惰性載體對瘤胃真菌產(chǎn)酶活性的影響情況情況

PAGE14青島農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文題目：惰性載體對瘤胃真菌產(chǎn)酶活性的影響姓名：學(xué)院：動物科技學(xué)院專業(yè)：動物科學(xué)班級：1001學(xué)號：20103867指導(dǎo)教師：王利華2014年惰性載體對瘤胃真菌產(chǎn)酶活性的影響動物科學(xué)專業(yè)吳碩文指導(dǎo)教師王利華摘要：本試驗(yàn)采用二因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過體外固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，利用從嶗山奶山羊瘤胃內(nèi)分離純化的一株真菌菌株探討不同惰性載體（珍珠巖、沸石、膨潤土）及不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）對瘤胃真菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、微晶纖維素酶、濾紙酶酶活的影響。結(jié)果表明，沸石、膨潤土添加組顯著提高羧甲基纖維素酶活（P<0.05），載體添加量對酶活影響不顯著（P>0.05）。載體類型、添加量及載體類型與添加量互作對對微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和濾紙酶均有顯著影響（P<0.05），以沸石為載體、添加量為0.2%時(shí)產(chǎn)酶活性最高。在發(fā)酵第8天時(shí)，各組酶活較高。綜上所述，本試驗(yàn)條件下載體為沸石、添加量為0.2%、培養(yǎng)8天對瘤胃真菌產(chǎn)纖維素酶活最高。關(guān)鍵詞：載體；添加量；載體類型；纖維素酶活

InfluenceofinertCarrieronCellulaseActivitiesfermentedbyRuminalFungusStudentMajoringinAnimalScienceWuShuowenTutorWangLihuaAbstract:Solid-statefermentationinvitrowasadoptedtostudytheeffectsofinertcarriertypesandsupplementsoncelluloseactivitiesbytwofactorsexperimentaldesign.Carriertypesincludedperlite,zeolite,bentonite,andcarriersupplementswere0.2%,0.4%and0.6%,respectively.AfungusstrainpurifiedandisolatedfromtherumenofLaoshandairygoatswasfermentedtoproducecellulases.Carboxymethylcellulase,β-glucosidase,microcrystallinecellulaseandfilterpaperenzymeweremonitored.Comparedtobentonite,zeoliteandbentonitesignificantlyimprovedCarboxymethylcellulase(P<0.05),andthecarriersupplementshadnosignificanteffectsontheCarboxymethylcellulase(P>0.05).Carriertypes,carriersupplementsandtheinteractionofcarriertypeswithsupplementshadsignificanteffectsonβ-glucosidase,microcrystallinecellulaseandfilterpaperenzyme(P<0.05).Thezeolitesupplementof0.2%hadthegreatestactivityofβ-glucosidase,microcrystallinecellulaseandfilterpaperenzyme.Thecellulaseactivitieshadthegreatestatfermentationtimepointof8day.Itcouldbeconcludedfromresultsthatthezeoliteof0.2%hadthegreatestcellulaseactivitiesat8dfermentationinthepresentexperiment.Keywords:carrier;supplement;carriertype;cellulaseactivity

引言近年來，隨著我國畜牧業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展，畜牧生產(chǎn)對糧食的需求越來越大，這就給我國的糧食生產(chǎn)需要造成了很大的壓力，致使人畜糧食矛盾越來越突出。纖維素類物質(zhì)是地球上存在的最廉價(jià)、最豐富、最易得的一類碳水化合物。據(jù)估計(jì)，全球植物每年通過綠色光合作用生產(chǎn)的纖維素大約為4.0×1010噸[1]。它們是自然界中存在量最大的一類可再生資源，然而大部分纖維素性的資源由于難以消化被白白浪費(fèi)掉，甚至成為數(shù)量最大的一類環(huán)境污染物。我國是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，每年都會產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)秸稈，而這可以很好的作為反芻動物的飼料。這些秸稈中的纖維素對于反芻動物來說，利用率很低，如何有效地利用纖維素類物質(zhì)發(fā)展糧食節(jié)約型畜牧業(yè)已經(jīng)成為廣大畜牧工作者共同的目標(biāo)。2010年全國食用菌產(chǎn)量突破2200萬噸，達(dá)2201.6萬噸[2]。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示，每生產(chǎn)1kg的食用菌，大約可產(chǎn)生5kg的菌糠廢棄物[3]。菌糠是指經(jīng)栽培食用真菌菌后的廢棄物，主要含有大量可利用率低的粗纖維、木質(zhì)素和具有較高利用價(jià)值的菌絲體，還含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、維生素和微量元素[4]。雖在食用菌的初次發(fā)酵后可作為飼料來飼喂動物，并且通過動物飼養(yǎng)試驗(yàn)肯定了其飼料級價(jià)值，但是其營養(yǎng)物質(zhì)含量仍較低，粗纖維含量相對較高，動物利用量較少，目前絕大部分菌糠被作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢料丟棄，白白浪費(fèi)。瘤胃真菌是一類具有產(chǎn)較高纖維素降解酶活性的厭氧性微生物，因其能夠分泌羧甲基纖維素酶、微晶纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶等多種酶類，越來越受到科研工作者的重視。如何提高瘤胃真菌的體外適應(yīng)性和產(chǎn)酶活性是一項(xiàng)亟待解決的問題。另外，瘤胃真菌所產(chǎn)纖維素降解酶的體外作用條件及飼料降解的實(shí)際作用效果也有待驗(yàn)證。據(jù)了解雖然許多高校試驗(yàn)室都在做瘤胃真菌體外液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)，但是測得的酶活性普遍較低，根本不能滿足生產(chǎn)需要。本試驗(yàn)參考國內(nèi)外采用生物膜技術(shù)來治理水污染的成熟的方法來進(jìn)行瘤胃真菌體外固態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，以求找到能夠提高酶活力的有效發(fā)酵方法。生物膜技術(shù)在國內(nèi)飼料營養(yǎng)學(xué)上還較少運(yùn)用，主要是以惰性載體（如沸石、珍珠巖、膨潤土等）作為菌體生長的依附面，使菌體迅速繁殖，快速形成一層生物膜，提高其對外界環(huán)境的適應(yīng)性。該試驗(yàn)采用二因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討不同惰性載體（珍珠巖、沸石、膨潤土）、不同添加量（0.2%、0.4%、0.6%）及發(fā)酵時(shí)間對瘤胃真菌產(chǎn)羧甲基纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、微晶纖維素酶、濾紙酶酶活的影響。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料從瘤胃厭氧菌分離純化的一株真菌菌株，由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)試驗(yàn)室提供；玉米粉、麩皮、菌糠、花生蔓、珍珠巖、沸石、膨潤土均為市售。玉米粉、麩皮、菌糠、花生蔓采用德國Henneherg和Stohmann[7]飼料概略養(yǎng)分分析方案對原料的概略養(yǎng)分進(jìn)行分析。分析結(jié)果見表1。表1原料常規(guī)養(yǎng)分表Table1Nutrientscompositionsofmaterialsinsubstrate原料Crudmaterial粗蛋白（%）CP粗脂肪（%）CE中性洗滌纖維（%）NDF酸性洗滌纖維（%）ADF干物質(zhì)（%）DM玉米7.813.1540.273.9687.93麩皮16.83.1846.137.9289.03菌糠9.330.3064.2436.4586.90花生蔓12.712.2155.4349.3091.31固體底物10.802.4049.1020.3088.60注：固態(tài)底物為玉米:麩皮:菌糠:花生蔓=4:2:2:2混合后的底物。1.2試驗(yàn)儀器電子分析天平（上海精科天美貿(mào)易有限公司，型號FA1204B）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（龍口先科儀器公司）、高速離心機(jī)（EPPENDORF5415D）、電熱恒溫水浴鍋（浙江市三和儀器儀表公司，型號SY21-Ni）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（吳江宏成電熱設(shè)備有限公司，型號202B）、PHS-3C型pH計(jì)、二氧化碳罐、馬弗爐（東莞市豪邦儀器設(shè)備有限公司，型號SX2）、立式壓力蒸汽滅菌器（上海波迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、電子調(diào)溫萬用電爐（1KW×4，龍口市先科儀器有限公司）、專用單向發(fā)酵袋。1.3培養(yǎng)基的制備1.3.1種子培養(yǎng)基制備本試驗(yàn)種子培養(yǎng)基的制備參照朱崇淼[5]的方法，見表2。1.3.2平板培養(yǎng)基的制備：每升種子培養(yǎng)基中加入瓊脂15g，配制而成。置于立式壓力蒸汽滅菌器中經(jīng)121℃高溫高壓滅菌后倒板冷卻備用。1.3.3固體發(fā)酵底物制備：按照玉米：麩皮：菌糠：花生蔓=4:2:2:2的比例配合發(fā)酵底物120Kg，均勻混合后裝袋備用。

表2液體培養(yǎng)基配方（每升含量）Table1.1Compositionofculturemedium(Everylitresofcontent)成分Composition碳酸氫鈉NaHCO3葡萄糖Glucose酵母膏Yeastcream蛋白胨Pepton緩沖液ABufferA緩沖液BButterB無細(xì)胞瘤胃液Cell-freerumen-fluid蒸餾水Distilledwater含量5.0g1.0g1.0g1.0g165mL165mL170mL500mL注：=1\*GB3①表中所用蒸餾水需要煮沸冷卻后再使用，以便排除水中溶解的氧氣。=2\*GB3②培養(yǎng)基在配置完成后，要加入1mL0.1%的刀天青水溶液作為厭氧指示劑。=3\*GB3③每升緩沖液A中，需含有硫酸銨3.9g、氯化鈉6.0g、二水氯化鈣0.4g、磷酸二氫鉀3g和七水硫酸鎂0.6g，倒入已煮沸排除氧的蒸餾水溶解備用。=4\*GB3④每升緩沖液B中，需含三水磷酸氫二鉀4g，倒入已煮沸排除氧的蒸餾水溶解備用。=5\*GB3⑤制備無細(xì)胞瘤胃液的方法：在每天下午4點(diǎn)采取安裝永久瘤胃瘺管的嶗山奶山羊B的新鮮瘤胃液，靜置沉淀半小時(shí)后，置于4000r/min離心機(jī)中離心25min，取上清液于燒杯中保存在-20℃冰箱中以備用。=6\*GB3⑥上訴培養(yǎng)基配制好后需通入二氧化碳2～3h至飽和，再加入0.15%的L-半胱氨酸鹽酸鹽，以便使溶液盡可能的保持厭氧環(huán)境。=7\*GB3⑦以上步驟都完成后，采用高溫高壓經(jīng)121℃滅菌15min，常溫冷卻后備用。1.4試劑配制1.4.1制取pH=4.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液pH=4.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的制備,本試驗(yàn)參照王建等[6]方法，將0.1mol/L醋酸溶液9.2mL和0.1mol/L醋酸鈉溶液10.8mL混合。1.4.2制取羧甲基纖維素鈉溶液羧甲基纖維素鈉溶液的制備，本試驗(yàn)參照王建等[6]方法，稱取1.0g羧甲基纖維素鈉鹽溶于100mLpH=4.8醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，待使用時(shí)需搖勻。1.4.3制取pH=6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液取737mL0.1mol/L的檸檬酸溶液，加入1263mL0.2mol/L的磷酸氫二鈉溶液，加熱混勻即可。1.4.4制取3,5-二硝基水楊酸（DNS）溶液準(zhǔn)確稱取酒石酸鉀鈉鹽182.0g于1000mL燒杯中，加入蒸餾水500mL，水浴加熱溶解（不超過50℃），溶解后再依次加入已稱量好的3,5-二硝基水楊酸6.30g、氫氧化鈉21.09g、重結(jié)晶苯酚5.09g，無水亞硫酸鈉鹽5.09g，用玻璃棒攪拌至完全溶解，冷卻后定容至1000mL棕色容量瓶內(nèi)，避光保存，放置一周后取上清液使用。1.5菌種擴(kuò)繁1.5.1菌種活化將保存在-20℃中的B菌種平板培養(yǎng)基取出，置于39℃下解凍備用。在超凈臺中進(jìn)行無菌接種，右手取接種環(huán)在酒精火焰上灼燒滅菌，先將環(huán)燒熱至發(fā)紅，然后將整個(gè)細(xì)金屬絲燒紅，再將接種環(huán)傾斜，沿著環(huán)向上依次燒，直到燒至可能碰到培養(yǎng)基的部分，如此返回在燒到環(huán)端，來回通過火焰數(shù)次。待接種環(huán)自然冷卻（或蘸取平板內(nèi)水珠冷卻）后，刮取已在室溫下解凍的平板上的菌落，左手持瓊脂平板，在靠近酒精燈火焰處略開蓋。右手持已取標(biāo)本的接種環(huán)伸入到瓊脂平板表面一側(cè)邊緣，利用腕力將接種環(huán)在平板上來回劃線。1.5.2傳代培養(yǎng)上述菌株培養(yǎng)三天后，進(jìn)行菌體傳代擴(kuò)繁。將已配好的2L液體種子培養(yǎng)基分別均分于10個(gè)17×25cm封口袋中（即每袋200mL），再把已活化的菌接種到封口袋中，仍置于39℃的溫箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)3天，觀察菌體生長情況，此操作依舊需要在超凈臺中進(jìn)行。菌體一般傳3代后可滿足試驗(yàn)需要量。1.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)本試驗(yàn)采用二因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，載體類型為珍珠巖、沸石、膨潤土，載體添加量分別0.2%、0.4%、0.6%。1.7試驗(yàn)方法及酶活測定每個(gè)固態(tài)培養(yǎng)基重200g，其中添加固態(tài)底物80g，其余為水分（包含菌體培養(yǎng)液）。固態(tài)底物和已與菌體培養(yǎng)液20mL混合的載體混合物拌勻后裝袋，經(jīng)抽真空后置于39℃溫箱中發(fā)酵，每隔2天采樣測酶活。取固態(tài)培養(yǎng)物1g左右于15mL離心管中，用移液槍向離心管中加入10mLpH=6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，震蕩混勻后，靜置30min，然后置于4000r/min高速離心機(jī)離心30min，取上清液于10mL離心管中，置入4℃的冰箱中冷藏備用，測定其中的羧甲基纖維素酶（Carboxymethylcellulose,CMC）、微晶纖維素酶（Microcrystallinecellulose,MCC）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase,BGL）、濾紙酶（filterpaperenzyme,FPA）活性。1.7.1羧甲基纖維素酶（CMC）活性測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照朱崇淼等[5]的方法稍加改進(jìn)，分別稱取已經(jīng)烘干恒重的葡萄糖0.04g、0.08g、0.12g、0.16g、0.20g，分別溶于5個(gè)25mL的小容量瓶中，配成用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后分別再取0.2mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL離心管中，空白組加入0.2mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液，再向每個(gè)離心管中加入1mL蒸餾水和1.8mL緩沖液，混勻后置于50℃水浴中加熱5min，最后加入3mLDNS溶液，沸水浴5min后迅速置于冷卻，將紫外分光光度計(jì)設(shè)置在550nm波長處測取吸光值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。本試驗(yàn)參照Lowe等[8]方法稍加改良，取已配好的羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液1mL于10mL離心管中，再加入1.8mLpH=6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，置于50℃水浴鍋預(yù)熱5min后，后加入稀釋10倍的發(fā)酵液0.2mL，混合均勻，50℃水浴加熱30min后，加入DNS溶液3mL，沸水浴5min后迅速置于冷水冷卻，置550nm波長讀取吸光值。對照組發(fā)酵液上清液經(jīng)煮沸滅活后作對照。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算所測的上清液釋放的葡萄糖具體含量。酶活力定義為在上述條件下，每分鐘釋放1μmol葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位（U），換算成每克干物料含有的酶活，以U/g（干物質(zhì)）。圖圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standardcurveofglucose酶活力計(jì)算：酶活力(U/g)=W×N×1000/(T×m×M)。W-酶解反應(yīng)產(chǎn)生得葡萄糖量，從葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得，單位：g；T-反應(yīng)時(shí)間，30min；N-酶液得稀釋倍數(shù)；50M-葡萄糖分子量，180.16g/mol；m-樣品干物質(zhì)質(zhì)量，g。1.7.2微晶纖維素酶(MCC)活性的測定本試驗(yàn)此方法根據(jù)HossamM[9]的方法改良。取1mL微晶纖維素的溶液于10mL離心管中，加入1.8mLpH=6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，50℃水浴預(yù)熱5min后，加入0.2mL稀釋10倍的發(fā)酵液上清，50℃水浴保溫30min后，加3mLDNS溶液，100℃沸水浴5min顯色冷卻后，置于紫外可見光光度計(jì)中550nm波長讀取吸光值，對照組以經(jīng)煮沸滅活的發(fā)酵液上清作對照，然后以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算所測上清液釋放的葡萄糖含量。酶活力的定義同上文所述的羧甲基纖維素酶。1.7.3β-葡萄糖苷酶(BGL)活性測定取1mL水楊素溶液于10mL離心管中，加入1.8mLpH=6.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，50℃水浴預(yù)熱5min，加入0.2mL稀釋10倍的發(fā)酵液上清，50℃水浴加熱30min，然后加入3mLDNS溶液，100℃沸水浴5min后，置于冷水中流水冷卻，于紫外可見光光度計(jì)中550nm波長處讀取吸光值，對照組以經(jīng)煮沸滅活的發(fā)酵液上清作對照，最后參考葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算所測上清液釋放的葡萄糖大致含量。酶活力定義同上文羧甲基纖維素酶活。1.7.4濾紙酶(FPA)活性測定本試驗(yàn)濾紙酶活的測定參考趙玉萍[10]等的方法稍加改良。加1.8mLpH=6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液于10mL離心管中，水浴加熱到50℃，預(yù)熱5min后，加入一條1×6cm新華濾紙（50±1mg），再加入稀釋10倍的0.2mL酶液后，50℃水浴加熱30min，再加入3mLDNS溶液。沸水浴5min后，置于冷水中流水迅速冷卻，于紫外可見光度計(jì)中550nm波長處讀取吸光值，空白組以經(jīng)煮沸滅活的發(fā)酵液上清作對照,最后參考葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所產(chǎn)葡萄糖的含量。酶活力定義同上文已述的羧甲基纖維素酶。1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel初步處理后，用SAS9.3軟件的MIXED過程，分別對載體類型、載體添加量以及二者互作效應(yīng)進(jìn)行方差分析，計(jì)算最小二乘均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)誤，用Tukey法對最小二乘均數(shù)進(jìn)行多重比較。2試驗(yàn)結(jié)果由表3可知，載體類型及載體與添加量互作對纖維素酶活影響顯著（P<0.05），沸石和膨潤土添加組的酶活均顯著高于珍珠巖添加組（P<0.05）。載體添加量對CMC酶活影響不顯著（P>0.05），但對MCC、BGL和FPA酶活影響顯著（P<0.05），0.2%載體添加組的纖維素酶活顯著高于0.6%載體添加組（P<0.05），與0.4%載體組添加組的纖維素酶活差異不顯著（P>0.05）。沸石的添加量為0.2%時(shí)，產(chǎn)酶活性最高。表3載體類型、添加量對瘤胃真菌產(chǎn)纖維素酶活的影響Table3Theeffectsofinertcarriertypesandsupplementsoncellulaseactivities項(xiàng)目珍珠巖沸石膨潤土SEP值0.20%0.40%0.60%0.20%0.40%0.60%0.20%0.40%0.60%P載體類型P添加量P載體類型*添加量CMC0.07gi0.03i0.10egi0.37a0.26abc0.19cehj0.24bcf0.31abd0.34ab0.03<.00010.4313<.0001MCC0.24dfi0.16fh0.13h0.41a0.32abcd0.25cdf0.29bcdg0.37ab0.36abce0.02<.00010.00480.0002BGL0.13eg0.08g0.17ceg0.50a0.31bd0.23bceh0.25bcf0.33b0.31b0.02<.00010.0062<.0001FPA0.28egh0.18h0.21gh0.62a0.45bd0.31ceg0.41bcf0.49ab0.47b0.03<.0001<.0001<.0001注：同行同效應(yīng)數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05)，含相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。圖圖2CMC酶活變化圖Fig.2CMCcellulaseactivitiesatdifferenttimepoints據(jù)圖2可知，沸石、膨潤土添加組對CMC酶活均顯著高于珍珠巖添加組（P<0.05）。發(fā)酵第10天的酶活顯著高于第2、4、6天的酶活（P<0.05），與第8天的酶活差異不顯著（P>0.05）。在沸石添加組中，發(fā)酵第10天的CMC酶活顯著高于第2、4、6天的酶活，并在發(fā)酵第8天時(shí)，達(dá)到產(chǎn)酶峰值；在膨潤土添加組中，發(fā)酵第4、6、8、10天的CMC酶活顯著高于第2天的酶活（P<0.05），并在第4天達(dá)到產(chǎn)酶峰值。對于珍珠巖添加組，發(fā)酵時(shí)間對CMC酶活影響不顯著。圖圖3FPA酶活變化圖Fig.3FPAcellulaseactivitiesatdifferenttimepoints據(jù)圖3可知，發(fā)酵時(shí)間對FPA酶活具有顯著影響（P<0.05），在發(fā)酵第8天時(shí)，濾紙酶酶活達(dá)到最高峰。在沸石添加組中，發(fā)酵第8天的FPA酶活與第2、4、6、10天的酶活差異顯著（P<0.05）。在膨潤土添加組，發(fā)酵第8天的FPA酶活與第2、4天的酶活差異顯著（P<0.05），但與第6、10天的酶活差異不顯著（P>0.05）。在珍珠巖添加組中，發(fā)酵第4、6、8天的FPA酶活與第2、10天的酶活差異顯著（P<0.05）；發(fā)酵第4、6、8天對FPA酶活影響不顯著（P>0.05）。圖圖4BGL酶活變化圖Fig.4BGLcellulaseactivitiesatdifferenttimepoints據(jù)圖4可知，發(fā)酵時(shí)間對BGL酶活有顯著影響（P<0.05）。在沸石添加組中，發(fā)酵第8天的BGL酶活與第2、6天的酶活差異顯著（P<0.05），與第4、10天的酶活差異不顯著（P>0.05）；在發(fā)酵第4天時(shí)，BGL酶活達(dá)到最高峰。在膨潤土添加組中，發(fā)酵第4、6、8、10天的BGL酶活與發(fā)酵第2天酶活差異顯著（P<0.05），發(fā)酵第4天酶活與第6、8、10天的酶活差異不顯著（P>0.05）。在珍珠巖添加組中，BGL酶活在發(fā)酵第4天時(shí)達(dá)到峰值，且發(fā)酵第4天BGL酶活與發(fā)酵第2、6、8、10天的酶活均差異顯著（P<0.05）。在發(fā)酵第4天時(shí)，沸石添加組的BGL酶活與膨潤土添加組、珍珠巖添加組的酶活均差異顯著（P<0.05）。圖圖5MCC酶活變化圖Fig.5MCCcellulaseactivitiesatdifferenttimepoints根據(jù)圖5可以得出，載體類型、發(fā)酵時(shí)間均對MCC酶活具有顯著影響（P<0.05）。在沸石添加組中，發(fā)酵第10天的MCC酶活與第2、4、6天的酶活差異顯著（P<0.05）,但與第8天的酶活差異不顯著（P>0.05）；在發(fā)酵第4天、第8天時(shí)，均出現(xiàn)峰值，但第8天的峰值顯著高于第4天的峰值（P<0.05）。3討論纖維素酶作為一種新型飼料添加劑，已成為目前動物飼料生產(chǎn)中的研究熱點(diǎn)[11]。我們將外源纖維素酶添加到豬、禽等單胃動物的飼料中，可以通過改善胃腸道內(nèi)微生物生態(tài)環(huán)境，提高胃腸道的消化能力，刺激腸粘膜釋放纖維素消化酶，不僅可以有效的解決飼料中粗纖維消化率低的問題，還可以改善動物產(chǎn)品的品質(zhì)。本試驗(yàn)之所以采用菌糠、花生蔓作為粗纖維添加物，是因?yàn)槎咴谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的產(chǎn)量相當(dāng)大，其中大部分以農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢物丟棄，不僅浪費(fèi)還造成一定的環(huán)境問題，尤其在山東省突出。瘤胃真菌可以產(chǎn)生一系列的酶，據(jù)大量相關(guān)研究表明，瘤胃真菌可以產(chǎn)生酶活最高的超級酶，加拿大學(xué)者已經(jīng)成功的從瘤胃真菌中分離到具有超高活性的木聚糖酶，并通過相關(guān)的現(xiàn)代化技術(shù)手段使之酶活性達(dá)到目前市場所有酶活性的7倍[12]。瘤胃真菌對體外發(fā)酵環(huán)境要求較低，采用固態(tài)發(fā)酵便于大規(guī)模操作生產(chǎn)、節(jié)約生產(chǎn)成本，對場地、設(shè)備要求較低。通過本試驗(yàn)探索出一條提高纖維素酶活的新方法，這樣就可以將菌糠等農(nóng)業(yè)廢棄物變廢為寶，以其作為固態(tài)發(fā)酵的底物大量生產(chǎn)在動物飼料上運(yùn)用廣泛的纖維素酶，提高飼料消化率，改善動物產(chǎn)品品質(zhì)。由圖2、圖3、圖4、圖5對比可知，在發(fā)酵第8天時(shí)，沸石添加組的酶活值普遍較高；但是部分酶的酶活折線圖出現(xiàn)兩個(gè)峰值，可能與采樣、稱量等誤差有關(guān)，亦可能是由于采樣時(shí)不能保證無氧環(huán)境，導(dǎo)致發(fā)酵袋中進(jìn)入空氣，致使菌群生長出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)。生物膜技術(shù)已在污水治理上得到廣泛運(yùn)用，并取得了理想的效果。該技術(shù)主要是使菌體依附在載體上不斷生長，形成一層菌膜，可以提高菌體對外界的適應(yīng)性，迅速繁殖[13]。本試驗(yàn)創(chuàng)新處在于利用廣義上的生物膜技術(shù)為瘤胃真菌提供較大的附著表面積，有利于提高對不良環(huán)境的適應(yīng)能力，不僅可以使菌體在培養(yǎng)基中分布更廣泛，而且產(chǎn)纖維素酶活較高。生物膜技術(shù)可提高產(chǎn)酶活性的機(jī)理推測為：一、真菌在載體表面生長形成菌膜層；二、個(gè)體間相互聯(lián)系，形成一個(gè)統(tǒng)一的整體來增強(qiáng)對環(huán)境的適應(yīng)性；三、真菌通過形成的菌膜來增加與底物接觸的表面積。本試驗(yàn)為以后從事相關(guān)科學(xué)研究的工作者提供一個(gè)參考。4結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，載體為沸石、添加量為0.2%、培養(yǎng)8天，CMC、MCC、BGL、FPA活性最高。參考文獻(xiàn)：[1]張海生,張同亮,陳德兆.纖維素酶對纖維素的作用機(jī)理及其在紡織上的應(yīng)用[J].四川紡織技術(shù),2003,（6）:3-5.[2]張俊飚,李波.對我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀與政策思考[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(社會科學(xué)版),2012,（5）:13-21.[3]ParedesC,MedinaE,MoralR,etal.CharacterizationoftheDifferentOrganicMatterFractionsofSpentMushroomSubstrate[J].CommunicationsinSoilScienceandPlantAnalysis,2009,40（1-6）:150-161.[4]陳君琛,沈恒勝,湯葆莎等.食用菌菌糠再利用技術(shù)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào).2006,22（11）:410-412.[5]朱崇淼.產(chǎn)纖維降解酶厭氧真菌菌株的篩選及其粗酶性質(zhì)的研究[D].江蘇南京衛(wèi)崗,南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2003.[6]王建,賈斌,郭麗萍.飼用酶制劑中羧甲基纖維素酶等5種酶活力的測定方法研究[J].糧食與飼料工業(yè),2006,9:42-44.[7]韓友文.飼料常規(guī)概略養(yǎng)分分析方案[J].飼料博覽,2002,（2）:48.[8]LoweSE,TheodorouMK,TrinciAPJ.Cellulasesandxylanaseofananaerobicrumenfungusgrownonwheatstraw,wheatstrawholocellulose,cellulose,andxylan[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,1987,53(6):1216-1223.[9]HossamM.用于嗜熱曲霉菌屬進(jìn)行纖維素酶和蛋白質(zhì)生物合成的營養(yǎng)培養(yǎng)基成分之最佳組配[J].和致中譯.應(yīng)用微生物,1985,(6):24-28.[10]趙玉萍,楊娟.四種纖維素酶酶活測定方法的比較[J].食品研究與開發(fā).2006,27(3):116-118.[11]趙珊,劉杰,佘容等.纖維素酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)(科技版).2014,(1):31-33.[12]雷威,蘇建明,章懷云.瘤胃厭氧真菌纖維素酶的研究進(jìn)展[J].動物營養(yǎng).2005,(3):12-13.[13]田偉軍,翟金波.生物膜技術(shù)在污染河流治理中的應(yīng)用[J].環(huán)境保護(hù)(工程與技術(shù)版).2003,（8）:19-21目錄第一章總論 11.1項(xiàng)目背景 11.2項(xiàng)目概況 31.3結(jié)論與建議 6第二章改造的意義和必要性 82.1項(xiàng)目實(shí)施的背景 82.2項(xiàng)目實(shí)施的意義和必要性 8第三章改造方案 123.1技改前情況 123.2改造方案 12第四章場址方案 144.1場址所在位置現(xiàn)狀 144.2場址建設(shè)條件 14第五章技術(shù)方案、設(shè)備方案與工程方案 185.1技術(shù)方案 185.2主要設(shè)備方案 265.3工程方案 28第六章主要原材料、燃料供應(yīng) 296.1主要原材料供應(yīng) 296.2燃料供應(yīng) 29第七章總圖運(yùn)輸與公用輔助工程 307.1總圖布置 307.2公用輔助工程 31第八章節(jié)能篇 338.1項(xiàng)目節(jié)能設(shè)計(jì)規(guī)范 338.2建設(shè)項(xiàng)目能源消耗種類和數(shù)量分析 358.3項(xiàng)目所在地能源供應(yīng)狀況分析 358.4主要節(jié)能措施 368.5節(jié)能效果分析 37第九章環(huán)境影響評價(jià) 389.1廠址環(huán)境條件 389.2設(shè)計(jì)依據(jù) 389.3項(xiàng)目建設(shè)對環(huán)境的影響 389.4項(xiàng)目運(yùn)營期對環(huán)境的影響