熒光染料選擇和數(shù)據(jù)分析

關(guān)于熒光染料選擇和數(shù)據(jù)分析第1頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料的選擇第2頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三什么是流式細(xì)胞儀在流動(dòng)的狀態(tài)中檢測(cè)顆粒性物質(zhì)各種物理及生物特征的一種儀器；InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid第3頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)前向散射光信號(hào)(FSC)側(cè)向散射光信號(hào)(SSC)熒光信號(hào)第4頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理散射光信號(hào)當(dāng)顆粒通過(guò)聚集的激光束時(shí)，激光向各個(gè)方向散射。與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號(hào)（FSC）。與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號(hào)（SSC）。第5頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理前向角散射光信號(hào)（FSC）FSC反映細(xì)胞大小，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞越大，前向角散射光信號(hào)越強(qiáng)；FSC信號(hào)與細(xì)胞的折射率有關(guān)；可用于表示細(xì)胞的凋亡；區(qū)分死/活細(xì)胞時(shí)，可用于設(shè)門；第6頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）SSC信號(hào)主要反映了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號(hào)越強(qiáng)；第7頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理FSC和SSC信號(hào)用于檢測(cè)并顯示細(xì)胞的物理學(xué)特征中性粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000第8頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理熒光信號(hào)當(dāng)熒光抗體或其他染料染色的顆粒通過(guò)激光束時(shí)，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。第9頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理第10頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理第11頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀特點(diǎn)及檢測(cè)標(biāo)本特異性強(qiáng)，靈敏度高，速度快，并能實(shí)現(xiàn)多參數(shù)分析；可檢測(cè)的樣本種類多樣(1)外周血，骨髓，細(xì)針穿刺，洗脫液，實(shí)體組織，培養(yǎng)細(xì)胞(2)New!血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液

第12頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料選擇的必要性多色流式細(xì)胞儀的開(kāi)發(fā)促進(jìn)了新的熒光染料的發(fā)現(xiàn)及抗體標(biāo)記物的發(fā)展但抗體組合選擇非常復(fù)雜，如果隨意選擇熒光素搭配的抗體，不可能得到合適的結(jié)果。在熒光染料的選擇上多一點(diǎn)考慮，就可避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)和錯(cuò)誤的結(jié)果。第13頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三流式細(xì)胞儀原理熒光信號(hào)激發(fā)波長(zhǎng)熒光素發(fā)射波長(zhǎng)第14頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解你的儀器第15頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三基本要求-了解你的儀器試劑的選擇從了解你的儀器的配置開(kāi)始激光（激發(fā)光源）：是否可以激發(fā)待選的熒光素檢測(cè)器：是否有足夠的檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)所要用的熒光抗體組合光路設(shè)計(jì)：影響特別染料的檢測(cè)效率濾片：寬濾片提高檢測(cè)能力，但也會(huì)檢測(cè)到更多干擾光第16頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料488nm激光激發(fā)的染料第17頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料633nm激光激發(fā)的染料(APC)595nmand633nmEXCITEDDYES第18頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料UV激光激發(fā)的染料第19頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料常見(jiàn)熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)第20頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的性質(zhì)第21頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度熒光素/單抗結(jié)合物的亮度每種熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同CascadeBlueAPC-Cy7FITCPE-Cy7TexasRedPEPE-Cy5APC02468100.280.951.01.42.84.66.29.2RelativeBrightnessPositive/negativePositive/autofluorescenceCD8fluorescenceofCD3+cellsData:Dr.MarioRoederer,StanfordUniv..第22頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度各種熒光素在BDLSRII流式細(xì)胞儀上的染色指數(shù)第23頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度每種熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同對(duì)一個(gè)既定的單抗來(lái)講，因?yàn)榻Y(jié)合的熒光素不同，陽(yáng)性/陰性細(xì)胞的S/N比值可相差4-6倍FITCPECy-ChromeCy7-PETexasRedAPCPharRedCascadeBlue110100110100FluorescenceIntensityRelativeNumberofCells110100110100Data:Dr.MarioRoederer;StanfordUniversityNegControlPositive(CD8-X)第24頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度每種熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度不同不同儀器的激光及濾片組合不同，熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度也不同0.11101000.11101000.11101000.11101000.11101000.11101001000FITCPECy-ChromePerCPPharRedAPCVantage8922213620562104Calibur10935920915023927第25頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三了解熒光素的相對(duì)熒光強(qiáng)度F/P比值抗體上熒光素分子的多少（F/P）也會(huì)影響相對(duì)的熒光強(qiáng)度。FITC和PerCP的結(jié)合物通常一個(gè)抗體分子上結(jié)合幾個(gè)（2-9個(gè)，依抗體而定）熒光素分子。APC和PE與抗體結(jié)合一般是1：1。復(fù)合染料PE-CY7和APC-CY7一般一個(gè)PE/APC分子結(jié)合多個(gè)CY7分子，一個(gè)PE/APC分子與抗體1：1結(jié)合與之相反的是，復(fù)合染料PerCP-CY5.5，PerCP與CY5.5的比例是1：1因?yàn)闊晒馑亟Y(jié)合的化學(xué)因素的關(guān)系，IgM抗體一般與小分子的熒光素聯(lián)結(jié)，如FITC、Texas-Red、CY3、CY5。第26頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三復(fù)合熒光染料-TandemdyeIsolateddonorDonordistancetoogreatDonordistancecorrect第27頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三復(fù)合熒光染料被激發(fā)的Donor熒光素將能量轉(zhuǎn)移給受者acceptor,需要滿足條件:Donor的發(fā)射波長(zhǎng)與acceptor的激發(fā)波長(zhǎng)有重疊Donor和Acceptor分子之間的距離不能太遠(yuǎn)(＜100A)第28頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三復(fù)合熒光染料FluorescenceResonanceEnergyTransferIntensityWavelengthAbsorbanceDONORAbsorbanceFluorescenceFluorescenceACCEPTORMolecule1Molecule2第29頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光染料多色分析第30頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光素的選擇原則第31頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需要考慮抗原的密度高表達(dá)的抗原可選擇幾乎所有的熒光素低密度表達(dá)的抗原需要可提供較高S/N比值的熒光素如PE/APC第32頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需要考慮自發(fā)熒光每種細(xì)胞群都有不同水平的自發(fā)熒光所有的熒光通道均可觀察到自發(fā)熒光，但自發(fā)熒光強(qiáng)度在波長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)迅速降低。對(duì)自發(fā)熒光較強(qiáng)的細(xì)胞，選擇發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素（如APC）可得到較好的S/N比值。對(duì)自發(fā)熒光比較弱的細(xì)胞，發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)的熒光素對(duì)S/N提高沒(méi)有明顯的改善?？蛇x用FITC。第33頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮非特異結(jié)合許多熒光抗體可產(chǎn)生低水平的非特異結(jié)合，使陰性細(xì)胞群的熒光超出自發(fā)熒光。非特異結(jié)合由下列因素引起單克隆抗體的同型抗體：一些IgG同型抗體可能與一些細(xì)胞上的Fc受體結(jié)合所用的熒光素羰花青染料（如CY3、CY5、CY5.5、CY7）和Tex-Red直標(biāo)的抗體及一些復(fù)合染料標(biāo)記的抗體在標(biāo)記某些亞群的細(xì)胞時(shí)有時(shí)會(huì)提高結(jié)合率。對(duì)CY5來(lái)說(shuō)，是因?yàn)樵撊玖吓c低親和力FC受體的極低親和力相互作用。這也是復(fù)合染料PE-CY5的特性。第34頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮復(fù)合染料：小心信號(hào)衰退復(fù)合染料因?yàn)楣?、固定劑或溫度升高?huì)致信號(hào)衰退，使復(fù)合染料在上一級(jí)染料處發(fā)光。該種現(xiàn)象從一小部分亞群開(kāi)始，導(dǎo)致APC或PE染色細(xì)胞群假陽(yáng)性。減少樣本暴露于光、高溫或固定劑，可很大程度上避免這一問(wèn)題。選擇染料時(shí)要考慮：復(fù)合染料的信號(hào)衰退會(huì)不會(huì)降低APC或PE的靈敏度。如果是，就要選擇另外的試劑搭配。如果樣本需要固定，要選擇穩(wěn)定的固定劑，可有效阻止復(fù)合染料的信號(hào)衰退。BD：338036第35頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮儀器配置的差異，多色分析不可能全選“最亮”的熒光素，但對(duì)于特定的一款儀器，可以根據(jù)熒光的強(qiáng)弱列出可選的染料亮度的判斷：就是熒光染料的靈敏度，區(qū)分背景和弱陽(yáng)性信號(hào)的能力影響背景的因素有檢測(cè)器的電子噪音、細(xì)胞自發(fā)熒光、來(lái)自其他檢測(cè)器的信號(hào)干擾，這些因素也增加了陰性熒光峰的寬度（標(biāo)準(zhǔn)差）第36頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三靈敏度好的標(biāo)準(zhǔn)是染色指數(shù)：D／W，D指的是陽(yáng)性峰與陰性峰的平均熒光強(qiáng)度的差；W是陰性峰的2SD。第37頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮熒光信號(hào)之間的干擾，會(huì)增加信號(hào)檢測(cè)背景熒光信號(hào)強(qiáng)細(xì)胞群體的SD比熒光信號(hào)弱的細(xì)胞群體大。多色分析時(shí)，一種熒光素（如FITC）的光會(huì)漏入相鄰的熒光素（如PE）的檢測(cè)器。漏入的光越多，需要補(bǔ)償?shù)脑蕉啵瑢?duì)分辨率的影響越大。尤其是弱表達(dá)的信號(hào)。第38頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾第39頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾IFNAPC+CD8APC-CY7+CD4PE+IL-2PE-CY7第40頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾IFNAPC+CD4PE+IL-2PE-CY7第41頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾第42頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾第43頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮多色熒光信號(hào)之間的干擾第44頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三選擇熒光素需考慮盡量減少熒光信號(hào)之間的干擾檢測(cè)的顏色越多，面臨的熒光信號(hào)之間的干擾越多選擇試劑組合時(shí)盡可能降低熒光發(fā)射波長(zhǎng)之間的重疊第45頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三組合熒光素選擇常見(jiàn)的6、8、10色熒光染料組合第46頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三設(shè)立對(duì)照，以證實(shí)試劑組合有效真實(shí)性對(duì)照（fidelitycontrol）：?jiǎn)我坏臒晒饪贵w染色與試劑組合染色結(jié)果比較，以確保試劑組合中的其它試劑不影響結(jié)果。減去一個(gè)熒光對(duì)照（Fluorescence-minus-onecontrol,FMO）：除去一個(gè)熒光抗體，將其他所有試劑組合在一起。第47頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三熒光素選擇原則上述原則可能相互沖突，但要取得平衡以得到最佳結(jié)果。原則1：選擇適合儀器配置的最“亮”的熒光染料原則2：選擇光譜重疊最少的熒光素原則3：為最“暗”的抗體選擇最“亮”的熒光素，反之亦然原則4：盡量避免“亮”細(xì)胞群的光漏入對(duì)靈敏度要求高的細(xì)胞群的檢測(cè)器中原則5：采取步驟，避免復(fù)合染料信號(hào)衰退，考慮到可能對(duì)結(jié)果造成的影響。第48頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析第49頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性百分率（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)（個(gè)/L）平均熒光強(qiáng)度（MFI）第50頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析直方圖和點(diǎn)圖第51頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析設(shè)門用來(lái)限定感興趣的細(xì)胞群；FSCvsSSC點(diǎn)圖是傳統(tǒng)上用于設(shè)門的圖；分析淋巴細(xì)胞群時(shí)，CD45vsSSC點(diǎn)圖設(shè)門更優(yōu)于FSCvsSSC點(diǎn)圖設(shè)門；第52頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析設(shè)門-確定要分析的目的細(xì)胞群第53頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析設(shè)門SideScatterForwardScatter0200400600800100002004006008001000R1第54頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析設(shè)門100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103104Anti-HLA-DRFITCGatedonR1100101102103104CD25-PE第55頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本檢測(cè)樣本第56頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析直方圖統(tǒng)計(jì)表第57頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析檢測(cè)樣本第58頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本檢測(cè)樣本第59頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)表第60頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本第61頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析第62頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析第63頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題陽(yáng)性峰與陰性峰分界明顯根據(jù)陰性對(duì)照設(shè)陽(yáng)性和陰性界限允許假陽(yáng)性率一般少于2%可記錄陽(yáng)性百分比和平均熒光強(qiáng)度圖1第64頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題對(duì)照管直方圖左側(cè)與檢測(cè)管重疊，但檢測(cè)管直方圖右側(cè)有肩峰在兩曲線分離處設(shè)一界限；從陽(yáng)性曲線減去陰性曲線所致假陽(yáng)性的百分比；可記錄陽(yáng)性百分比（近似值）和平均熒光強(qiáng)度，或弱陽(yáng)性圖2第65頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題對(duì)照管與檢測(cè)管直方圖形狀相同，但檢測(cè)管直方圖右移此結(jié)果不可設(shè)界限可記錄平均熒光強(qiáng)度排除非特異染色調(diào)整抗體滴度確認(rèn)圖3第66頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題組合圖形需要設(shè)界限，設(shè)在陽(yáng)性管弱陽(yáng)性返回基線處；界限右側(cè)為強(qiáng)陽(yáng)性，可報(bào)百分比；弱陽(yáng)性的分析見(jiàn)上述原則3圖4第67頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題陽(yáng)性細(xì)胞群與陰性細(xì)胞群分群明顯，且位于所在象限內(nèi)以陰性對(duì)照設(shè)界線，允許其它三象限內(nèi)假陽(yáng)性率小于2%；可記錄陽(yáng)性百分比，強(qiáng)陽(yáng)性或平均熒光強(qiáng)度圖5第68頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)分析時(shí)遇到的問(wèn)題陽(yáng)性群與陰性群區(qū)分明顯，但陽(yáng)性群部分跨兩象限單陽(yáng)性部分使用圖5原則雙陽(yáng)性部分，根據(jù)細(xì)胞群走向，使用圖7/圖8原則圖6第69頁(yè)，講稿共74頁(yè)，2023年5月2日，星期三數(shù)據(jù)