蛋白質(zhì)分析法

關于蛋白質(zhì)分析法第1頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)純化為了研究某一種蛋白質(zhì)，必須首先將該蛋白質(zhì)從其他蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)分子中純化出來用于分離蛋白質(zhì)的最重要的依據(jù)分子大小電荷疏水性親和性重組技術第2頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三凝膠過濾原理：依據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的分離方法第3頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三電泳原理：依據(jù)蛋白質(zhì)帶凈電荷量不同從而在電場中移動速度不同而分離開來第4頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三親和層析原理：依據(jù)親和性進行分離，如酶與底物、受體與配體和抗原與抗體反應。第5頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三重組技術在一個適合的宿主細胞中過量表達重組蛋白質(zhì)，產(chǎn)量的提高大大簡化純化過程通過在基因的5’或3’端加入6個組氨酸密碼子，形成純化的標簽，可進一步加速純化進程，這使得含有固定金屬離子如可與組氨酸結合的Ni2+的親和柱上標簽通常對蛋白質(zhì)的功能沒有什么影響第6頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)測序蛋白質(zhì)在測序之前首先需要經(jīng)過水解，得到小肽，然后用自動蛋白質(zhì)測序儀用Edman降解法測定氨基酸序列第7頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定依據(jù)凝膠過濾層析將樣品蛋白質(zhì)洗脫時間與已知標準蛋白的洗脫時間相比可給出樣品蛋白的近似分子量SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可用于確定單個肽鏈的大小質(zhì)譜測定極為精確但上限僅幾kDa且對蛋白質(zhì)是破壞性的第8頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定分子量第9頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三X-衍射晶體學和核磁共振X-晶體衍射——X射線可與蛋白質(zhì)中的電子作用得到特有的衍射圖譜，可用于確定晶體中原子的位置第10頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三功能分析基于氨基酸一級序列信息，利用計算機輔助方法進行蛋白質(zhì)三維結構預測。同源性分析氨基酸序列具有明顯的相似性,這種相似性稱為序列同源性。具有序列同源性的蛋白質(zhì)稱為同源蛋白質(zhì)，同源蛋白共有的相似序列稱為共義序列。

遺傳分析可揭示該蛋白質(zhì)在細胞中的作用－某一蛋白質(zhì)的基因可通過突變失活或用重組DNA技術刪除，進而研究其突變體的表現(xiàn)型，揭示該蛋白質(zhì)的作用第11頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)折疊蛋白質(zhì)折疊問題被列為“21世紀的生物物理學”的重要課題。研究蛋白質(zhì)特定三維空間結構形成的規(guī)律、穩(wěn)定性和與其生物活性的關系。大家都知道的瘋牛病，它是由一種稱為Prion的蛋白質(zhì)的感染引起的，這種蛋白質(zhì)也可以感染人而引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病。在正常機體中，Prion是正常神經(jīng)活動所需要的蛋白質(zhì)，而致病Prion與正常Prion的一級結構完全相同，只是空間結構不同。這一疾病的研究涉及到許多生物學的基本問題。一級結構完全相同的蛋白質(zhì)為什么會有不同的空間結構，這與Anfinsen原理是否矛盾？顯然這里有蛋白質(zhì)的能量和穩(wěn)定性問題。

第12頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)組學Proteomicsisthesystematicstudyofalloftheproteinsinacell,tissue,ororganism.proteomicshasbeenusedtoidentifyhundredsofproteinsintheovary,prostate,breast,andesophagusthatincreaseordecreaseascellsbegintogrowabnormally.第13頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫第14頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)芯片的定義蛋白質(zhì)芯片,又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，是指以蛋白質(zhì)分子作為配基,將其有序地固定在固相載體的表面形成微陣列；用標記了熒光的蛋白質(zhì)或其它分子與之作用，洗去未結合的成分，經(jīng)熒光掃描等檢測方式測定芯片上各點的熒光強度，來分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關系。

第15頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白芯片的分類蛋白質(zhì)微陣列

通過點樣機械裝置制作蛋白質(zhì)芯片，將針尖浸入裝有純化的蛋白質(zhì)溶液的微孔中，然后移至載玻片上微孔板蛋白質(zhì)芯片

利用機械手在96孔的每一個孔的平底上點樣成同樣的四組蛋白質(zhì)，每組36個點(4×36陣列)，含有8種不同抗原和標記蛋白?？芍苯邮褂门c之配套的全自動免疫分析儀，測定結果。適合蛋白質(zhì)的大規(guī)模、多種類的篩選。三維凝膠塊芯片

是在基片上點布以10000個微小聚苯烯酰胺凝膠塊，每個凝膠塊可用于靶DNA、RNA和蛋白質(zhì)的分析。這種芯片可用于篩選抗原抗體、酶動力學反應的研究。該系統(tǒng)的優(yōu)點是：凝膠條的三維化能加進更多的已知樣品，提高檢測的靈敏度；蛋白質(zhì)能夠以天然狀態(tài)分析，可以進行免疫測定、受體、配體研究和蛋白質(zhì)組分分析。第16頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三蛋白質(zhì)芯片的應用用于基因表達的篩選

從人胎兒腦的cDNA文庫中選出92個克隆的粗提物制成蛋白質(zhì)芯片，用特異性的抗體對其進行檢測，結果的準確率在87％以上用于特異性抗原抗體的檢測蛋白質(zhì)芯片上的抗原抗體反應體現(xiàn)出很好的特異性，在一塊蛋白質(zhì)芯片上10800個點中，根據(jù)抗原抗體的特異性結合可檢測到唯一的1個陽性位點。生化反應的檢測

對酶活性的測定一直是臨床生化檢驗中不可缺少的部分，酶作為一種特殊的蛋白質(zhì)，可以用蛋白質(zhì)芯片來研究酶的底物、激活劑、抑制劑等。

第17頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三藥物篩選疾病的發(fā)生發(fā)展與某些蛋白質(zhì)的變化有關，如果以這些蛋白質(zhì)構筑芯片，對眾多候選化學藥物進行篩選，直接篩選出與靶蛋白作用的化學藥物，將大大推進藥物的開發(fā)。第18頁，講稿共20頁，2023年5月2日，星期三疾病診斷蛋白質(zhì)芯片技術在醫(yī)學領域中有著潛在的廣闊應用前景。蛋白質(zhì)芯片能夠同時檢測生物樣品中與某種疾病或者環(huán)境因素損傷可能相關的全部蛋白質(zhì)的含量情況，即表型指紋(p