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關(guān)于細胞自噬機制第1頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三克里斯汀·德·迪夫(ChristiandeDuve)比利時科學(xué)家ChristiandeDuve在上世紀50年代通過電鏡觀察到自噬體(autophagosome)結(jié)構(gòu),并且在1963年溶酶體國際會議(CIBAFoundationSymposiumonLysosomes)上首先提出了“自噬”這種說法。因此ChristiandeDuve被公認為自噬研究的鼻祖。ChristiandeDuve也因發(fā)現(xiàn)溶酶體,于1974年獲得諾貝爾獎第2頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三大隅良典2016年,因“在細胞自噬機制方面的發(fā)現(xiàn)”而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。大隅教授的貢獻在于,他找到了酵母這種簡單又與人體細胞相似的實驗?zāi)P?,將?fù)雜的問題化難為易了。第3頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三大隅良典宮崎駿第4頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三在酵母菌體內(nèi)(左側(cè))存在一個巨大的細胞器,名為液泡,其功能與人以及其他哺乳動物體內(nèi)細胞內(nèi)的溶酶體相類似。于是他培養(yǎng)了經(jīng)過改造,缺乏液泡膜降解酶的酵母菌并通過饑餓的方法激活細胞的自噬機制。此時,當這些酵母菌遭受饑餓時,吞噬小體開始在液泡內(nèi)部大量聚集(右圖)。大隅良典的實驗證明酵母菌內(nèi)部存在自噬現(xiàn)象。此后,大隅良典教授對數(shù)以千計的酵母菌變異樣本進行了核對(右側(cè)),并從中找到了據(jù)信與自噬作用密切相關(guān)的15組基因。第5頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三凋亡<apoptpsiS>與自噬<autophagy>表中可以看出,在過去的十年之中,幾乎每個生命科學(xué)家都知道“凋亡”這個概念并且有意無意將自己的研究工作與之掛鉤。自噬(autophagy)是繼凋亡(apoptosis)后,當前生命科學(xué)最熱的研究領(lǐng)域,Pubmed記錄的文獻數(shù)量在最近4年呈爆炸式增長,其中2006年以前相關(guān)文獻大約1500條。2007年是自噬研究有歷史意義的一年,召開了第一次自噬國際會議,與會人員構(gòu)成自噬學(xué)術(shù)圈的奠基者,并且在各自領(lǐng)域宣傳和研究一些基本概念。2007年到2010年9月短短三年文獻發(fā)表量達到大約4400條。我們堅信在未來十年“自噬”也將會成為另一個“萬金油”和生命科學(xué)的“閃亮新星”。第6頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三在大隅良典發(fā)現(xiàn)細胞自噬的關(guān)鍵機制之后,研究局面豁然開朗,相關(guān)論文發(fā)表量驟然上升。第7頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三細胞自噬的定義細胞自噬(autophagy)是真核生物中進化保守的對細胞內(nèi)物質(zhì)進行周轉(zhuǎn)的重要過程。該過程中一些損壞的蛋白或細胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后,送入溶酶體(動物)或液泡(酵母和植物)中進行降解并得以循環(huán)利用。第8頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三細胞自噬基本過程第9頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬基本過程:1.自噬前體的形成2.自噬體的形成3.自噬溶酶體的融合4.自噬體的溶解內(nèi)涵體自噬內(nèi)涵體溶酶體自噬溶酶體自噬前體自噬體第10頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三細胞自噬分類(根據(jù)進入溶酶體途徑不同)巨自噬微自噬分子伴侶介導(dǎo)的自噬第11頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三巨自噬內(nèi)外刺激誘導(dǎo)下,細胞通過自噬基因調(diào)控組裝自噬前體。自噬體包裹細胞質(zhì),細胞器或細菌等形成自噬體,在微管作用下,自噬體與溶酶體靠近,自噬體外層膜與溶酶體膜融合,包有內(nèi)層膜的自噬體進入溶酶體,形成自噬溶酶體。繼而,自噬體內(nèi)膜被溶酶體酶降解,繼而內(nèi)容物被降解,營養(yǎng)成分被細胞重新利用。第12頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三微自噬主要集中于酵母。當受到饑餓等刺激時,溶酶體膜局部凹陷,吞噬細胞質(zhì)或微體,形成自噬體。自噬體脫離溶酶體膜,進入溶酶體腔,由溶酶體酶降解,降解物質(zhì)被細胞再利用。第13頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)分子伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA):胞質(zhì)內(nèi)蛋白結(jié)合到分子伴侶后被轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中,然后被溶酶體酶消化。CMA的底物是可溶的蛋白質(zhì)分子,在清除蛋白質(zhì)時有選擇性,而前兩者無明顯的選擇性。分子伴侶:一類在序列上沒有相關(guān)性但有共同功能的蛋白質(zhì),它們在細胞內(nèi)幫助其他含多肽的結(jié)構(gòu)完成正確的組裝,而且在組裝完畢后與之分離,不構(gòu)成這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)執(zhí)行功能的組份第14頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬的特性1)自噬是細胞消化掉自身的一部分,即self-eating,初一看似乎對細胞不利。事實上,細胞正常情況下很少發(fā)生自噬,除非有誘發(fā)因素的存在。這些誘發(fā)因素很多,也是研究的熱門。既有來自于細胞外的(如外界中的營養(yǎng)成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等),也有細胞內(nèi)的(代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質(zhì)等)。由于這些因素的經(jīng)常性存在,因此,細胞保持了一種很低的、基礎(chǔ)的自噬活性以維持自穩(wěn)。2)自噬過程很快,被誘導(dǎo)后8min即可觀察到自噬體(autophagosome)形成,2h后自噬溶酶體(autolysosome)基本降解消失。這有利于細胞快速適應(yīng)惡劣環(huán)境。3)自噬的可誘導(dǎo)特性:表現(xiàn)在2個方面,第一是自噬相關(guān)蛋白的快速合成,這是準備階段。第二是自噬體的快速大量形成,這是執(zhí)行階段。4)批量降解:這是與蛋白酶體降解途徑的顯著區(qū)別5)“捕獲”胞漿成分的非特異性:由于自噬的速度要快、量要大,因此特異性不是首先考慮的,這與自噬的應(yīng)急特性是相適應(yīng)的。6)自噬的保守性:由于自噬有利于細胞的存活,因此無論是物種間、還是各細胞類型之間(包括腫瘤細胞),自噬都普遍被保留下來(誰不喜歡留一手呢?)。第15頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAP-LC3)12135-1-AP微管相關(guān)蛋白輕鏈3(MAP-LC3),簡稱LC3,參與了自噬的形成,并被證明了是哺乳動物細胞中常見的自噬小體標記蛋白之一。Westernblot可能會檢測到LC3的兩種形式,這是由于自噬形成時,胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I,LC3-I跟磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w)膜型(即LC3-II),這兩種形式在正常細胞中都是存在的,而發(fā)生自噬的細胞中LC3-II會有明顯的增加。第16頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三第17頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬小體的增多有兩種可能一是形成增加即自噬被誘導(dǎo);另外一種是自噬體成熟受抑即自噬體不能和溶酶體結(jié)合。自噬誘導(dǎo)劑1)BredeldinA/Thapsigargin/Tunicamycin:模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激2)Carbamazepine/L-690,330/LithiumChloride(氯化鋰):IMPase抑制劑(即Inositolmonophosphatase,肌醇單磷酸酶)3)Earle's平衡鹽溶液:制造饑餓4)N-Acetyl-D-sphingosine(C2-ceramide):ClassIPI3KPathway抑制劑5)Rapamycin:mTOR抑制劑6)XestosponginB/C:IP3R阻滯劑第18頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬的抑制劑根據(jù)自噬形成的過程,自噬的抑制也分為不同的階段,包括自噬的起始階段,自噬泡和溶酶體融合階段,以及溶酶體內(nèi)的降解階段。目前常用的一些抑制藥物如下:(1)對自噬體形成的抑制:主要是PI3K通路的抑制劑(如3-MA),這些藥物均可干擾或阻斷自噬體形成。(2)對自噬體與溶酶體融合的抑制:對自噬體與溶酶體融合過程進行阻斷也能起著抑制自噬的作用,這些藥物有巴伐洛霉素A1、長春堿、諾考達唑等。(3)對溶酶體降解的抑制:蛋白酶抑制劑,如E64d、PepstatinA等第19頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬體的檢測(1)以透射電子顯微鏡下超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)檢測。(2)自噬體膜標志性蛋白質(zhì)的檢測。(3)單丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。(4)檢測長壽蛋白的批量降解(5)CellTrackerTM
Green染色第20頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三細胞自噬功能(1)細胞自噬通過防御環(huán)境變化和應(yīng)激代謝反應(yīng)調(diào)控來維持細胞內(nèi)部的穩(wěn)態(tài)。(2)細胞自噬具有自我“清理”功能,可以處理細胞內(nèi)的廢物,降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)多聚體,減少DNA的損傷和染色體的不穩(wěn)定性,防止異常蛋白質(zhì)累積,還能降解功能失常的線粒體、高爾基體等細胞器,對蛋白質(zhì)和細胞器進行質(zhì)量控制,并且通過降解底物來為細胞生存提供原材料或ATP(3)細胞自噬甚至可以清除細胞內(nèi)的病原體,保護細胞免受損傷,對于對抗癌癥、衰老、神經(jīng)退行性病變、感染等都有著重要的意義。(4)細胞自噬是程序性細胞死亡的一種,在某些情況下,若細胞無法繼續(xù)維持自身的生存,細胞自噬會誘導(dǎo)細胞主動性死亡。第21頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三細胞自噬與腫瘤的治療第22頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬與腫瘤的關(guān)系與凋亡(在腫瘤細胞中一般都存在缺限)不同,自噬是被優(yōu)先保留的。無論是腫瘤細胞還是正常細胞,保持一種基礎(chǔ)、低水平的自噬活性是至關(guān)重要的。因為細胞中隨時產(chǎn)生的“垃圾”(破損或衰老的細胞器、長壽命蛋白質(zhì)、錯誤合成或折疊錯誤的蛋白質(zhì)等等)都需要及時清除,而這主要靠自噬來完成,因此,自噬具有維持細胞自穩(wěn)的功能;如果將自噬相關(guān)基因突變失活,如神經(jīng)元會發(fā)生大量聚集蛋白,并出現(xiàn)神經(jīng)元退化。同時,自噬的產(chǎn)物,如氨基酸、脂肪酸等小分子物質(zhì)又可為細胞提供一定的能量和合成底物,可以說,自噬就是一個“備用倉庫”。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就會餓死。更重要的是,自噬活性可在代謝應(yīng)激(饑餓、生長因子缺乏、射線、化療等)時大大增強,表現(xiàn)為胞漿中迅速涌現(xiàn)大量自噬體,這一現(xiàn)象被稱為“自噬潮”(autophagicflux),廣泛用于自噬形成的監(jiān)測。自噬潮為細胞度過危機提供了緊急的營養(yǎng)和能量支持,有利于細胞的存活。第23頁,講稿共25頁,2023年5月2日,星期三自噬可為腫瘤細胞帶來幾大好處1)腫瘤細胞本身就具有高代謝的特點,對營養(yǎng)和能量的需求比正常細胞更高,但腫瘤微環(huán)境往往不能如意
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