蛋白質雙向電泳及質譜技術

關于蛋白質雙向電泳及質譜技術第1頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三蛋白質雙向電泳技術第2頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三雙向電泳簡介2-DE是目前唯一種可以僅通過一次操作解析上千種蛋白質的技術。第一向—等點聚焦(IEF)pH梯度載體pI第二向—十二烷基硫酸鈉(SDS) SDS作為變性劑和助溶劑分子量第3頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品等點聚焦(第一向)雙向電泳的基本原理與流程示意分子量pH梯度(pI)SDS兩性電解質pH9-pH3+聚丙烯酰胺第二向第4頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三雙向電泳具體步驟樣品制備緩沖液的配制IPG條重泡漲及上樣第一向：IEFIPG條平衡平衡緩沖液Ⅰ(還原)平衡緩沖液Ⅱ(巰烷基化)第二向：SDS膠條染色成像及圖像分析第5頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三為什么要進行樣品制備目前雙向電泳一般只能分辨到1000-3000個蛋白質點(spot)，而樣品中的蛋白種類可達到10萬種以上。待研究樣本(如臨床樣本)常是各種細胞和組織混雜，而蛋白質組研究的通常是單一的細胞類型。？第6頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三1保證樣品蛋白質完全溶解，分級效果好，干擾因素少盡量使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白）。避免樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。通過超離心去除所有顆粒狀物質，防止其堵塞凝膠孔路。2最大限度減少樣品的損失低溫保存樣品(一般需低于-86℃)盡量縮短處理時間除鹽，省略不必要的過程保證樣品在聚焦時不發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。樣品制備原則第7頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品制備流程及注意事項溶解預處理(清洗等)破碎沉淀按溶解度分級富集除雜第8頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品的破碎原則－最小限度的減少蛋白水解和其它形式的蛋白降解樣品的來源易碎的細胞堅硬的組織植物細胞真菌方法溫和劇烈第9頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三溫和破碎法滲透壓沖擊(培養(yǎng)的細胞)低滲液中的懸浮細胞反復凍融法(細菌)液氮冷凍去污劑降解(酵母、霉菌)降解緩沖液(含尿素和去污劑)SDS(應在IEF前去除)酶降解(植物、細菌、真菌)溶菌酶(細菌)纖維素酶，果膠酶(植物)溶壁酶(酵母)第10頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三劇烈破碎法超聲破碎(細胞懸浮液)需以冰冷卻避免過熱弗式細胞壓碎器(Frenchpressurecell，帶壁微生物細胞在剪切力作用下破碎研磨(固體組織，微生物)液氮中將固體組織磨成細粉末樣品研磨器(用于少量樣品的處理)用于精確樣品珠磨法(胞懸液，微生物)通過磨珠研磨破壞細胞壁第11頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三作用去除雜質濃縮樣品抑制蛋白酶活性關鍵-可溶性獲得可以重新溶解的蛋白常用方法硫酸銨沉淀TCA沉淀丙酮沉淀TCA/丙酮沉淀醋酸銨/甲醇/苯酚抽提樣品的沉淀

對于疏水性特別強的蛋白如膜蛋白硫脲SDS新型兩性表面活性劑(如磺基甜菜堿)第12頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品中雜質的去除去除原則盡量不丟失蛋白減少蛋白的修飾雜質的主要種類DNA/RNA脂質多糖鹽離子去污劑其他固體雜質

第13頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三DNA/RNA的去除樣品中含核酸的不利影響能被銀染色法染色在凝膠酸性部分產生水平條紋當樣品到達IEF凝膠酸性端時，與蛋白質一同沉淀去除方法蛋白沉淀法DNase/RNase處理超聲(機械破壞)、超高速離心DNA/RNA抽提(苯酚/氯仿)第14頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三其他雜質的去除脂質使蛋白質不易溶解且會影響其分子量及pI丙酮沉淀多糖阻塞膠體，影響蛋白質沉淀、聚焦TCA、硫酸銨或醋酸銨/甲苯/苯酚沉淀；超速離心和高pH鹽使膠條導電能力增強，共聚焦不易發(fā)生透析；膠體過濾；沉淀或重新懸浮離子去污劑如SDS，使蛋白質帶負電不能聚焦丙酮沉淀；將含SDS的蛋白溶于含兩性或非離子去污劑如CHAPS，TritonX-100，NP-40等的緩沖液中并使SDS終濃度＜0.25%固體雜質阻塞膠體，影響蛋白質沉淀、聚焦過濾第15頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品的溶解2-DE成功分離蛋白質的最關鍵因素之一溶解的目標樣品中非共價結合的蛋白質復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質的去除溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)第16頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三增加樣品溶解性的手段變性劑改變氫鍵結構，使蛋白疏水中心暴露伸展尿素、硫尿表面活性劑溶解疏水基團離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS等還原劑使變性蛋白進一步伸展溶解含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，不帶電荷的磷酸三丁酯(TPB)起載體作用的兩性電解質到達平衡位置形成pH梯度，“運載”電流、pH捕獲樣品中少量鹽分濃度應小于0.2％（w/v，濃度過高會使IEF的速度降低)第17頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品液的準備標準液：2g4%CHAPS定容至50mLddH2O100uL0.1%原液0.0002%溴酚藍見下表0.2%兩性電解質載體385mgDTT或500uL200mMTBP原液50mMDTT或2mMTBP24g尿素加入25mLH2O8M尿素用量試劑第18頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三IPG

用兩親性電解液的組成250l25l20%8-10125l12.5l40%7-97-10250l25l40%5-85-8125l12.5l40%4-6250l25l40%3-53-6125l12.5l40%5-7125l12.5l40%4-64-7250l25l40%3-103-10樣品溶液體積(/5ml)樣品溶液體積(/5ml)兩親性電解液濃度(w/v)兩親性電解液范圍IPG膠pH范圍第19頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三樣品制備注意事項

蛋白質水解低溫Tris堿，碳酸鈉或堿性載體兩性電解質蛋白抑制劑特殊樣品的制備低豐度蛋白的分離預分級窄pH膠(<2個pH單位)強堿性蛋白(如核糖體)的處理預處理富集特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進行等電聚焦極端分子量蛋白的處理小于8kD對流混合，產生絨毛狀或模糊的帶大于200kD的蛋白，變性為多肽第20頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三梯度器塑料支持膜固定pH梯度(ImmobilizedpHGradient,IPG)膠條的制備ACBFED酸堿

pH3pH10第21頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三固定pH梯度(IPG)示意圖聚丙烯酰胺凝膠CH2=CH-C-NH-ROCOO-丙烯酰胺單體酸緩沖基團：堿緩沖基團：NH3+R

第22頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三寬pH梯度及窄pH梯度寬pH梯度用于：

全部蛋白(確定感興趣蛋白的大致位置)窄pH梯度用于：

提高分辨率增加載樣能力以檢測、分析更多蛋白

第23頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三IPG膠的重泡漲及上樣2-DE樣品重泡漲溶液重泡漲溶液：8M尿素2%NP-40或

CHAPS2%IPG緩沖液

(兩親性電解液)0.28%DTT微量

溴酚藍IPG膠條支架IPG

膠條定位泡漲目的：使樣品能完全以可溶形式進入IPG膠條內第24頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三蛋白載樣量IPG膠條對蛋白載樣量的影響因素：待分析的蛋白點的量應滿足隨后的質譜分析待研究蛋白的豐度樣品的復雜度復雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍預試驗確定先寬后窄先線性后非線性先短后長第25頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三第一向：等點聚焦1.放置電極墊

(?)2.200V

維持

1.5h3.500V維持

1.5h

4.1000V梯度上升

1500vh5.8000V梯度上升

(?)36000vh時間電壓支架蓋IPG

膠條電極電極墊第26頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三IPG

膠條的平衡

平衡液6M尿素和30%甘油減少電內滲第一步平衡加DTT使變性的非烷基化蛋白處于還原狀態(tài)第二步平衡加碘乙酰胺使蛋白質巰烷基化，防止其在電泳過程中重新氧化第27頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三

使被分離的蛋白質與SDS完整結合第二向:SDS

SDS平衡SDSSDS平衡液50mMTris-HCl6M尿素30%丙三醇2%SDS微量

溴酚藍SDSSDSSDS向電泳緩沖液中加

0.5%的瓊脂糖SDS標記紙片IPG膠條第28頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三膠體考馬斯亮藍染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍可實現(xiàn)PAGE的無背景染色會對蛋白質進行修飾而影響質譜分析的結果胺基黑染色轉印至聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白質的染色轉印至硝酸纖維素膜上的蛋白質的染色銀染可減少膠內蛋白質產量對某些種類的蛋白質染色效果差對其后的蛋白質測序和質譜分析造成影響染色方法第29頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三銀染色50%甲醇25%乙酸4hddH2O洗3次30min/次0.004%DTT溶液30min0.1%AgNO330minddH2O30sec3%Na2CO30.0185%甲醛2.3M檸檬酸5%乙酸25%甲醇第30頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三負染主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用能專門提高PAGE膠上蛋白質的回收率速度快（5~15min）且能保持蛋白質的生物活性不能用于膜上染色適用于蛋白質顯色、完整蛋白質的膠上被動提取以及質譜分析膠體擴散染料主要包括印度墨水染料、膠體金屬染料等高靈敏度檢出電轉印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質靈敏度與PAGE膠內的銀染類似不用于膠內染色染色方法第31頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三有機熒光團染料包括共價結合和非共價結合的熒光團染料兩類，后者最為常用，其典型代表是已經商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料可對SDS膠內蛋白質進行一步染色，約30~60min完成靈敏度為2~10ng其線性范圍為3個數(shù)量級在Tris/甘氨酸轉印緩沖液中染色后，蛋白質可被轉印至膜上并進行免疫染色或Edman測序來鑒定蛋白質金屬螯合染料與現(xiàn)代蛋白質組學研究相兼容的專門與常用微量化學表征過程兼容不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質組學平臺（包括自動化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機器人剪切儀器、蛋白質酶解工作站和質譜儀等）相結合染色方法第32頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三凝膠的圖像處理分析典型流程凝膠圖像的掃描圖像加工斑點檢測和定量凝膠配比數(shù)據分析數(shù)據呈遞和解釋2-DE數(shù)據庫的建立2-DE分離的可溶性

E.coli蛋白第33頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三目前雙向電泳需解決的問題樣品的制備及溶解不溶性蛋白(膜蛋白及核內蛋白)難分離蛋白(如毛發(fā)及皮膚中的蛋白)載樣量的提高初步分離低豐度蛋白、堿性蛋白及大分子量蛋白定量分析靈敏度及可重復性第34頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三對于雙向電泳的建議首先采用寬pH范圍的膠條，確定蛋白的分布范圍，通常采用pH3-10的膠條如果pH線性分布的膠條分離效果不好，可采用非線性膠條加大蛋白上樣量，提高局部蛋白的分辨率采用窄pH范圍的膠條，提高某pH范圍蛋白的分辨率第二向采用梯度膠進行分離去除高豐度蛋白，進行蛋白的分級處理，富集低豐度蛋白第35頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三蛋白質質譜技術第36頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三質譜基礎

樣品離子源質量分析器離子檢測器固體液體蒸汽形成離子(帶電分子)電離質量分選(過濾)檢測根據m/z分選離子數(shù)據處理質譜檢測離子基本步驟:1.樣品離子化2.根據質量(m/z)不同分離離子3.檢測每種質量離子的數(shù)目4.收集、處理數(shù)據得到質譜圖第37頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三質譜的評價指標質量范圍速度靈敏度分辨率精確度第38頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三+++自由漂移區(qū)檢測器基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)樣品探針激光335nmm/z相對強度MH+MH+MH+特點：靈敏度高準確度高分辨率高質量范圍廣圖譜簡明速度快第39頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三ESI四級桿質量分析器碰撞室反射器MCP檢測器碰撞氣體串聯(lián)質譜法(MS/MS)ESI-Q-TOF質譜儀步驟：1質量分析

2碰撞(離子裂解)3質量分析TOF質量分析器第40頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三強的抗背景干擾能力極高的檢測靈敏度和準確度可用來分析復雜混合物中的蛋白質豐富的檢測信息，高通量鑒別蛋白質串聯(lián)質譜的優(yōu)點第41頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三1、鑒定和注釋蛋白質的路線

通過肽質譜指紋圖（peptidemassfingerprinting，PMF）和數(shù)據庫搜尋匹配通過串聯(lián)質譜進行單個或多個蛋白質的鑒定鳥槍法蛋白質組學第42頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三

1234.5396

783.9147375.2561多肽已測得質譜數(shù)據或理論質譜數(shù)據MALDI-TOF檢測的多肽指紋

胰酶消化凝膠蛋白質數(shù)據庫?123比較:??是否相同

??質譜3235.2256第43頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三

肽質譜指紋圖在數(shù)據庫中匹配

不成功的可能原因樣品量太少，PMF圖信噪比太低，輸入庫中搜尋的數(shù)據質量不好。2-DE膠上所取的一個蛋白質點并非單一蛋白質，所獲PMF圖實際上是兩個以上蛋白質的混合圖。第44頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三

操作中角蛋白或其他蛋白質的污染蛋白質發(fā)生了較多的轉譯后修飾，數(shù)據庫中未有記載所用胰蛋白酶質量不夠好，蛋白酶自酶解片段多未知的新蛋白質數(shù)據庫規(guī)模太小續(xù)：第45頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三氨基酸序列VLDPNTVFAL蛋白質數(shù)據庫？查詢串聯(lián)質譜圖從頭測序輸入輸出序列片段PNT①②③串聯(lián)質譜鑒定多肽的計量方法第46頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三組織切片或印片原位質譜分析技術兩級飛行時間串聯(lián)質譜（MALDI-TOF/TOF）傅里葉轉換回旋共振質譜（FTMS）表面增強激光解吸/電離飛行時間質譜（SELDI-TOF-MS）聯(lián)合技術精確鑒定蛋白質第47頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三2、基于生物質譜的定量蛋白質組研究策略

原理：對于具有相同離子化能力的蛋白質或多肽，可以通過比較質譜峰的強度（或峰面積）得到待比較蛋白質的相對量。

第48頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三3、基于質譜的蛋白質相互作用研究方法靶蛋白制備蛋白質復合體的純化蛋白質復合體的質譜鑒定基本步驟：第49頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三(1)親和層析耦聯(lián)質譜技術

基本原理：將某種蛋白質以共價鍵固定在基質（如瓊脂糖）上，含有與之相互作用的蛋白質的細胞裂解液過柱，先用低鹽溶液洗脫下未結合的蛋白質，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結合在柱子上的蛋白質，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質譜技術（MDLC-ESI-MS/MS）鑒定靶蛋白的結合蛋白。第50頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三先決條件得到足夠多的保持生物活性的重組靶蛋白作為誘餌（bait）

獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質第51頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三利用含靶蛋白的融合蛋白獲得

相互作用蛋白質谷胱甘肽S轉移酶（glutathioneS-transferase，GST）融合蛋白蛋白A融合蛋白第52頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三主要優(yōu)點

靈敏度高：高濃度靶蛋白候選蛋白質與靶蛋白的結合機會均等檢測多亞基蛋白質之間的相互作用第53頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三(2)免疫共沉淀耦聯(lián)質譜技術

原理：以細胞內源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免疫共沉淀（immuno-precipitation，IP）純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜鑒定靶蛋白的結合蛋白。

第54頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三研究鼻咽癌細胞系中的p53相互作用蛋白抗p53抗體與HNE1和HNE2總蛋白進行免疫共沉淀SDS分離免疫沉淀復合物切取p53結合蛋白條帶，酶解后進行電噴霧串聯(lián)質譜（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相應的肽序列標簽搜索數(shù)據庫第55頁，講稿共64頁，2023年5月2日，星期三特點

生理條件下蛋白質之間的相互作用所有蛋白質與靶蛋白的相互作用可檢測依賴于修