酶學(xué)與酶工程課件

關(guān)于酶學(xué)與酶工程第1頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第一章酶學(xué)與酶工程

第六節(jié)影響酶活力的因素第七節(jié)酶的分離純化第2頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第六節(jié)影響酶活力的因素一、酶活力的測定酶活力（enzymeactivity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。1.酶活力與酶反應(yīng)速度酶活力的大小可以用一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度（reactionvelocity）來表示，兩者呈線性關(guān)系。酶反應(yīng)速度可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。第3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三Time第4頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2.酶的活力單位（U，activityunit）酶活力的大小及酶含量的多少，用酶活力單位表示，即酶單位（U）。酶單位的定義是：在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。這樣酶的含量就可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示（U/g或U/ml）。

1961年國際酶學(xué)委員會規(guī)定“國際單位”表示酶活力；一個(gè)國際單位（IU）是指在最適反應(yīng)條件下，1每分鐘催化1μmoL底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。

1972年又推薦一種新的酶活力單位——Katal（簡稱Kat）單位。一個(gè)katal單位是指在最適反應(yīng)條件下，1每秒鐘催化1moL底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量。1Kat＝6107IU，1IU=16.7nKat第5頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3.酶的比活力（specificactivity）酶的比活力代表酶的純度，國際酶學(xué)委員會規(guī)定比活力用每mg蛋白質(zhì)所含有的酶活力單位數(shù)表示。對同一種酶比活力愈大，純度愈高。4.酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：Kcat值

Kcat值以一定條件下每秒鐘每個(gè)酶分子轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)來表示酶的催化效率。5.酶活力的測定方法（1）分光光度法（spectrophotometry）（2）熒光法（fluorometry）（3）同位素測定方法（4）電化學(xué)方法（electrochemicalmethod）第6頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、影響酶活力的因素

1.底物濃度隨著酶反應(yīng)的進(jìn)行，底物濃度逐漸下降，產(chǎn)物逐漸積累，酶反應(yīng)速度也會逐漸變小。為了排除底物和產(chǎn)物濃度變化對酶反應(yīng)速度的影響，人們采用酶反應(yīng)的初速度作為衡量的指標(biāo)。

第7頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2、酶濃度

在底物濃度飽和的情況下，酶濃度的加倍將導(dǎo)致V0的加倍，即V0與酶濃度的關(guān)系圖為直線圖形。3、溫度

溫度對酶反應(yīng)速率的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面是當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速率加快。反應(yīng)溫度提高10℃，其反應(yīng)速率與原來反應(yīng)速率之比稱為反應(yīng)的溫度系數(shù)，用Q10表示，對大多數(shù)酶來講溫度系數(shù)Q10多為2，也就是說，即溫度每升高10℃，酶反應(yīng)速率為原反應(yīng)速率的2倍。另一方面由于酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度升高，使酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率下降。第8頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

在較低的溫度范圍內(nèi)，酶反應(yīng)速率隨溫度升高而增大，但超過一定溫度后，反應(yīng)速率反而下降，因此只有在某一溫度下，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，這個(gè)溫度就稱為酶反應(yīng)的最適溫度（opptimumtemperature)。每種酶在一定條件下都有其最適溫度。vt/0C最適溫度第9頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三4、pH

酶的活力受環(huán)境pＨ的影響，在一定pＨ下，酶表現(xiàn)最大活力，高于或低于此pＨ，酶活力降低，通常把表現(xiàn)出酶最大活力的pＨ稱為該酶的最適pＨ（optimumpH)

各種酶在一定條件下都有其最特定的最適pH，因此最適pH是酶的特性之一。但酶的最適pH不是一個(gè)常數(shù)，受許多因素影響，隨底物種類和濃度、緩沖液種類和濃度的不同而改變，因此最適pH只有在一定條件下才有意義。第10頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第11頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

pH影響酶活力的原因可能有以下幾個(gè)方面：（1）過酸或過堿可以使酶的空間結(jié)構(gòu)破壞，引起酶構(gòu)象的改變，酶活性喪失。（2）當(dāng)pH改變不很劇烈時(shí)，酶雖未變性，但活力受到影響。（3）pH影響維持酶分子空間結(jié)構(gòu)的有關(guān)基團(tuán)解離，從而影響了酶活性部位的構(gòu)象，進(jìn)而影響酶的活性。第12頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

5、激活劑對酶反應(yīng)的影響

凡是能提高酶活性的物質(zhì)都稱為激活劑(activator)，其中大部分是無機(jī)離子或簡單的有機(jī)化合物。作為激活劑的金屬離子有K+、Na2+、

Ca2+、Mg2+、

Zn2+

及Fe3等離子，無機(jī)陰離子如：Cl-、

Br-、I-、CN-、

PO43-

，氫離子，中等大小的有機(jī)分子以及具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的大分子物質(zhì)等都可作為激活劑。激活劑對酶的作用具有一定的選擇性，即一種激活劑對某種酶起激活作用，而對另一種酶可能起抑制作用；有時(shí)離子之間有拮抗作用；有時(shí)金屬離子間也可互相替代。第13頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三第七節(jié)酶的分離純化一.分離純化酶的原則

設(shè)計(jì)酶的純化方案時(shí)要考慮到應(yīng)用，下列各點(diǎn)是應(yīng)認(rèn)真遵循的原則：第一，要注意防止酶變性失效，這一點(diǎn)在純化的后期更為突出。第二，從理論上說，凡是用于蛋白質(zhì)分離純化的一切方法都同樣適用于酶。第三，酶具有催化活性，檢測酶活性可以跟蹤酶的來龍去脈，為酶的抽提、純化以及制劑過程中選擇適當(dāng)?shù)姆椒ㄅc條件提供直接的依據(jù)。第14頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二.防止酶變性失效的方法

(1)除了少數(shù)例外，所有操作都應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行，尤其是在有機(jī)溶劑存在的情況下更應(yīng)特別小心。

(2)大多數(shù)酶在pH<4或pH>10的情況下不穩(wěn)定，故必須控制整個(gè)系統(tǒng)不要過酸過堿；同時(shí)要避免在調(diào)整pH時(shí)產(chǎn)生局部酸堿過量的現(xiàn)象。

(3)酶和其它蛋白一樣，常易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成。

(4)重金屬等能引起酶失效，有機(jī)溶劑能使酶變性,微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞，所有這些也都應(yīng)予以足夠的重視。第15頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三整個(gè)純化工作包括三個(gè)基本環(huán)節(jié)：抽提、純化和精制。常用的抽提方法除細(xì)胞自溶外，還有有機(jī)溶劑或表面活性劑處理等化學(xué)方法；近年來為適應(yīng)日益增多的胞內(nèi)酶分離提純的需要，發(fā)展和設(shè)計(jì)了不少細(xì)胞或菌體的破碎設(shè)備，如超聲波振蕩器、高壓噴擠設(shè)備、勻漿裝置及振動(dòng)球磨。第16頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、純化方法酶分離純化工作是酶學(xué)研究的重要組成部分，亦是酶制劑工業(yè)生產(chǎn)的主要內(nèi)容。要研究或使用一個(gè)酶，就得采用分離純化方法去得到它。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以用于蛋白質(zhì)的分離純化方法一般都適用于酶的分離純化。此外根據(jù)酶與底物、底物結(jié)構(gòu)類似物、輔助因子、抑制劑等的特異親和力，可發(fā)展酶獨(dú)特的親和色譜技術(shù)。整個(gè)純化工作包括三個(gè)基本環(huán)節(jié)：抽提、純化和精制。如果欲分離的目標(biāo)分子是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物，首先涉及的是細(xì)胞的破碎，接下來的分離過程可分成粗分離和精制分離。第17頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（一）酶的抽提抽提的要求是將盡可能多的酶、盡量少的雜質(zhì)從原料引入溶液。1.預(yù)處理過去多用動(dòng)物或植物的器官組織作為酶的來源，近年來則主要采用微生物作材料。但是不管什么原料，通常都需要先進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。例如，動(dòng)物材料要剔除結(jié)締組織、脂肪組織；油質(zhì)種子最好先用乙醚等脫脂；種子研磨前應(yīng)去殼，以免丹寧等物質(zhì)著色污染；微生物材料則應(yīng)將菌體和發(fā)酵介質(zhì)分離。經(jīng)過這些處理后，材料須盡可能以非常新鮮的狀態(tài)直接應(yīng)用，否則就應(yīng)將完整材料立即冰凍起來。第18頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2.破碎細(xì)胞酶根據(jù)它的分布可分為細(xì)胞內(nèi)酶和細(xì)胞外酶，根據(jù)它的存在狀態(tài)，即是否與細(xì)胞內(nèi)的顆粒體或膜結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)酶又可分為結(jié)酶與溶酶。細(xì)胞外酶沒有破細(xì)胞問題；但是細(xì)胞內(nèi)酶卻只有在細(xì)胞破裂后才能釋放出來，而且抽提效果也往往與細(xì)胞破碎程度有關(guān)。至于結(jié)酶，還有一個(gè)切斷它與顆粒體或膜的連結(jié)問題。

第19頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三破碎細(xì)胞的手段：動(dòng)、植物材料：通常用絞肉機(jī)作成組織糜，如果需要破碎得更徹底些，可用高速組織搗碎器搗碎，或者加砂研磨。高速搗碎器操作簡便、破碎效果好，但易引起局部溫度過高，導(dǎo)致酶失效，故必須考慮酶的特點(diǎn)謹(jǐn)慎使用。加砂研磨，特別是用玻璃粉或氧化鋁代替砂時(shí)，要注意有時(shí)可能發(fā)生吸附變性。在上述機(jī)械處理后，為了有利于下一步抽提，還可進(jìn)一步作成丙酮干粉，或者進(jìn)行反復(fù)冰凍融解處理，量少時(shí)，某些組織還可采用勻漿器將細(xì)胞研磨破碎。第20頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三微生物材料：不同的微生物材料處理的方法與難易程度也各有差異。

霉菌材料比較容易，可通過機(jī)械剪切、研磨或加細(xì)胞壁溶解酶解決。

細(xì)菌，少量材料常用超聲波破碎器和溶菌酶等處理；大量材料通常采用丙酮干粉法，或采用自溶法。

酵母細(xì)胞壁厚較難對付，過去多用自溶法，現(xiàn)在可采用的辦法有：(1)細(xì)胞壁溶解酶處理法；

(2)鹽振蕩法；

(3)冷熱破壁法。第21頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3.抽提

細(xì)胞破碎后，可采用兩種方式進(jìn)行抽提：一是“普遍”抽提；二是先后用不同溶劑進(jìn)行選擇性抽提。第22頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三抽提條件的選擇：

由于大多數(shù)酶屬于球蛋白類，因此一般部可以用稀鹽、稀酸或稀堿的水溶液進(jìn)行抽提。但抽提液的具體組成和抽提條件的選擇取決于酶的溶解性、穩(wěn)定性以及有利于切斷酶和其它物質(zhì)的聯(lián)系。需要考慮的因素有：

pH；鹽；溫度；其它。第23頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三a.pH

首先應(yīng)考慮酶的酸堿穩(wěn)定性，選擇的pH不應(yīng)超出酶的穩(wěn)定范圍；其次從最佳的抽提效果著眼，最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)。也就是說，酸性蛋白質(zhì)宜用堿性溶液抽提，堿性蛋白質(zhì)宜用酸性溶液。例如，肌肉甘油醛—3—磷酸脫氫酶以稀堿抽提時(shí)產(chǎn)量較高，胰蛋白酶選用0.25N硫酸。第三，在某些情況下抽提還要兼顧到有利于切斷酶和細(xì)胞內(nèi)其它成分間可能的聯(lián)系，從這點(diǎn)考慮以選用pH4—6為佳。第24頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三b.鹽大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度，所以抽提液一被采用等滲鹽溶液。最普通的加0.020—0.050M的磷酸緩沖液、0.15MNaCl等。焦磷酸鈉和檸檬酸鈉的緩沖有助于切斷酶和其它物質(zhì)的連系，并有絡(luò)合某些金屬的作用，因此用得也很多。

少數(shù)情況用水抽提效果亦佳，如霉菌脂肪酶的抽提，這可能與低滲可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān).第25頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三c.其它在破細(xì)胞后，某些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)也往往受到損傷，這樣就可能給抽提系統(tǒng)帶來各種不穩(wěn)定因素。為此，有時(shí)還需要在抽提液中加入某些物質(zhì)。例如，為防止蛋白酶的破壞性水解作用可加入苯甲基磺酰氟；為防止氧化等因素的影響可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。抽提液的用量：

通常采用原料量的l—5倍，有時(shí)為了抽提效果好些，要反復(fù)抽提，液量可能大些。第26頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三4.固體成份除去：

抽提后的細(xì)胞殘?jiān)虬l(fā)酵液的固體成份多可用離心法或壓濾法除去。植物原料的抽提液在冷室中放置過夜往往就會自動(dòng)澄清。某些情況下，在抽提液離心時(shí)加入氫氧化鋁凝膠或磷酸鈣膠等物質(zhì),有助于除去懸浮的膠體物質(zhì)。第27頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（二）濃縮抽提液和發(fā)酵液中酶的濃度一般都很低,所以在進(jìn)行純化前須先加以濃縮。常用的濃縮方法有：

1.蒸發(fā)；2.超過濾；

3.膠過濾；4.冰凍濃縮；

5.其它第28頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三1蒸發(fā)

減壓蒸發(fā)濃縮除了效率低、費(fèi)時(shí)外，有時(shí)還要加熱，同時(shí)也可能產(chǎn)生泡沫，因此對穩(wěn)定性差的酶不適宜。另外，蒸發(fā)過程可能產(chǎn)生增色現(xiàn)象，達(dá)也影響產(chǎn)品質(zhì)量。

超蒸發(fā)法，即讓暖空氣流通過冷的酶溶液表面,或讓暖空氣流通過裝有酶液的透析袋使之加速蒸發(fā)，但此法效率不佳。第29頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

薄膜蒸發(fā)濃縮法（現(xiàn)在多采用的方式），即使待濃縮的酶溶液在高度真空條件下變成極薄的液膜，同時(shí)使之與大面積熱空氣接觸，其中水分就能瞬時(shí)蒸發(fā)而達(dá)到濃縮的目的。由于水分蒸發(fā)時(shí)能帶走部分熱量，所以只要真空條件好，酶在濃縮過程中實(shí)際受到的熱作用并不太強(qiáng)，可用于熱敏性酶類的濃縮。薄膜蒸發(fā)濃縮器有三種形式：升膜、降膜和刮板。對于較粘稠的樣品，后一種形式似乎更為適合，不過薄膜濃縮也往往會帶來增色現(xiàn)象。第30頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

2超過濾在加壓情況下，將待濃縮溶液通過一層只容許水分子和小分子選擇性地透過的微孔超濾膜,而酶等大分子被滯留,從而達(dá)到濃縮目的的一種有效方法。

優(yōu)點(diǎn)：沒有熱破壞，沒有相變化，保持原來的離子強(qiáng)度和pH。只要膜選擇適當(dāng),濃縮過程還可能同時(shí)進(jìn)行粗分,此外成本也不高,已漸漸為人們所采用。超過濾可用于小量樣品,也可用于工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。

注意：超濾膜有干型和濕型兩種，后者必須保持于溶液中。第31頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

3膠過濾

這是利用葡聚糖凝膠sephdexG—25或G—50等能吸水膨潤、而酶等大分子被排阻于膠外的原理進(jìn)行的濃縮。通常采用“靜態(tài)”方式，即將干膠直接加入樣品溶液（干膠用量可根據(jù)膠的吸水量計(jì)算），膠吸水膨潤一定時(shí)間后，再借助過濾或離心等辦法分離濃縮的酶液。膠過濾濃縮法的優(yōu)點(diǎn)是，條件溫和，操作簡便，也沒有pH與離子強(qiáng)度等的改變。第32頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

4冰凍濃縮

原理:溶液相對純水融點(diǎn)升高,冰點(diǎn)降低。這有兩種方式：

1.先將溶液凍成冰塊。然后使之緩緩融解，這樣幾乎不含蛋白質(zhì)和酶的冰塊就浮于液面,而酶等則融解并集中于下層溶液(約為原體積的1／4);2.讓酶溶液緩緩凍凝，爾后移去水形成的冰塊.

問題:濃縮過程可能會發(fā)生離子強(qiáng)度與pH的變化,從而導(dǎo)致酶失效；其次是需要大功率的致冷設(shè)備.

第33頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

5.其它還有聚乙二醇等濃縮法，它們一般只適用小量樣品，而且往往成本很高。第34頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（三）酶的純化在抽提液中,除了待純化的酶外,通常不可避免地雜有其