細胞重組與克隆技術(shù)

關(guān)于細胞重組與克隆技術(shù)第1頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

細胞重組(又叫細胞拆合)

是指從活細胞中分離出細胞器及其組分，然后在體外一定條件下將不同細胞來源的細胞器及其組分進行重組，使其重新裝配成為具有生物活性的細胞或細胞器的一種實驗技術(shù)。定義第2頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三從原生動物等低等生物的去精細胞或互換細胞核的細胞，可以清楚看出真核細胞的細胞核與細胞質(zhì)是相互配套、精確平衡的。例如，將變形蟲切成兩個半，一半有核、一半無核；無核的一半雖然仍能消化已經(jīng)吞噬的食物．但不能重新攝取食物、對外界刺激也不再發(fā)出反應(yīng)。同位素示蹤法證明，這無核的一半雖仍能吸收和結(jié)合無機磷，但其吸收和結(jié)合率均呈直線下降。在用電鏡觀察時．可發(fā)現(xiàn)其細胞內(nèi)的膜結(jié)構(gòu)如高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系等會出現(xiàn)退化。而有核的那一半照樣能夠攝食，對刺激也有反應(yīng)，失去的收縮泡可被補償，還能生長并及時分裂。如果用一顯微勾針將變形蟲的細胞核鉤出，這種變形蟲的行為就會變得與無核變形蟲一樣，如在及時植入同種變形蟲的另一個核，上述各種生命活動又會重新恢復。第3頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三在探討真核細胞的起源時。馬吉利斯(MaRdls)曾于1972年提出了內(nèi)共生學說：真核細胞起源于原核細胞，是幾個原核細胞共生結(jié)合的結(jié)果。如藍陰滴蟲，細胞內(nèi)含葉綠體，就是藍藻在陰滴蟲內(nèi)共生的結(jié)果；綠草履蟲體內(nèi)的綠色物體，就是與之共生的一種小球藻。

這種不同細胞的結(jié)合過程類似于細胞的自然裝配。特點第4頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

細胞的生長過程包含著細胞器的自我裝配，但這是一種活體的自我裝配，而細胞重組則是離體的裝配過程特點第5頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

1、將細胞融合技術(shù)與細胞核質(zhì)分離等技術(shù)相結(jié)合，為重新構(gòu)成不同類型的雜種細胞提供了可能。2、結(jié)合基因轉(zhuǎn)移技術(shù)可以人為地使細胞表達新的性狀和產(chǎn)生新的產(chǎn)物。因此細胞重組技術(shù)現(xiàn)巳成為現(xiàn)代生物工程中令人矚目的熱點課題之一。3、只有了解了生物合成和細胞裝配的全過程，才能實現(xiàn)掌握細胞、利用細胞、改造并進而創(chuàng)造出具有特定性狀相功能的工程細胞這一目標。從這點上講，細胞器重組技術(shù)對于揭示細胞活動規(guī)律具有重要意義。意義第6頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

一般而言，細胞重組的方式基本分為以下三種（1）胞質(zhì)體與完整細胞重組形成胞質(zhì)雜種（2）微細胞與完整細胞重組形成微細胞異核體（3）胞質(zhì)體與核體重組形成重組細胞8．1．2細胞重組技術(shù)第7頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

胞質(zhì)體是去除細胞核后由膜包裹的無核細胞。微細胞又可稱為微核體，含有一條或幾條染色體，外有一薄層細胞質(zhì)和一個完整的質(zhì)膜的核質(zhì)體。胞質(zhì)體和微細胞與完整細胞融合后就能產(chǎn)生相應(yīng)的雜合體。胞質(zhì)雜種細胞是不同種系之間形成的一種真正的新型細胞，在適宜條件下能成功的生存下去。第8頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

顯微操縱術(shù)細胞分離技術(shù)細胞破碎方法細胞器的分離胞質(zhì)體、核質(zhì)體和微細胞的制備第9頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

一般是在顯微解剖鏡下，把細胞放入消毒的培養(yǎng)液中，同時放入冷卻系統(tǒng)中以減慢細胞發(fā)育，然后借助一臺專門的裝置——顯微操作儀，用細微玻璃針或用微細管、微電極、微熱電偶等斜插入細胞中去，可以挑取細胞核，人工造就去核細胞；也可以進一步作移核實驗與電生理實驗。8.1.2.1顯微操縱術(shù)第10頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三8.1.2.1顯微操縱術(shù)第11頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

用這種儀器能夠進行細胞各部分的解剖、細胞各部分物質(zhì)的抽取和移植、各物質(zhì)的注入、測量微電位的變化等等。意義

1、實現(xiàn)細胞的拆合

2、為研究細胞內(nèi)的基因表達與調(diào)控和改良動物品種提供了一種重要手段。第12頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

分離細胞主要是根據(jù)細胞本身的某些特殊性質(zhì)來選擇合適的分離技術(shù)來分離具有同一性狀的細胞群、這些性質(zhì)包括：

細胞大小、密度、表面電荷、表面標志、細胞中一個或多個成分的熒光強弱、細胞對其他介質(zhì)的吸附作用8.1.2.2細胞分離技術(shù)第13頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

經(jīng)常采用的細胞分離方法如下：（一）差速離心（differentialcentrifugation）

在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器在差速離心中細胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。由于各種細胞器在大小和密度上相互重疊，而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中，一般重復2～3次效果會好一些。差速離心只用于分離密度和大小懸殊的細胞，更多用于分離細胞器。對于精細的分離，則是密度梯度離心效果更好。第14頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

第15頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

經(jīng)常采用的細胞分離方法如下：（二）梯度沉降分離法主要是根據(jù)細胞大小不同分離細胞、細胞在單位重力作用下，通過密度介質(zhì)、或在低離心力作用下通過梯度密度溶液沉降，由于細胞大小不同，沉降速度不同。細胞大，沉降快。常采用適當?shù)姆蛛x介質(zhì)形成一定的梯度密度溶液．這此介質(zhì)主要有：血清、蔗糖等：第16頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

（三）等密度沉降分離法主要是根據(jù)細胞密度差異來分離細胞。細胞在連續(xù)密度梯度分離介質(zhì)中、受強離心力的作用，最后到達與其密度相同的分離介質(zhì)層面，并保持平衡。如果是非連續(xù)密度梯度介質(zhì)中，細胞主要集中在介于其自身密度的兩種密度介質(zhì)交界面上，從而達到分離的目的。目前常采用的分離介質(zhì)有蛋白等。密度分離劑應(yīng)該具有無刺激，對細胞無吸附作用，產(chǎn)生的滲透壓小等特點第17頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(四)流式細胞儀分離法這種方法是以免疫熒光法使熒光抗體與細胞膜表面抗原結(jié)合，然后用超聲波處理使其分散成單個細胞，再將細胞懸浮液通過一個直徑為50um的噴嘴變成極細小的微滴，每個微滴一般含有一個細胞，以l0m/s的速度噴出。經(jīng)激光照射是細胞上所帶熒光被激發(fā)而轉(zhuǎn)換成脈沖．通過測定脈沖數(shù)就可以換算出各種不同細胞表面抗原的情況。同時由于懸浮微滴中的細胞帶有不同程度的負電荷，這樣在施加電場后。移行偏斜的程度不同，而不帶電荷的細胞仍以直線流過、借此可以收集得到不帶電荷或帶電荷多少不同的各種細胞。這種方法的優(yōu)點是分離速度快，分離得到的細胞仍能保持其功能；缺點是需要專門的設(shè)備。第18頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

細胞器的分離需要將組織細胞破碎，常用的方法包括(一)超聲波破碎法原理是：超聲波發(fā)生器產(chǎn)生高強度超聲信號，經(jīng)換能器傳送至與其接觸的細胞溶液中，由聲波沖擊和振動產(chǎn)生的剪切力使細胞破碎。缺點是破碎過程中會產(chǎn)熱，應(yīng)該注意冷卻。有些生物大分子不宜采用。8.1.2.3細胞破碎方法第19頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三第21頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

（二）反復凍融法使細胞溶液或組織細胞漿在超低溫冰箱或液氮罐內(nèi)凍結(jié)后，在37℃復溫融化，重復3-4次操作使細胞壁破碎。

(三)化學裂解法在細胞懸浮液中加入某些化學物質(zhì)如十二烷基硫酸鈉等使細胞膜裂解。在使用該方法的同時常要輔助以一些機械的方法才能使細胞在短時間內(nèi)完全破碎；由于化學裂解劑會干擾分析，在細胞裂解后應(yīng)注意清除化學裂解劑。第22頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(四)高速組織搗碎法主要借助高速組織搗碎機使細胞被高速旋轉(zhuǎn)的葉片破碎。由于也會發(fā)熱，可能導致分離物的降解，因此不能時間過長．必要時可使用循環(huán)水冷卻第23頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

為了研究細胞內(nèi)某種細胞器的生化組成、生理功能，或用于細胞重組，常需大量采集細胞的某些組分。常用的方法有：研磨、超聲振蕩和低滲等將組織制成勻漿，細胞中的一些亞組分就從細胞中釋放出來。然后采用以上介紹的沉降分離法實現(xiàn)分級分離。8.1.2.4細胞器的分離第24頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三實驗細胞器分離、制備與觀察【目的】1．掌握分離制備動物細胞線粒體的方法。2．對分離得到的線粒體進行活性鑒定。【原理】線粒體（mitochondria）是真核細胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。細胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過耦聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。第25頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三將動植物組織制成勻漿，在適當?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以分離細胞線粒體。在一定的離心場中(選用離心機的一定轉(zhuǎn)速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間，組織勻漿中的各種細胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器沉降先后順序是細胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第26頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；

pH7.2的條件下；亞細胞組分不容易重新聚集成團，有利于分離。整個操作過程樣品要保持在0℃~4℃，避免酶失活。第27頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三細胞器標記酶的測定是評價細胞器內(nèi)膜組分和分離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的染料被還原成無色。第28頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三鼠肝線粒體的分離【材料】鼠肝臟或豬肝臟。【實驗用品】1．試劑：(1)0.25mol／L蔗糖+0.01mol／L三羥甲基氨基甲烷(Tris)一鹽酸緩沖液(pH7.4)：

0.1mol／L三羥甲基氨基甲烷溶液10mL0.1mol／L鹽酸8.4mL

加雙蒸水到100mL，再加蔗糖使?jié)舛葹?.25mol／L。(2)0.34mol／L蔗糖+0.01mol／LTris一鹽酸緩沖液(pH7.4)，配法同上。第29頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三1％詹納斯綠B(JanusgreenB)染液姬姆薩染液(Giemsa)：2．器具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，刻度離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機。第30頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三【實驗步驟】1．制備肝細胞勻漿：實驗前將鼠空腹12小時，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織2g，剪碎；用預冷的0.25mol／L蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后按每克肝加4.5mL預冷的0.25mol／L蔗糖溶液的量，分數(shù)次添加蔗糖溶液，在0~4℃冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，用雙層紗布過濾。第31頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三2．差速離心：將0.34mol／L蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地加入4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按下圖順序進行差速離心。第32頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三分離細胞核：

沉淀(細胞核及質(zhì)膜碎片)鼠肝勻漿1500r/min,離心10min上清液(1)洗滌(0.25mol／L預冷蔗糖溶液5mL洗滌2次，每次1500r/min離心15min。沉淀(細胞核及質(zhì)膜碎片)上清液(2)→與上清(1)合并第33頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三分離細胞核：

沉淀(線粒體))混合上清液10000r/min離心10min上清液(棄去)洗滌,加預冷的0.25mol／L蔗糖溶液10mL，10000r/min離心10min沉淀(純化的線粒體))上清液(棄去)第34頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三活性鑒定：

(1)細胞核：取核沉淀1滴涂于載玻片，加入Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸3:1）15min，晾干。Giemsa染液染10min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水、用顯微鏡(40×)檢查，細胞核呈紫紅色，混雜的胞質(zhì)為淺藍色碎片。(2)線粒體：取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加1％詹鈉斯綠溶液染液，10min后用光學顯微鏡觀察，線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。第35頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三這三種是細胞重組常用的幾個原料，因此在此重點介紹(一)胞質(zhì)體方法

細胞松弛素B處理體外培養(yǎng)細胞能誘發(fā)其排核，結(jié)合高速離心得到了胞質(zhì)體。影響制取胞質(zhì)體的因素：

容器，有玻璃片、塑料片、離心管、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等，需在滅菌恒溫培養(yǎng)室中進行。

適宜的溫度、細胞松弛素B的劑量、培養(yǎng)液濃度及其血清含量、離心速度、細胞密度等。8.1.2.5胞質(zhì)體、核體和微細胞的制備第36頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

特點：

植物細胞的胞質(zhì)體內(nèi)的細胞器與完整細胞相同，具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系、線粒體、溶酶體、高爾基體和中心粒及微粒、微管等骨架系統(tǒng)，各細胞器仍占有固有的位置。線粒體的運動十分活躍，線粒體膜上各酶系的分布及氧化磷酸化過程都照樣存在。胞質(zhì)體內(nèi)線粒體內(nèi)自主性的DNA復制尚能有限地進行著。

蛋白質(zhì)的合成在去核后的一段時間內(nèi)持續(xù)進行。因此，去核細胞質(zhì)體是深入研究細胞質(zhì)作用的重要樣品。第37頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

（二）核體與胞質(zhì)分離得到的細胞核，帶有少量胞質(zhì)并圍有質(zhì)膜，稱為“核體”。核體能重新再生其胞質(zhì)部分，繼續(xù)生長、分裂。為了生產(chǎn)大量的核體，必須采用一系列的純化技術(shù)，以防夾雜完整細胞和胞質(zhì)體?？稍谌ズ颂幚砗?從離心管底部收集樣品,接種于培養(yǎng)皿內(nèi),溫育1-2h，由于核體的貼壁率大大低于殘留完整細胞的貼壁率，可從上清液中收集得到較純凈的核體。如此重復1-2次,可使核體的純度高達99％。第38頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(三)微細胞秋水仙素及其衍生物和長春新堿等有絲分裂阻斷劑能干擾微管的合成與裝配，而使染色體停滯在有絲分裂中期。經(jīng)體外培養(yǎng)，在單個染色體或染色體周緣就會重現(xiàn)核膜而形成含有一個微核、一薄層細胞質(zhì)和一個完整質(zhì)膜的微細胞。這種微細胞僅含有一個或數(shù)個染色體的DNA，也是細胞拆合工程的一種有用材料。第39頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

用上述方法從活細胞中拆散出來的胞質(zhì)體、核體、微細胞為材料，通過顯微操縱術(shù)，在光學顯微鏡下用顯微操縱器把材料重新組合，加入病毒或化學物質(zhì)如聚乙二醇等融合因子，經(jīng)過一段時間的作用，可以把它們更新裝配成新的活細胞。第40頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三8．2．1克隆的定義“克隆”“來源于希臘語。原意是用于扦插的枝條，也就是指無性繁殖。本意是指遺傳上完全相同的分子、細胞或來自同一祖先的生物個體的無性繁殖群體克隆是指一種實現(xiàn)無性繁殖的操作，而不是一般意義上的無性繁殖。8．2克隆技術(shù)第41頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8.2.2克隆的相關(guān)理論基礎(chǔ)

克隆在植物界已有上千年的歷史。但理論的上的突破則是發(fā)生在20世紀。

1902年德國植物學家哈伯蘭德提出，植物的體細胞具有母體全部的遺體信息，具有發(fā)育成為完整個體的潛能。因而每個植物細胞都可像胚胎細胞那樣，經(jīng)離體培養(yǎng)再生成為完整植株。這就是所謂的細胞全能性。第42頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

雖然，從理論上講，任何一個細胞都含有其生物體系基因組的全部基因，因此都可以被克隆。但實際上，動植物細胞克隆結(jié)果差別很大?？寺‖F(xiàn)象在植物界普遍存在。既可以是自然的。也可以是人工的。第43頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

與植物細胞不同，在動物發(fā)育過程中分化了的細胞不再產(chǎn)生完整的充分分化的個體，然而，動物胚胎的生長、分化和發(fā)育是否造成體細胞基因組的不可逆性修飾，即在發(fā)育過程中分化了的細胞是否具有與受精卵相同的核等價性或基因組連續(xù)性、一直是發(fā)育生物學要解決的問題第44頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

早在20世紀30年代，著名的胚胎學家斯佩爾曼就已經(jīng)提出了分化了的細胞核移入卵子中能否指導胚胎發(fā)育這樣的設(shè)想。用兩棲類動物進行的一些克隆實驗表明，早期胚胎細胞核經(jīng)移植可產(chǎn)生成熟的動物個體。也就是說尚未分化的胚胎細胞具有全能性?；谶@種認知、人們采用胚胎分割及胚胎細胞核移植技術(shù)成功克隆出了許多動物。第45頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

這種對動物細胞全能性的認識自1997年后得到改變，體細胞克隆動物“多利”羊的成功證明成熟的體細胞也具有全能性；后來，體細胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分證明高度分化的細胞核仍具有全能性。因此，人們對細胞全能性有了全新的認識。第46頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三目前，克隆技術(shù)最成功的應(yīng)用體現(xiàn)在克隆動物的培育上。下面將重點介紹的克隆主要是指以細胞核移植為核心技術(shù)的無性繁殖操作技術(shù)：8.2.3克隆的技術(shù)方法第47頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(一)定義

細胞核移植技術(shù)是一種利用顯微操作技術(shù)將一種動物的細胞核移入同種或異種動物的去核成熟卵內(nèi)的精細技術(shù)。8.2.3.1細胞核移植第48頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三由于主要的遺傳物質(zhì)存在于細胞核中，因此，核移植的受體將具有與核移植供體完全相同的遺傳基礎(chǔ)，因此，細胞核移植技術(shù)在動物育種工作中具有十分重要的意義。因為它像植物中的組織培養(yǎng)那樣，可以利用一頭優(yōu)質(zhì)的動物(例如高產(chǎn)的奶牛)復制出與它生得完全一樣的成千上萬的細胞核移植系動物。細胞核移植技術(shù)是克隆技術(shù)的關(guān)鍵。第49頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

細胞核移植所得到的雜種稱為核質(zhì)雜種。根據(jù)細胞核移植對象的不同可分為胚胎細胞核移植、體細胞核移植等。開始時，進行細胞核移植主要是為了研究胚胎發(fā)育進程中細胞核和細胞質(zhì)功能及兩者之間的關(guān)系，探索有關(guān)遺傳、發(fā)育和細胞分化等方面的理論問題。后來發(fā)現(xiàn)，這項技術(shù)可以實現(xiàn)不同細胞核和細胞質(zhì)的組配，從而培育出新物種。第50頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(二)發(fā)展歷史

1、提出思想第一個提出對動物進行細胞核移植實驗的人是諾貝爾獎獲得者德國胚胎學家漢斯?施佩曼博士，他構(gòu)想了一個“奇異的實驗”：把一個卵細胞的細胞核取出，然后把取自另一個發(fā)育到后期的胚胎的細胞核放入這個卵細胞中。但由于技術(shù)等方面的原因使他沒能找到將細胞核導入卵細胞的方法。第51頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

2、建立技術(shù)及低等動物試驗1952年，美國人羅伯特.布里格斯和T．J．金首先利用兩棲類卵細胞建立了細胞核移植技術(shù)。第52頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三3、高等動物試驗經(jīng)過大量低等動物實驗成功之后，研究人員開始進行哺乳動物的移核試驗。最早用來作移核試驗的哺乳動物是小鼠。1977年，美國的杰克遜實驗室用“亞無性繁殖”的方式，培育出7只單親小鼠。因為此種小鼠的體細胞中只有母體一方的染色體，故稱之為單親小鼠。第53頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

隨著技術(shù)手段的發(fā)展和進步，哺乳動物的細胞核移核實驗開始進入一個令人囑目的新階段。1981年，瑞士日內(nèi)瓦大學的卡爾?伊爾門澤和美國杰克遜實驗室的必得?霍普首次對小鼠卵進行移核試驗獲得成功。他們將囊胚內(nèi)細胞團細胞的核移入去核的受精卵中，經(jīng)培養(yǎng)移核卵發(fā)育到囊胚期、再將此胚胎植入同步孕小鼠的子宮內(nèi)，最后產(chǎn)下兩雌一雄仔鼠，并發(fā)育成了可育的個體。第54頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

我國的細胞核移植技術(shù)工作開始于20世紀50年代，主要是在兩棲類和魚類上進行的。1961年開始，童第周等以金魚和鳑被魚為材料，進行魚類不同亞科間的細胞核移植獲得成功，用以研究雜交細胞核與純種細胞核在發(fā)育功能上的差異以及細胞質(zhì)對細胞核的影響。我國的細胞核移植研究第55頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

1980年4月，中國科學院武漢水生生物研究所利用鯽魚做移核試驗，成功地培育出兩尾無性繁殖的幼魚。之后的1989年，童第周、牛滿江又將鯽魚胚胎細胞核移入鯉魚去核的未受精卵中，實現(xiàn)了不同種間的核質(zhì)雜交，成功地無性繁殖了“鯉鯽核魚”新品種，這個新品種的“鯉鯽核魚”既具有鯽魚的鮮美味道，又具有鯉魚的生長快速。第56頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

2008年，鯉鯽移核魚是采用無性雜交的細胞工程技術(shù)，將荷包紅鯉的囊胚細胞核移植到鯽魚的去核卵中而發(fā)育形成的后代。其魚體呈紅色，外形特征與鯉魚相似，但也同時具有一些鯽魚的特征，具有比較穩(wěn)定的遺傳性狀。F1～F4代（1～4子代），基本性狀趨于一致。其生長速度明顯快于鯽魚，并且比荷包紅鯉快35％左右。用鯉鯽移核魚F2雄性與鏡鯉雜交而獲得的雜交一代被稱為穎鯉。穎鯉具有明顯的生長優(yōu)勢，其生長速度比雙親快42％左右。第57頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

鏡鯉(德國)第58頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

細胞核移植技術(shù)的建立，為今天的哺乳動物體細胞克隆打下良好的實驗基礎(chǔ)。哺乳類細胞核移植技術(shù)的發(fā)展和成功，經(jīng)歷的是一個艱難曲折的過程。哺乳類卵細胞的體積很小，因此哺乳類的移核實驗必須采用顯微操作技術(shù)，從而對細胞進行細微手術(shù)，如：細胞核移植、基因注入以及單個細胞的分離。8．2．3．2核移植技術(shù)第59頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

這種裝置可以在機械或電子的控制下人工操縱也可以把程序輸入微機，自動進行抓、切、擠壓、注入、縮回等動作。也可用激光做切割工具顯微操作技術(shù)的發(fā)展對研究細胞核質(zhì)關(guān)系、基因工程、克隆技術(shù)的作用越來越大。8．2．3．2核移植技術(shù)第60頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三細胞核移植必須有一個前提，就是要盡量保證核供體和受體細胞處于同樣的細胞周期，高等細胞發(fā)展到一定階段時都要進行有絲分裂，而各種細胞的有絲分裂周期是各不相同的。在哺乳動物核移植實驗中的核供體細胞和核受體細胞可能處在細胞周期的不同階段上。現(xiàn)在可以通過采用“饑餓技術(shù)”來減慢細胞活動、迫使供體細胞處于某種休眠狀態(tài)，以期獲得與受體細胞同步的狀態(tài)，便于兩者的結(jié)合。第61頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

我國在細胞核移植技術(shù)選育魚類新品種方面處于世界領(lǐng)先地位，以魚類細胞核移植為例，詳細介紹一下細胞核移植技術(shù)要點：

(一)供體和受體的準備

供體通常為魚類的囊胚細胞或成體細胞。

受體為成熟的卵細胞。該受體卵一般可通過人工催產(chǎn)的方法得到。卵子在接受供體核之前要先激活來獲得發(fā)育能力。

對于魚卵而言，當它被擠入水中即可被激活。對于兩棲類動物的卵可采用針刺方法。最關(guān)鍵的是供體和受體在發(fā)育時間上要配合好，保證在受體成熟卵剛產(chǎn)出時,供體受精卵發(fā)育至囊胚期。第62頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(二)去卵膜和卵核可用小鑷子在解剖顯微鏡下仔細剝?nèi)ヂ涯?，或用適當?shù)囊鹊鞍酌溉芤很浕涯?，?jīng)過輕輕晃動，使卵子從中脫出。

魚卵----極細的玻璃微針借助第二極體標志(卵核位于極體下方)挑出細胞核。

兩棲類----紫外線照射受體卵達到去核目的。第63頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(三)供體細胞制備將發(fā)育至囊胚期的胚胎或組織器官進行機械切割，置于胰蛋白酶溶液中處理幾分鐘，直至分離出單個細胞。也可將囊胚細胞或得到的離體細胞短期培養(yǎng)后用作供體。第64頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(四)移核由于細胞核極小，而且脆弱，因此需要極其小心，防止損傷細胞核或傷害到細胞質(zhì)。實際上核移植時，核周圍的少量細胞質(zhì)也一起注射進了去核后的受體細胞中了。30-40min中內(nèi)完成，溫度：16-18℃第65頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

克隆可以通過不同來源的細胞核移植來實現(xiàn)，如胚胎細胞、干細胞、成纖維細胞、體細胞等。其中以胚胎細胞克隆的應(yīng)用比較普遍，以體細胞克隆的意義最大。8.2.3.3克隆動物一般制備技術(shù)第66頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三移植細胞核的來源不同分為

胚胎細胞核移植法胚胎干細胞核移植胎兒成纖維細胞核移植體細胞克隆技術(shù)第67頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

（一）胚胎細胞核移植法將未著床的早期胚胎分散成單個的細胞，在電流的作用下，使單個細胞與去除染色體的未受精的卵母細胞融合。發(fā)育成胚胎后，移入受體妊娠產(chǎn)仔。第68頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

原則上，一枚早期胚胎有多少個細胞，通過這種方法就可以克隆出多少個個體。還可將細胞反復克隆出更多的胚胎，產(chǎn)生更多克隆動物。圖8-2顯示的是對胚胎細胞進行核移植克隆出動物的具體過程，由圖8-2可以總結(jié)出圖8-3所示的克隆動物培育的一般過程。第69頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

第70頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

1984年，英國科學家施特恩?維拉德申在仙臺病毒或電激誘導下，成功地克隆了一只小綿羊，從此為家畜哺乳動物的克隆工作開啟了先河。

目前經(jīng)此法克隆出的動物有小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛、猴等。第71頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

日本通過移植牛受精卵細胞核的方法于1945年克隆了兩頭雄性“孿生?！?。1990年以來，日本國內(nèi)已經(jīng)成功克隆了150多頭牛。

1998年9月新聞報道，日本已有大量克隆肉食牛上市。第72頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

中國科學院發(fā)育生物所于1990年最早進行兔細胞核移植實驗。我國的哺乳動物細胞核移植實驗，首先在山羊的克隆上獲得成功。

1990年，西北農(nóng)業(yè)大學利用細胞核移植的方法得到了克隆山羊。

1992年，江蘇省農(nóng)業(yè)科學研究院核移植兔成功。

1995年，中國科學院發(fā)育所與楊州大學合作，利用細胞連續(xù)核移植的方法克隆山羊成功。1995年，廣州華南師范大學激光生命科學所和廣西農(nóng)業(yè)大學動物繁殖研究室合作，成功地克隆了一頭黑白花牛和黃牛的雜種牛。第73頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

1995年10月，西北農(nóng)業(yè)大學畜牧所采用胚胎細胞核移植技術(shù)，克隆了6只小豬。

1996年12月，克隆小鼠在湖南醫(yī)科大學誕生。

哺乳動物的胚胎細胞在分裂成8細胞以前，所有的單卵裂球均為全能細胞，即每個卵裂球均能表達此個體的全部基因。理論上這時的每個卵裂球經(jīng)過核移植，都能發(fā)育成遺傳性狀完全相同的個體。

這些工作為進一步研究細胞核和細胞質(zhì)的相互關(guān)系建立了很好的模型。第74頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三（二）胚胎干細胞核移植將胚胎或胎兒的原始生殖細胞經(jīng)過抑制分代培養(yǎng)后，細胞數(shù)量增多，單細胞卻不分化。因此，每個細胞仍然具有細胞全能性而發(fā)育成個體的能力，這樣的細胞被稱為胚胎干細胞系。

再利用細胞核移植技術(shù)，可以比胚胎核移植生產(chǎn)出更多的動物個體。

但目前僅有小鼠分離克隆出其胚胎干細胞系并成功克隆出成體鼠。第75頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

新華社倫敦2009年７月８日電（記者黃堃）英國科研人員８日報告說，他們利用胚胎干細胞首次成功制造出人類精子，但科研人員表示不會將這種試管精子用于人工授精。英國紐卡斯爾大學８日發(fā)表新聞公報說，該校和東北英格蘭干細胞研究所等機構(gòu)的科研人員利用一種含有視黃酸等物質(zhì)的培養(yǎng)介質(zhì)，對含有Ｘ和Ｙ兩種染色體的男性胚胎干細胞進行培養(yǎng)，并促使其實現(xiàn)完全的減數(shù)分裂，最終培養(yǎng)出含有23條染色體的試管精子。研究人員卡里姆·納耶尼亞說，這項研究有助于深入分析男性不育的原因，并用相關(guān)知識幫助那些希望有孩子的不育夫婦。例如，由于采用化療方法，被治愈的白血病男性患兒成年后可能不育，這項研究便可幫助分析其中的原因。研究人員同時表示，他們不會利用試管精子進行人工授精，這不僅是因為英國法律不允許，且從科學角度講，這樣做對研究小組也沒有意義。第76頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三生物學家卡里姆調(diào)制出一種化學物質(zhì)和維生素構(gòu)成的“雞尾酒”，在這種“雞尾酒”培養(yǎng)環(huán)境下，人體干細胞轉(zhuǎn)變成精子。第77頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三（三）胎兒成纖維細胞核移植從妊娠早期胎兒分離出胎兒成纖維細胞，采用細胞核移植方法克隆出胚胎，經(jīng)移植受體后，妊娠產(chǎn)仔，克隆出動物個體。

1996年，英國報道利用此法克隆出3只山羊。第78頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

是將動物體細胞經(jīng)過抑制培養(yǎng)，使其處于休眠狀態(tài)，利用細胞核移植技術(shù)將其導入去核卵母細胞，發(fā)育成胚胎后移植至受體，妊娠產(chǎn)仔，克隆出成體動物。8.2.3.4體細胞克隆技術(shù)第79頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

早在20世紀50年代就有利用體細胞克隆成體蛙的先例，其后的科學家們幾十年來一直在利用體細胞期望克隆出哺乳動物個體、但均未成功。1997年2月23日．英格蘭愛丁堡羅斯林研究所和PPL制藥公司的胚胎學家伊恩?維爾穆特博士的研究小組經(jīng)過多年的無性繁殖實驗無性繁殖了一只雌性小綿羊——“多莉”(見圖8—4)。維爾穆特解釋他的多莉是“有史以來第一次通過成熟細胞的核移植生產(chǎn)出來的動物后代”多莉與以往的克隆動物的最大區(qū)別是它的核供體是高度分化了的體細胞——乳腺上皮細胞，而不是尚保留細胞全能性的早期胚胎細胞。這是克隆技術(shù)領(lǐng)域的一項重大突破，利用這一技術(shù)可以大批復制某一動物。第80頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三第81頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三多莉培育者之一

——伊斯維姆.穆特第82頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

以克隆羊多莉的制備過程為例詳細介紹一下體細胞克隆動物的技術(shù)。(1)供體的選擇

芬蘭多塞特白品種綿羊的乳腺細胞

取處于后三分之一妊娠期的6歲母綿羊(芬蘭多塞特白品種綿羊)的乳腺細胞作核供體細胞，用“饑餓法”使具進入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。第83頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三(2)受體的選擇

蘇格蘭黑面母綿羊卵細胞

注射促性腺激素GN促使母羊排卵，28-33h取其未受精卵快速去核，放入10%FCS(小牛血清)、1％FCS和0.5％FCS連續(xù)5天，饑餓使其進入G0期作為受體細胞。第84頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三(3)乳腺細胞注射GN

34-36h后與無核卵放入同一培養(yǎng)皿中。在微電流作用下乳腺細胞融入卵中，形成一個含有新遺傳物質(zhì)的卵細胞。第85頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

(4)將新的卵細胞植入羊的結(jié)扎的輸卵管內(nèi)、6天后發(fā)育成桑椹期胚胎或囊胚(8-16個細胞)，再移入假孕母羊子宮內(nèi)。(5)產(chǎn)下多莉即為6歲母羊的復制品，也為白色。第86頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三第87頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

能使異種動物借腹妊娠、產(chǎn)仔，加快珍稀動物繁殖，搶救瀕危動物(如大熊貓)；

建立重要疾病的基因模型，生產(chǎn)生物活性藥物。

為了解細胞發(fā)育的潛能性、細胞核和細胞質(zhì)之間相互關(guān)系、胚胎發(fā)生死亡及其調(diào)控研究提供了新視角，因此對揭示生命科學重大基礎(chǔ)理論問題具有重要的科學價值。8．2．4克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義第88頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

動物克隆近幾年取得的一些突破性進展，為動物發(fā)育過程中基因表達的調(diào)控及發(fā)育生物學、遺傳學等相關(guān)學科的發(fā)展必將產(chǎn)生深遠的影響。盡管目前這種方法尚不成熟，但它已顯示出誘人的應(yīng)用的前景。8．2．4克隆技術(shù)的應(yīng)用與意義第89頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

在多莉羊誕生之前，普遍認為低等生物和高等植物的細胞具有全能性，而高等動物的體細胞沒有全能性。

目前克隆技術(shù)取得的結(jié)果，為再生、修復、治療組織器官缺損等奠定了理論基礎(chǔ)，也增加了采用高度分化的體細胞克隆各種動物的信心。8.2.4.1檢驗動物細胞全能性第90頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8．2．4．2加速動物繁殖、優(yōu)良育種、保護珍貴動物

由于體細胞數(shù)量巨大和易于獲得，因此動物克隆技術(shù)有助于加速動物育種的進程。

利用優(yōu)良動物品種的體細胞作核供體克隆動物，可以避免自然條件下選種所受到的動物生育周期和生育效率的限制，從而大大縮短育種年限，提高育種效率。（大熊貓交配的季節(jié)在春季三至五月份，通常不超過2－4天。）第91頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

也可以結(jié)合基因工程技術(shù)將具有特殊功能的基因(如具有一些經(jīng)濟性狀、抗蟲、抗病等)導入體細胞，然后用克隆技術(shù)培育出人們希望的動物新品種。

200l年4月，一種具有極高科學價值的商品—利用克隆技術(shù)培育的金魚由美國一家基因復制公司投放市場，這標志著克隆動物已經(jīng)開始了商業(yè)化歷程。第92頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三克隆瀕危物種

2002年4月27日,中國農(nóng)業(yè)大學成功克隆了第一頭優(yōu)質(zhì)中國黃牛,這標志著中國在動物體細胞克隆領(lǐng)域取得了重要進展。這頭名為“波娃”的體細胞克隆中國黃牛所使用的核供體細胞來源于一頭不足六個月的冀南牛純種小母牛的耳朵皮膚組織,而使用的卵母細胞取自于屠宰場宰殺后的母牛卵巢?！安ㄍ蕖迸c其供體細胞的遺傳物質(zhì)完全相同,而與其代孕母親———荷斯坦奶牛在遺傳上分屬不同來源。該次克隆成功屬國際首次,此次克隆中國優(yōu)質(zhì)黃牛的成功使目前挽救瀕臨滅絕的優(yōu)良黃牛品種成為可能。第93頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三西門塔爾牛外貌特征:黃白花或淡紅白花頭

生產(chǎn)性能:西門塔爾牛肉、乳用夏洛萊牛外貌特征:被毛為白色或乳白色生產(chǎn)性能:長勢快，瘦肉產(chǎn)量高利木贊牛外貌特征:毛色為紅色或黃色

生產(chǎn)性能:產(chǎn)肉高，肉質(zhì)量好

魯西黃牛外貌特征:個體大，產(chǎn)肉率高

生產(chǎn)性能:繁殖率高，肉質(zhì)好第94頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

動物克隆技術(shù)用于拯救瀕危動物也受到廣泛的關(guān)注。中國科學院動物研究所陳大元研究員提出用動物克隆技術(shù)拯救大熊貓的計劃，在國內(nèi)外均引起一定的反響。第95頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三克隆寵物

2004年8月6日美聯(lián)社報道:美國加州“遺傳儲存與克隆”公司近日正式宣布,他們成功地培育出了世界上首對克隆寵物貓,今后,他們將在世界范圍內(nèi)推廣寵物克隆業(yè)務(wù),需要交納5萬美元的“克隆費”,你家的寵物就可以有個一模一樣的伙伴了。第96頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

由于克隆動物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實驗材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復性。利用克隆技術(shù)，可以用患者本人細胞培育出新組織，用來治療糖尿病、帕金森氏癥、神經(jīng)損傷等多種疾病。

用這種方法培育出的組織不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)8．2．4．3醫(yī)藥領(lǐng)域具有與患者正常組織完全相同的基因構(gòu)成第97頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

隨著人類胚胎干細胞培養(yǎng)技術(shù)的完善，科學家已開始研究利用克隆技術(shù)培育人胚胎，希望大批量生產(chǎn)治療疾病的干細胞。

移植器官來源不足是各國存在的普遍問題，所以人們開始致力于異種器官移植和克隆器官移植的研究。

人們可以用克隆動物的胚胎干細胞作異源移植，以解決人類移植器官供求矛盾。8．2．4．3醫(yī)藥領(lǐng)域第98頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

目前我國的年器官移植數(shù)量已經(jīng)位居世界第二，其種類和成功率也都達到或接近國際先進水平。

但還存在著基礎(chǔ)研究薄弱、研究體系分散和社會捐獻活體器官意識不強、數(shù)量較低以及相應(yīng)立法不完備等問題。第99頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

未來人類器官移植治療將集中在人對人的同體器官移植、動物對人的異體器官移植和克隆人體器官移植等方面。

其中克隆人體器官更具有光明的前景，將解決一系列移植方面的關(guān)鍵問題，不過目前其實際運用還為時過早，因為雖然現(xiàn)在可以復制具有機械功能的臟器，但如何還原其生化作用還有待于探索。第100頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

目前，我國科學家已成功復制了羊顱骨、雞肌腱和豬關(guān)節(jié)軟骨等組織，這意味著我國復制人體組織器官研究已進入了一個新階段。第101頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8．2．5．1技術(shù)尚不成熟現(xiàn)階段克隆動物等技術(shù)尚不成熟，還處于探索階段。目前所得到的克隆動物具有極大的偶然性和隨機性。迄今為止，克隆試驗的成功率始終很低。

例如，在培育多莉的過程中，科學家共克隆出277個綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個。

此外，克隆動物夭折率高，不少克隆動物天生患有疾病或體形過大。8.2.5正確看待克隆技術(shù)第102頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8．2．5．2克隆動物的體細胞突變、壽命及其他遺傳問題

基因突變與DNA復制次數(shù)緊密相關(guān)。分裂越多的體細胞發(fā)生突變的可能性就越大，這與通過克隆迅速獲得大量動物個體的目的相矛盾，是克隆動物材料來源不可避免的問題。

同時，由于克隆是無性繁殖，克隆動物沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補，將會加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。第103頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

此外，出于體細胞分裂代數(shù)是有限的，因此克隆動物的壽命是否會受到體細胞分裂代數(shù)的影響，也尚不清楚。2002年1月，“多莉”被診斷患有嚴重的關(guān)節(jié)炎，這是科學家對克隆生命的前景表示出擔擾。綿羊的平均壽命為為13年，多莉5歲半就患關(guān)節(jié)炎顯然過早。在多莉誕生后的3年多時間內(nèi)，已獲得了許多成活的體細胞克隆動物。但是，在大多數(shù)研究中，都出現(xiàn)了高頻率的出生體重增加，以及胎兒或新生兒的死亡。因此、就目前的研究來看，動物克隆技術(shù)要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化是非常困難的。第104頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8.2.5.3是否是完全的“復制”

就遺傳的角度而言?？寺游锏男誀羁赡芘c其來源的親本完全相同，但是至少以下一些因素會影響克隆動物的遺傳性狀：

(1)細胞突變(2)受體卵細胞的細胞膜和細胞質(zhì)差異(3)受體遺傳上或生理上的差異(4)后期生長的環(huán)境與馴化第105頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

大多數(shù)人認為，克隆是復制的同義詞，復制品與原件是完全一樣的。DNA的復制結(jié)果就是如此，所以復制用于DNA的合成是一個非常確切的術(shù)語。

克隆則是一個過程，克隆產(chǎn)生的個體還需進行胚胎發(fā)育和胎后發(fā)育，克隆個體與原件之間有一段年齡差異。由于發(fā)育過程既受基因主宰又受環(huán)境調(diào)控，而克隆與其原本盡管基因相同，所處環(huán)境卻絕不會相同，所以，克隆與其原本不可能像復制品與原件那樣完全一樣的。第106頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

再者，雖然克隆個體是由核移植產(chǎn)生的，但由于重建細胞的細胞質(zhì)并非來自原本，而我們知道細胞質(zhì)中也有遺傳物質(zhì)，它們必然會對個體產(chǎn)生影響，所以不能把克隆個體看成是原本的復制品。盡管從遺傳結(jié)構(gòu)上看克隆個體和原本是姐妹(兄弟)關(guān)系，但從年齡上看它們卻是親子關(guān)系。無性繁殖的生物仍然有”代”的概念，克隆個體也應(yīng)有”代”的概念。

而且，克隆個體和原本是可以同時存在。因此，準確地說，克隆個體可以看成是原本的再生，但不是原本的復活。第107頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三有性生殖是生物在長期進化過程中的自我選擇、適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果，是一種有利于種族繁衍和生存的生殖方式。從這個角度來講，用克隆動物繁殖生物可能給生物的生存和自然界帶來意想不到的后果，同時，最關(guān)鍵的是，這種繁殖方式會造成基因的丟失，不利于遺傳物質(zhì)和生物多樣性的保護。于是，有學者認為，克隆動物是違反生物進化規(guī)律的，是一種倒退。8.2.5.4克隆動物的可應(yīng)用型的思考第108頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

總之，克隆技術(shù)的低效率以及克隆動物后代出現(xiàn)的體重增加、體弱多病等事實，使得單獨的克隆技術(shù)在近期內(nèi)難以得到推廣應(yīng)用。

可見，在當前世界上的克隆技術(shù)還不成熟的今天，人類要克隆出健康的動物仍是相當困難的，也就是說克隆技術(shù)在實踐中真正應(yīng)用還有相當長的路要走。8.2.5.4克隆動物的可應(yīng)用型的思考第109頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三克隆人的研究進程

１、克隆人制備過程

將普通的男性細胞或者是體細胞和一枚女性卵子結(jié)合起來，儲存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除。通過細胞分裂形成的胚胎應(yīng)只帶有這名男性的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，獲得男性克隆后代。

當然，如果一對夫婦愿意的話，也可以克隆女性。8.2.5.5社會學和倫理學問題第110頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

2002年12月27日,46歲的法國“女科學家”布里吉特?布瓦瑟利耶宣布,“世界上第一個克隆嬰兒已經(jīng)降生”。美國麻省理工學院的生物學家魯?shù)婪?居內(nèi)什對克隆嬰兒的真實性表示懷疑。他說:“克隆羊多莉是在277次實驗后才成功的,而布瓦瑟利耶說她進行了10次克隆人實驗就有5次受孕成功,令人懷疑?！?003年1月5日,布里吉特?布瓦瑟利耶又透露第二名克隆嬰兒在荷蘭誕生。第111頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

克隆是將一個體細胞的DNA移入一個已經(jīng)被去掉細胞核的卵細胞中，然后用電激或者化學方法刺激這個改造后的卵細胞，使它開始分裂并成為一個胚胎，這個胚胎的基因是與體細胞提供者的基因完全一樣的。因此克隆人類便會產(chǎn)生倫理道德方面的問題。第112頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

一個例子——人+動物

中山醫(yī)科大學陳系古教授等于2001年1月以來，先后使用“核移植”技術(shù)，將人類皮膚細胞核移植到家兔卵母細胞中，經(jīng)過２０００多次實驗，成功克隆出１００多個人類胚胎，其中部分發(fā)育到“桑葚胚”階段。這是國際上首次用該技術(shù)克隆出人類胚胎。

但有些學者就對在家兔卵母細胞中克隆出人類胚胎的提出質(zhì)疑，認為這是違背人類倫理的“科學”實驗。第113頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三第59屆聯(lián)合國大會3月8日以84票贊成、34票反對、37票棄權(quán)的表決結(jié)果，批準了聯(lián)大法律委員會上月通過的《聯(lián)合國關(guān)于人的克隆宣言》，宣言要求各國考慮禁止各種形式的克隆人。中國、英國、比利時等國在表決中投了反對票。投反對票國家的代表在表決后紛紛發(fā)言，強調(diào)他們的國家將不受上述宣言約束，將繼續(xù)允許治療性克隆研究。第114頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三國家科技部863生物工程中心主任王洪廣接受記者采訪時解釋說，中國反對《宣言》的原因并不是贊同“克隆人”，而是因為這項宣言措辭太模糊。

中國認為應(yīng)禁止生殖性克隆即克隆人試驗，不禁止以治病救人為目的的治療性克隆研究。

“我們對'克隆人'一貫的態(tài)度是'四不原則'：不支持、不贊同、不承認、不接受?！钡?15頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三原因一：治療性克隆太重要反對一切克隆就像“把孩子和臟水一起潑掉”為什么我們要堅持不能禁止治療性克隆，就是因為它對人類的健康、生命太重要了。用比較通俗的說法，把克隆后的干細胞或是受精卵放入母親的子宮，孕育一個新生命，創(chuàng)造出一個“克隆人”，就是生殖性克隆；而利用克隆技術(shù)對干細胞進行“復制、改造”，以用于重建人類的組織、器官進行移植，從而達到治療疾病的目的，即是治療性克隆。是以14天為界限嚴格區(qū)分兩者的，“胚胎干細胞發(fā)育到14天以后，再取其中所需部分，培育出所需器官就是不人道的了?！彼?，以發(fā)育不超過14天的受精卵胚胎進行治療性克隆研究不違背倫理。著名學者、中科院院士何作庥昨天對本報記者說，治療性克隆對人類的意義非常重大，如果為了禁止“克隆人”就同時把治療性克隆打進冷宮就好像“把孩子和臟水一起潑掉”。第116頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三技術(shù)：克隆器官不怕“早老”克隆人面對的困難，比動物克隆或治療性克隆大得多“目前，生殖性克隆僅僅在動物試驗中進行過，而人類的克隆迄今全球仍然沒有任何具有確定性報告?！睋?jù)張愚教授介紹，從技術(shù)上來說，克隆人所面對的困難肯定比動物克隆或是治療性克隆要大得多。在動物身上進行的克隆試驗已經(jīng)出現(xiàn)了一些難以預料的問題。如著名的克隆羊多利出生時正常，但它的死亡時間比研究人員預計的提前了很多。這就表示，克隆后的細胞的老化速度很可能要比正常的細胞快得多?！耙虼藦默F(xiàn)有研究水平來說，生殖性克隆應(yīng)該被嚴格禁止。”“相比之下，治療性克隆研究可能要更容易一些。”在生殖性克隆研究方面可能遭遇到的“早老”等問題，對治療性克隆研究也許并不算什么?！霸O(shè)想一下，如果一個50歲的肝癌病人需要新的肝臟組織來替代以前的'問題'部分，這個新肝臟可能只需要維持30到50年就足夠了，所以'老化'就不成其問題了?！钡?17頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三迄今為止，公開宣稱要進行克隆人的只有3家：一個是意大利婦科專家安蒂諾利。

一個就是在美國開公司的法國女科學家布利吉特·布瓦瑟利耶。一個是美國專家扎沃斯。

第118頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三布里吉特-布瓦瑟利耶：法國的生物化學家，曾在紐約的漢密爾頓大學任教，現(xiàn)為Clonaid公司科學總裁，Clonaid公司是一家致力于研究克隆人的機構(gòu)，總部位于巴哈馬群島，由“雷爾運動”組織資助。“雷爾運動”組織認為人類是由外星人利用科技手段創(chuàng)造的，也就是所謂的克隆技術(shù)。Clonaid公司還包括其它兩個部門：Clonapet和Insureaclone，前者專門負責克隆動物寵物，后者專門負責收藏人類的DNA，以便在將來使用。冒死也要克隆人的科學家布瓦瑟利耶

第119頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

2001年初，布里吉特曾對美國的一個國會委員會表示，Clonaid公司將推遲克隆人類的實驗，直至這項實驗合法。2001年8月，美國眾議院宣布禁止進行克隆人實驗后，Clonaid公司宣布他們計劃于年底研制出第一個克隆人。為了研究克隆人，布里吉特曾表示他的女兒也將被用來孕育克隆嬰兒。第120頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三意大利醫(yī)生

安蒂諾里——

克隆人的帶頭人第121頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

現(xiàn)年57歲的意大利醫(yī)生安蒂諾里是這次大辯論中最具爭議的焦點人物。英國人叫他“克隆先生”，西班牙人叫他“克隆大夫”，德國人稱他為“巫醫(yī)”，意大利有些媒體送給他一個“克隆瘋子”綽號。安蒂諾里則自稱是“不可能（生育出來）的孩子”之父。

2002年4月初，美國《新科學家》網(wǎng)站發(fā)布消息說，安蒂諾里在阿聯(lián)酋的一次國際會議上宣稱，一名參與克隆人計劃的婦女已經(jīng)懷孕8周，如果不出意外，再過8個月世界上第一個克隆人即將問世。就在這一驚人的消息把世界輿論攪得沸沸揚揚之際，安蒂諾里卻銷聲匿跡了。記者們四處追尋，到他家里、到他開設(shè)的婦產(chǎn)科診所、到“拉普魯伊”中心，皆無功而返?！袄蒸斠痢敝行牡娜Q是人類生殖及不孕癥醫(yī)療國際中心，由安蒂諾里于1985年創(chuàng)建，他的妻子卡泰利娜擔任中心主任。這個中心位于羅馬普洛佩喬大街，距梵蒂岡城墻不到300米。羅馬教廷一向反對包括使用避孕套在內(nèi)的一切“非自然生育”，安蒂諾里竟把釘子插在教皇的眼皮下。

第122頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

第123頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

8．2．6．1動物克隆技術(shù)現(xiàn)狀與不足動物克隆技術(shù)目前還很不完善。存活率低是當今核移植技術(shù)的最大缺陷。它突出表現(xiàn)為：孕期流產(chǎn)率高，新生兒體重較重及產(chǎn)后對環(huán)境的適應(yīng)性較差。以成體細胞核作核供體問題更為嚴重。8．2．6克隆動物的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢第124頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

體細胞核移植可能影響克隆動物免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育。

他們用胚胎細胞克隆牛的耳細胞通過核移植克隆出一頭牛。牛犢看起來很健康，但出生一個半月后，它體內(nèi)的淋巴細胞和紅血球急劇減少，不久就死于貧血；尸體解剖發(fā)現(xiàn)，該牛犢脾臟、胸腺和淋巴結(jié)等淋巴組織都沒有得到正常發(fā)育。第125頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

導致動物克隆存活率低和異常發(fā)育的原因很多：1、缺乏基礎(chǔ)理論支持

例如，基因組重新編程的機制尚不清楚。人們雖然觀測到核移植后細胞核的激活與早期胚胎原核發(fā)育類似，但較詳細的信息仍不甚明了。第126頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

2、來自于動物克隆種屬及細胞差異

克隆不同種屬的動物難易有別，其中的原因目前人們還不清楚。目前可以用作體細胞核移植核供體的細胞類型還較少。第127頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三3、動物克隆技術(shù)條件的優(yōu)化還沒有解決

如核供體和卵細胞的選材、核質(zhì)比的選擇、重組胚胎的激活方式、是否需要作連續(xù)核移植等。

多米克等發(fā)現(xiàn)去核的牛卵細胞能使來自羊、猴、鼠、豬等不同種屬的細胞核激活，并在體外發(fā)育為相應(yīng)的胚胎，但目前還沒有一個可繼續(xù)發(fā)育為完整的動物個體。第128頁，講稿共142頁，2023年5月2日，星期三

綜上所述，動物克隆研究雖已在理論基礎(chǔ)、技術(shù)優(yōu)化及實際應(yīng)用等方面取得很大的進展。但該技術(shù)目前還很不完善，相關(guān)理論研究還很薄弱，人們要提高動物克隆的成功率還需不懈的努力。

另外，克隆動物與正常胚胎的發(fā)育有何異同，也值得深入研究。這些問題的解決，將有助于加深入們對動物胚胎發(fā)育過程中分子機制的認識。動物克隆技術(shù)的不斷完善，還需要分子遺傳學、細胞學、發(fā)育生物學等相關(guān)基