量盡可能地準(zhǔn)確。同時，可從260/280的比值看出RNA的純度(一般在1.9-2.1之間)是否在要求的范圍內(nèi)。RNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA模板的稀釋：用作RNA反轉(zhuǎn)錄的RNA量，在鹽芥和擬南芥兩種材料、各200mMNaCl處理2小時及對照的4種RNA之間必須完全準(zhǔn)確一致，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的RNA量均為2000ng。以下的反轉(zhuǎn)錄體系中RNA和RNase-freeH2O的總體積為8.5μl

。第82頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三RNA+RNase-freeH2O：8.5μl(2000ngRNA)Oligo-dT18(500ng/μl)：0.5μldNTP(2.5mM/each)：4μl計

：13μl該體系于65-70℃，5min；置于冰上冷卻后，加下面反應(yīng)體系：5×

RTBuffer：4μl0.1MDTT：2μlSuperScriptIIIRT：1μl總計：20μl混勻，50℃保持6小時或過夜，即得到20μlcDNA；該cDNA稀釋20倍，即為400μl稀釋的cDNA，此用于實時定量PCR作為反應(yīng)模板。

第83頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三DTT即Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4H10O2S2。

是一種常用d的小分子有機(jī)還原劑，有抗氧化作用。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）。DTT的異構(gòu)體為Dithioerythritol（DTE），即DTT的氧化結(jié)構(gòu)。

第84頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三實時定量PCR(Real-timePCR)

SYBR?GreenPCRMasterMix：12.5μl稀釋的cDNA模板：2μlPrimer-F：1μlPrimer-R：1μl總計：25μl

第85頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三2-ΔΔCT方法與相對基因表達(dá)差異的分析使用內(nèi)標(biāo)基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的RNA進(jìn)行均一化處理，標(biāo)準(zhǔn)的看家基因一般都可被用作內(nèi)標(biāo)基因。適合于實時PCR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)基因包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），β-actin(細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin)、β2-microglobulin(微球蛋白)以及rRNA；當(dāng)然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標(biāo)。我們在應(yīng)用某一基因作為內(nèi)標(biāo)之前首先確證該基因的表達(dá)不會受實驗處理的影響。

第86頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三相對定量的方法分析基因表達(dá)差異(i)選擇一個內(nèi)標(biāo)基因；(ii)確定內(nèi)標(biāo)的有效性，確保它不會受到實驗處理的影響；(iii)通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板，確保它們的

擴(kuò)增效率相同。(iv)最后通過2-ΔΔCT計算將統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始CT值。ΔΔCT表示目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因CT值的差異;

2-ΔΔCT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達(dá)相對變化的一種簡便方法。第87頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Giovanna(2002)提出“相對CT”或“δ-δCT”的方法，這個方法的優(yōu)點是不需要為每次實驗制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，只需要一個優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的、至少是相似的反應(yīng)效率即可。比較CT方法的優(yōu)點是無需標(biāo)準(zhǔn)曲線、適合多個樣品，當(dāng)然它也消除了創(chuàng)造標(biāo)準(zhǔn)曲線時任何稀釋錯誤的不利影響。

第88頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三相比于標(biāo)準(zhǔn)子(normalizer)，比較CT法(ΔΔCT)在對模板進(jìn)行相對定量、監(jiān)測基因的表達(dá)水平時，不需標(biāo)準(zhǔn)曲線并增加了樣品的通量；為了使這個方法成功應(yīng)用，目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率必須相等。只要靶基因和標(biāo)準(zhǔn)者具有相似的動力學(xué)范圍，比較CT(ΔΔCT)方法就是最具有實際應(yīng)用價值的方法。第89頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三2-ΔΔCT方法中參照因子的選擇決定于基因表達(dá)定量實驗的類型；本實驗中參照因子是未經(jīng)NaCl處理的對照樣品；內(nèi)標(biāo)基因為標(biāo)準(zhǔn)的看家基因Actin。根據(jù)實驗獲得的經(jīng)驗值，使用公式：

1.9-ΔΔCT進(jìn)行統(tǒng)計分析。每個基因在兩種處理情況下的表達(dá)水平均來自3次實時定量PCR的平均值。第90頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Ct-ActinCt(control)Ct-ActinCt(200mMNaCl處理)deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDev第91頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三ThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia(缺氧癥）ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner,IsabelleDupuis,andCrisKuhlemeier*InstituteofPlantSciences,Altenbergrain21,CH–3013Berne,SwitzerlandPlantPhysiology,June2003,Vol.132,pp.968–978,?2003AmericanSocietyofPlantBiologists第92頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Fermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen,mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress.

Pyruvatedecarboxylase

(PDC,丙酮酸鹽(或酯)脫羧酶),whichcatalyzesthefirststepinthispathway,isthoughttobethemainregulatoryenzyme.PDCis

encodedbyfourcloselyrelatedgenes

inArabidopsis.

Usingreal-timequantitativepolymerasechainreaction,wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgene

indifferenttissues,undernormalgrowthconditions,andwhentheplantsweresubjectedto

anoxiaorotherenvironmentalstressconditions.第93頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三

PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses.Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genefamily.Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia，butALDH2B7

reactsstronglyto

ABAapplicationand

dehydration,suggestingthatALDHmayplayaroleinaerobicdetoxificationofacetaldehyde.Discussthepossibleroleofethanolicfermentationasarobustback-upenergyproductionpathwayunderadverseconditionswhenmitochondrialfunctionisdisturbed.第94頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Estimatingthecopynumberoftransgenesintransformedricebyreal-timequantitativePCR.

YangL,DingJ,ZhangC,JiaJ,WengH,LiuW,ZhangD.

SchooloflifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,800DongchuanRoad,Shanghai,200240,People'sRepublicofChina.

PlantCellRep.2005Mar;23(10-11):759-63.Epub2004Oct1.

第95頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Intransgenicplants,transgenecopynumbercangreatlyinfluencetheexpressionlevelandgeneticstabilityofthetargetgene,makingestimationoftransgenecopynumberanimportantareaofgeneticallymodified(GM)cropresearch.TransgenecopynumbersarecurrentlyestimatedbySouthernanalysis,whichislaboriousandtime-consuming,requiresrelativelylargeamountsofplantmaterialsandmayinvolvehazardousradioisotopes.

第96頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Reportherethedevelopmentofasensitive,high-throughputreal-time(RT)-PCRtechniqueforestimatingtransgenecopynumberinGMrice.UseTaqManquantitativeRT-PCRandcomparisontoanovelriceendogenousreferencegenecodingforsucrosephosphatesynthase(SPS)todeterminethecopynumbersoftheexogenousbeta-glucuronidase(GUS)andhygromycinphosphotransferase(HPT)genesintransgenicrice.第97頁，講稿共103頁，2023年5月2日，星期三Thecopynumbers

oftheGUSandHPTin

primaryricetransformants(T0)werecalculatedbycompari