基因工程-課件

你們好每100kg豬或牛的胰腺中僅可提取4~5g。

1979年，美國(guó)將人的胰島素基因重組到大腸桿菌內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌生產(chǎn)胰島素，大大降低了生產(chǎn)成本。治療糖尿病特效藥——

據(jù)WTO調(diào)查：

2005年全世界約有糖尿病患者1.8億人，我國(guó)約6000萬(wàn)。胰島素思考：轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了一種生物的某些性狀在另一種生物中表達(dá)。這些性狀的表達(dá)與我們學(xué)過(guò)的基因的什么過(guò)程有關(guān)？2基因工程的產(chǎn)物34是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。又叫做DNA重組技術(shù)或基因拼接技術(shù)。思考：?與誘變育種相比，其特點(diǎn)是

；與雜交育種相比，其特點(diǎn)是?在______水平上進(jìn)行操作。?基因工程的對(duì)象：

。?基因工程的原理：

。?基因工程的結(jié)果：

。①定向改造生物性狀分子一、基因工程②克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙

基因人類(lèi)需要的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物基因重組概念：5

艾弗里證明DNA是遺傳物質(zhì)，DNA可從一種生物個(gè)體轉(zhuǎn)移到另一種生物個(gè)體。二、基因工程的理論基礎(chǔ)6

沃森、克里克提出DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。7克里克等提出中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制8

1963年尼倫伯格和馬太破譯編碼氨基酸的遺傳密碼，1966年霍拉納用實(shí)驗(yàn)加以證明。9問(wèn)題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲(chóng)害的抗蟲(chóng)棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲(chóng)棉10基因工程培育抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程：在以上過(guò)程中關(guān)鍵步驟或難點(diǎn)是什么？普通棉花(無(wú)抗蟲(chóng)特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲(chóng)基因通過(guò)運(yùn)載體導(dǎo)入含抗蟲(chóng)基因的轉(zhuǎn)基因棉花轉(zhuǎn)基因棉花有抗蟲(chóng)特性11基因工程培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞12解決培育抗蟲(chóng)棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶關(guān)鍵步驟一：抗蟲(chóng)基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來(lái)關(guān)鍵步驟二：抗蟲(chóng)基因與運(yùn)載體“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲(chóng)基因進(jìn)入棉花細(xì)胞“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車(chē)”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體三、DNA重組技術(shù)的基本工具131、基因工程的指“限制性核酸內(nèi)切酶

”微生物特異性。一般來(lái)說(shuō)，一種內(nèi)切酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列,并在特定切點(diǎn)切割2）來(lái)源:3）特點(diǎn):“”這個(gè)特點(diǎn)說(shuō)明了：酶具有專(zhuān)一性1）（又叫限制性內(nèi)切酶或限制酶）144）舉例:大腸桿菌的一種限制酶能識(shí)別GAATTC序列，并在G和A之間切開(kāi)。5）結(jié)果:產(chǎn)生黏性未端和平末端。15限制酶的識(shí)別序列：16SmaⅠ平末端平末端17

被同一種限制酶切斷的幾個(gè)DNA是否具有相同的黏性末端？思考:形成的粘性末端可能不同，也可能相同不同的限制酶呢？具有18尋根問(wèn)底你能推測(cè)限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。192：基因工程的指“DNA連接酶”“”2）作用：連接“梯子”斷口的“扶手”而非“梯子”中間的“踏板”。其作用與限制性內(nèi)切酶相反，作用點(diǎn)相同1）連接部位：磷酸二酯鍵20DNA連接酶的作用過(guò)程將互補(bǔ)配對(duì)的兩個(gè)黏性末端連接起來(lái)，使之成為一個(gè)完整的DNA分子。3）結(jié)果：21思考：兩種來(lái)源不同的DNA用同一種限制酶來(lái)切割，再用DNA連接酶連接，會(huì)怎樣呢？22“分子縫合針”——DNA連接酶兩者都是將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷之間的磷酸二酯鍵。但E·coli

DNA連接酶只能“縫合”黏性末端不能“縫合”平末端；而T4DNA連接酶既能“縫合”黏性末端又能“縫合”平末端。根據(jù)來(lái)源不同可分為:E·coli

DNA連接酶T4DNA連接酶在性質(zhì)上兩者異同點(diǎn)：23DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?將單個(gè)核苷酸之間形成磷酸二酯鍵，聚合成DNA在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵24……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……EcoRⅠ……GAATTC…………CTTAAG…………GAATTC…………CTTAAG……不同來(lái)源的DNA片段混合將不同種來(lái)源的DNA片段連接起來(lái)生物A基因片段生物B基因片段……G

AATTC…………CTTAA

G……酶切……GAATTC…………CTTAAG…………G

AATTC…………CTTAA

G…………G

AATTC…………CTTAA

G……同一種253、基因的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體作用：將外源基因送入受體細(xì)胞。條件：（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定地保存。（2）具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便于外源基因相連。（3）具有某些標(biāo)記基因，便于篩選種類(lèi)：質(zhì)粒、噬菌體和動(dòng)植物病毒。26標(biāo)記基因，便于進(jìn)行檢測(cè)。常用的載體：質(zhì)粒雙鏈環(huán)狀的DNA分子本質(zhì)：27基因工程的基本工具28１、獲得目的基因供體生物細(xì)胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因四、基因工程基本步驟：如果序列是已知的，有兩種方法：①化學(xué)方法合成②用PCR方法擴(kuò)增如果序列是未知的：從基因文庫(kù)中獲取29提取目的基因的方法⑴直接分離基因(從基因文庫(kù)中獲?。B(niǎo)槍法

將供體生物的DNA用限制酶切割為許多片段，再用運(yùn)載體將這些片段都運(yùn)載到受體生物的不同細(xì)胞中去。只要有一個(gè)細(xì)胞獲得了需要的目的基因并得以表達(dá)，基因工程就算成功了。

該法最大的缺點(diǎn)是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉(zhuǎn)移到原核生物中去。⑵人工合成基因法有兩種方法：

①直接合成法：根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序推算出信使RNA核苷酸順序，再據(jù)此推算出基因DNA的脫氧核苷酸順序。用游離脫氧核苷酸直接合成相應(yīng)的基因。30DNA合成儀（3）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因②逆轉(zhuǎn)錄法：以信使RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將脫氧核苷酸合成合成DNA(基因)。312、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合形成重組DNA分子注意：要用同一種限制酶切取目的基因和運(yùn)載體，并用DNA連接酶連接。核心32基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種限制酶

目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過(guò)程，實(shí)際上是不同來(lái)源的基因重組的過(guò)程。33

科學(xué)家在培育抗蟲(chóng)棉時(shí)，經(jīng)過(guò)了許多復(fù)雜的過(guò)程和不懈的努力，才獲得成功。起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲(chóng)基因插入載體質(zhì)粒中，然后導(dǎo)入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲(chóng)基因在棉花體內(nèi)沒(méi)有表達(dá)。然后在插入抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入啟動(dòng)子(抗蟲(chóng)基因首端)，導(dǎo)入棉花受精卵，長(zhǎng)成的棉花植株還是沒(méi)有抗蟲(chóng)能力?？茖W(xué)家又在有啟動(dòng)子、抗蟲(chóng)基因的質(zhì)粒中插入終止子(抗蟲(chóng)基因末端)，導(dǎo)入棉花受精卵，結(jié)果成長(zhǎng)的植株，有了抗蟲(chóng)能力。資料:34基因表達(dá)載體的組成：a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因353、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞導(dǎo)入擴(kuò)增常用的受體細(xì)胞：動(dòng)植物細(xì)胞、大腸桿菌、土壤農(nóng)桿菌、枯草桿菌等。36(1)受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞（經(jīng)組織培養(yǎng)）、動(dòng)物受精卵（一般不用體細(xì)胞）、微生物（大腸桿菌、酵母菌）等。（2）要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必須用真核生物（需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌），如酵母菌。（3）一般不用支原體，原因是它營(yíng)寄生生活。（4）一定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，原因是它無(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。37方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入微生物細(xì)胞——顯微注射法——用氯化鈣處理大腸桿菌，增加大腸桿菌細(xì)胞壁的通透性——農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法3839小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞生物種類(lèi)植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射技術(shù)Ca2+處理法受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵（受精卵）→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子40(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交抗原抗體雜交414、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞根據(jù)受體細(xì)胞是否含有標(biāo)記基因來(lái)篩選5、目的基因的表達(dá)

細(xì)菌的檢測(cè)，將每個(gè)受體細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)形成菌落，檢測(cè)菌落中是否有目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。淘汰無(wú)表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。為什么要篩選受體細(xì)胞？42基因操作的基本步驟示意圖431）基因工程依據(jù)的遺傳學(xué)原理是（）A．基因突變B．基因重組C．染色體變異D．DNA復(fù)制練習(xí)B442）以下說(shuō)法正確的是（）A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái)C練習(xí)453）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制

（）

B、有多個(gè)限制酶切點(diǎn)C、具有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)464）有關(guān)基因工程的敘述中，錯(cuò)誤的是（）A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái)