大學(xué)實(shí)驗(yàn)-工業(yè)微生物的篩選和紫外誘變育種 雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基確定

大學(xué)實(shí)驗(yàn)-工業(yè)微生物的篩選和紫外誘變育種雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)基確定高校試驗(yàn)-工業(yè)微生物的篩選和紫外誘變育種一．試驗(yàn)?zāi)康募由顚?duì)發(fā)酵工程上游技術(shù)中菌種選育的熟悉；學(xué)會(huì)常規(guī)選種和育種的方法，樹(shù)立科學(xué)仔細(xì)認(rèn)真的態(tài)度，培育科研協(xié)作精神。

二、試驗(yàn)原理依據(jù)肯定的生產(chǎn)目的如抗生素或酶類的生產(chǎn)，建立不同的篩選模型，并從特定的樣品如土壤中篩選出高產(chǎn)相宜的菌株。

三．培育基及儀器降解亞硝酸鹽培育基NNO20.2%，KH2PO40.7%，MSO4.H2O0.25%，N2HPO41.35%，MSO4.7H2O0.1%，葡萄糖1％，瓊脂2％，0.1MP滅菌20分鐘。

6個(gè)250三角瓶，各裝100培育基。

同時(shí)滅菌試管20支，1吸管12支，一般平皿60個(gè)，滅菌生理鹽水。

培育亞硝酸鹽降解菌發(fā)酵液1瓶，每位同學(xué)預(yù)備1個(gè)斜面。

3．干凈工作臺(tái)、培育箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。

四．操作方法課前半小時(shí)打開(kāi)超凈工作臺(tái)滅菌。

1.土壤中降解亞硝酸鹽細(xì)菌的篩選分別稀釋土樣。

5土樣，加入45無(wú)菌水中。

為10-1，然后取1加入9無(wú)菌水，為稀釋10-2，直至稀釋至10-8溶化培育基。

將溶化后不燙手的培育基倒入平皿，剛好蓋過(guò)平皿底部，快速搖勻后放置，使培育基冷卻，要求平皿培育基表面平整、光滑。

吸取10-4，10-5或10-6相應(yīng)濃度的土樣稀釋液0.5，加入平皿內(nèi)，用燒過(guò)滅菌的曲玻棒勻稱涂平，放入37℃培育箱中倒置培育48小時(shí)。

2.亞硝酸鹽分解菌的紫外誘變育種取10培育好的液體培育液，放入90培育皿，將皿放置于誘變箱的磁力攪拌器上,置于30W紫外燈下，照耀90，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10-6，10-7，10-8，按常規(guī)方法涂布篩選平板。

同學(xué)可自行選擇培育亞硝酸鹽降解菌和誘變菌。

每位同學(xué)做一個(gè)平皿。

并標(biāo)記好稀釋度、種類和名字。

五、試驗(yàn)進(jìn)程支配及結(jié)果分析（1）第1次試驗(yàn)稀釋土樣，倒平板，冷卻后進(jìn)行平板涂布，放入恒溫培育箱中；或進(jìn)行菌種誘變，稀釋誘變菌，倒平板，冷卻后進(jìn)行平板涂布，放入恒溫培育箱中。

然后緊接著進(jìn)行其次個(gè)試驗(yàn)。

（2）其次次試驗(yàn)同學(xué)回到試驗(yàn)室中，記錄試驗(yàn)結(jié)果。

培育24-48后，記錄觀看到的菌落數(shù)量。

并對(duì)其中2-5個(gè)不同菌落進(jìn)行形態(tài)描述。

挑取其中1個(gè)菌落，接入斜面培育基進(jìn)行菌種保藏。

試驗(yàn)二雅致放射毛霉發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶的培育基確定一、試驗(yàn)?zāi)康陌盐瘴⑸镄迸嘤_定方法，學(xué)會(huì)對(duì)已確定菌種確定試驗(yàn)室發(fā)酵工藝。

二、試驗(yàn)原理篩選微生物最適生長(zhǎng)及產(chǎn)物形成的養(yǎng)分條件和培育條件，以確定特定產(chǎn)物發(fā)酵的工藝參數(shù)。

三、儀器及試劑蔗糖，酵母膏，MSO4等高壓滅菌鍋、干凈工作臺(tái)、恒溫振蕩培育箱。

四、操作方法1、種子培育基2、產(chǎn)酶培育基確定2.1培育基的配制，各組分別選擇以下六種培育基配方（1）基礎(chǔ)培育基（100）豆粕粉3，蔗糖0.8，酵母膏0.1，MSO40.36，KH2PO40.12，CC20.1。

（第一組）（2）其次組，將基礎(chǔ)培育基中蔗糖按成等例葡萄糖；（3）第三組，將基礎(chǔ)培育基中蔗糖按成等例馬鈴薯淀粉；（4）第四組，將基礎(chǔ)培育基中去掉酵母膏；（5）第五組，將基礎(chǔ)培育基中去掉豆粕粉，并將酵母膏添加量增至0.5％。

（6）第六組，將基礎(chǔ)培育基中去掉MSO4和CC2。

2.2培育基滅菌高壓滅菌鍋，121℃，20滅菌。

冷卻至室溫，將上述物品并洗耳球轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，接種前20進(jìn)行紫外空氣滅菌。

2.3接種冷卻到室溫開(kāi)頭接種，接種量10％，然后在在28℃、250的條件下培育至發(fā)酵液顏色變深、澄清為止。

2.4酶活力測(cè)定依據(jù)各組測(cè)定酶活結(jié)果，比較確定相宜培育基組成。

（1）定義1固體酶粉，在肯定溫度和H值條件下，1水解酪素產(chǎn)生1酪氨酸為一個(gè)酶活單位，以表示。

（2）原理蛋白酶在肯定溫度與H條件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸終止酶反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀除去，濾液對(duì)紫外光有汲取，可用紫外分光光度法測(cè)定。

依據(jù)吸光度計(jì)算其酶活力。

（3）試劑和溶液①三氯乙酸（CC3.COOH）=0.4L稱取三氯乙酸32.7，用水溶解并定容至500L②磷酸緩沖溶液③100LL—酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液④10L酪素溶液⑤待測(cè)酶液取1發(fā)酵液稀釋備用。

（4）分析步驟①求K值②測(cè)定.先將酪素溶液放入（40±0.2）攝氏度恒溫水域中，預(yù)熱5；.按下列程序操作試管A（空白）（其次試管）試管B（酶試樣，作三個(gè)平行樣）（第三試管）↓↓加酶液2.00L（移液管2）加酶液2.00L↓（40±0.2℃），2↓（40±0.2℃），2加三氯乙酸4.00L（搖勻）（移液管5）加酪素2.00L（搖勻）↓（40±0.2℃），10↓（40±0.2℃），10加酪素2.00L（搖勻）（移液管2）加三氯乙酸4.00L（搖勻）↓↓取出靜止10，過(guò)濾（第四試管，小漏斗）取出靜止10，過(guò)濾↓↓在275波長(zhǎng)下，用10在275波長(zhǎng)下，用10比色皿測(cè)其吸光度比色皿測(cè)其吸光度（5）計(jì)算（=135）X=A×K×82×110××E=25×A×K××E式中X——樣品的酶活力（）A——試樣溶液的平均吸光度K——吸光常數(shù)（K=135）8——反應(yīng)試劑的總體積（L）2——吸取酶液2.00L，以1L計(jì)110——反應(yīng)時(shí)間10，以1計(jì)——稀釋倍數(shù)E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（取0.50）五、試驗(yàn)進(jìn)程支配及結(jié)果分析（1）第1次試驗(yàn)配制培育基，滅菌，等待滅菌時(shí)進(jìn)行發(fā)酵罐的上罐觀看。

（2）第2次試驗(yàn)下?lián)u瓶，測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力，對(duì)比各組試驗(yàn)，確定培育基；或從發(fā)酵罐上取樣，測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

試驗(yàn)三雅致放射毛霉5L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康陌盐瞻l(fā)酵罐的操作技能，學(xué)習(xí)微生物在發(fā)酵罐上發(fā)酵的過(guò)程和試驗(yàn)方法。

二、儀器分光光度計(jì)、電熱恒溫水浴鍋、生物發(fā)酵智能掌握系統(tǒng)。

三、試劑1、DNS試劑取6.33,5-二硝基水楊酸（DNS）和262L2LNOH溶液加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中（192酒石酸鉀鈉溶于500L水中），再加5重蒸酚和5亞硫酸鈉，攪拌使其溶解，冷卻后加水定容至1000L，保存于棕色瓶中放置7天后使用。

2、10L酪素溶液3、種子培育基4、產(chǎn)酶培育基四、試驗(yàn)方法1、學(xué)習(xí)發(fā)酵罐的使用方法。

2、發(fā)酵罐中加入培育基，滅菌。

3、接種、培育。

4、測(cè)定酶活:.先將酪素溶液放入（40±0.2）攝氏度恒溫水域中，預(yù)熱5；.按下列程序操作試管A（空白）（其次試管）試管B（酶試樣，作三個(gè)平行樣）（第三試管）↓↓加酶液2.00L（移液管2）加酶液2.00L↓（40±0.2℃），2↓（40±0.2℃），2加三氯乙酸4.00L（搖勻）（移液管5）加酪素2.00L（搖勻）↓（40±0.2℃），10↓（40±0.2℃），10加酪素2.00L（搖勻）（移液管2）加三氯乙酸4.00L（搖勻）↓↓取出靜止10，過(guò)濾（第四試管，小漏斗）取出靜止10，過(guò)濾↓↓在275波長(zhǎng)下，用10在275波長(zhǎng)下，用10比色皿測(cè)其吸光度比色皿測(cè)其吸光度（5）計(jì)算（=135）X=A×K×82×110××E=25×A×K××E式中X——樣品的酶活力（）A——試樣溶液的平均吸光度K——吸光常數(shù)（K=135）8——反應(yīng)試劑的總體積（L）2——吸取酶液2.00L，以1L計(jì)110——反應(yīng)時(shí)間10，以1計(jì)—