外來(lái)化合物致突變作用及其客觀評(píng)價(jià)

第一節(jié)誘發(fā)突變的類(lèi)型

誘發(fā)突變的分類(lèi)可按后果或遺傳物質(zhì)損傷的性質(zhì)等多方面進(jìn)行。較常見(jiàn)的分類(lèi)是根據(jù)遺傳物質(zhì)損傷能否用光學(xué)顯微鏡直接進(jìn)行觀察。光學(xué)顯微鏡分辨率的極限為0．2um。這一長(zhǎng)度的染色體約含4，7X106核苷酸對(duì)，在這一長(zhǎng)度以下的改變不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察，要依靠對(duì)其后代的生理、生化、結(jié)構(gòu)等的表型改變來(lái)判斷突變的發(fā)生。遺傳物質(zhì)損傷能用光學(xué)顯微鏡直接觀察的稱(chēng)為染色體畸變(chromosomeaberration)，否則稱(chēng)為基因突變(genemutation)，亦稱(chēng)點(diǎn)突變(pointmutation)。

一、基因突變

基因突變即遺傳物質(zhì)在分子水平上的改變，有堿基置換(basesubstitution)移碼(frameshift)和大段損傷。(一)堿基置換

堿基置換是某一堿基配對(duì)性能改變或脫落而引起的突變。此時(shí)首先在DNA復(fù)制時(shí)會(huì)使互補(bǔ)鏈的相應(yīng)位點(diǎn)配上一個(gè)錯(cuò)誤的堿基，即發(fā)生錯(cuò)誤配對(duì)。這一錯(cuò)誤配上的堿基在下一次DNA復(fù)制時(shí)卻能按正常規(guī)律配對(duì)，于是一對(duì)錯(cuò)誤的堿基置換了原來(lái)的堿基對(duì)，亦即最終產(chǎn)生堿基對(duì)置換或簡(jiǎn)稱(chēng)堿基置換。原來(lái)的嘌呤被另一種嘌呤置換，或原來(lái)的嘧啶被另一種嘧啶置換，都稱(chēng)為轉(zhuǎn)換；原來(lái)的的嘌呤被任一種嘧啶置換，或與此相反，原來(lái)的嘧啶被任一種嘌呤置換，都稱(chēng)為顛換。無(wú)論是轉(zhuǎn)換還是顛換都只涉及一對(duì)堿基，是名符其實(shí)的點(diǎn)突變，其結(jié)果可造成一個(gè)三聯(lián)體密碼子的改變；此時(shí)可能出現(xiàn)同義密碼、錯(cuò)義密碼或終止密碼。由于錯(cuò)義密碼所編碼的氨基酸不同，于是基因表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)有可能受到某種影響，終止密碼可使所編碼的蛋白質(zhì)肽鏈縮短。

(二)移碼

移碼是DNA中增加或減少了一對(duì)或幾對(duì)不等于3的倍數(shù)的堿基對(duì)所造成的突變。由于堿基序列所形成的一系列三聯(lián)體密碼子相互間并無(wú)標(biāo)點(diǎn)符號(hào)，于是從受損位點(diǎn)開(kāi)始密碼子的閱讀框架完全改變，故稱(chēng)移碼。其結(jié)果是：從原始損傷的密碼子開(kāi)始一直到信息末端的氨基酸序列完全改變；也可能使讀碼框架改變其中某一點(diǎn)形成無(wú)義密碼(終止密碼），于是產(chǎn)生截短了的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，及一個(gè)無(wú)功能的肽鏈片段。移碼較易成為致死性突變。

UAG、UAA、UGA(三)大段損傷

大段損傷是DNA鏈大段缺失或插入。這種損傷有時(shí)可跨越兩個(gè)或數(shù)個(gè)基因，涉及數(shù)以千計(jì)的核苷酸。缺失的片段遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于光學(xué)顯微鏡可觀察到的染色體缺失，故稱(chēng)小缺失。它往往是DNA斷裂的結(jié)果，有時(shí)在減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)誤聯(lián)合和不等交換也可造成小缺失。小缺失通?？梢鹜蛔儭Ｐ∪笔в坞x出來(lái)的DNA片段可整合到另一染色體某一位置而形成插入。每次整合都可能發(fā)生突變。小缺失的片段也可倒轉(zhuǎn)后仍插入原來(lái)位置而造成基因重排。

二、染色體畸變?nèi)旧w畸變包括染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常。

(一)染色體結(jié)構(gòu)異常染色體結(jié)構(gòu)異常是染色體或染色體單體受損而發(fā)生斷裂，且斷端不發(fā)生重接或雖重接卻不在原處。能使染色體或染色單體發(fā)生斷裂的物質(zhì)稱(chēng)為斷裂劑(clastogen)，這種作用的發(fā)生及其過(guò)程稱(chēng)為斷裂作用。斷裂作用的關(guān)鍵是誘發(fā)DNA鏈斷裂。大多數(shù)化學(xué)斷裂劑像紫外線一樣，只能誘發(fā)DNA單鏈斷裂，故稱(chēng)為擬紫外線斷裂劑。這種斷裂需要經(jīng)過(guò)S期的復(fù)制，才能在中期相細(xì)胞出現(xiàn)染色單體型畸變（chromosome–typeaberration)

無(wú)論如何，擬紫外線斷裂劑的作用必須經(jīng)過(guò)一個(gè)S期的作用之后才呈現(xiàn)出來(lái)。所以又稱(chēng)為S期依賴(lài)斷裂劑（S-dependentclastogen）。DNA復(fù)制少數(shù)化學(xué)斷裂劑與電離輻射一樣，可誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，故稱(chēng)為擬放射性斷裂劑。所以如在S期已發(fā)生復(fù)制之后或G2期發(fā)生作用，在中期相呈現(xiàn)染色單體型畸變，而在G0期和G1期作用，則經(jīng)S期復(fù)制，就會(huì)在中期相呈染色體型畸變。由于擬放射性斷裂劑能在細(xì)胞周期任一時(shí)期發(fā)生作用,并在立即到來(lái)的中期相觀察到染色體結(jié)構(gòu)改變，故稱(chēng)S期不依賴(lài)斷裂劑。在任何情況下見(jiàn)到的染色單體型畸變都將在下一次細(xì)胞分裂時(shí)衍生為染色體型畸變。

DNA復(fù)制由于擬放射性斷裂劑能在細(xì)胞周期任一時(shí)期發(fā)生作用,并在立即到來(lái)的中期相觀察到染色體結(jié)構(gòu)改變，故稱(chēng)S期不依賴(lài)斷裂劑。1.染色體畸變

是染色體中兩條染色單體同一位點(diǎn)受損后所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)異常，可分為下列類(lèi)型：(1)裂隙和斷裂(gapandbreake)：是指染色體上狹窄的非染色帶。過(guò)去以帶寬超過(guò)染色單體寬度為斷裂，不超過(guò)者為裂隙。此種線狀連接多排列成直線或圓滑弧形。無(wú)線狀連接者為斷裂(break)，保持線狀連接者為裂隙（gap)。一般認(rèn)為裂隙屬于非染色質(zhì)損傷。裂隙一向不計(jì)入畸變范圍。(2)無(wú)著絲粒斷片和缺失

(acentricfragmentanddeletion)：一個(gè)染色體發(fā)生一次或多次斷裂而不重接，并且這些已斷裂的節(jié)段遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)無(wú)著絲粒斷片和一個(gè)缺失了部分染色質(zhì)并帶有著絲粒的異常染色體，后者稱(chēng)為帶著絲粒斷片。常將無(wú)著絲粒斷片簡(jiǎn)稱(chēng)為斷片(acentricfragment)，在下一次細(xì)胞分裂時(shí)斷片因無(wú)著絲粒，故不能進(jìn)入分裂的核中而滯留在細(xì)胞質(zhì)中，稱(chēng)為微核(micronucleus,MN，1/5-1/20)。如斷片很小，小于染色單體寬度，則稱(chēng)為微小體(minutebody)。缺失的類(lèi)型——末端缺失與中間缺失例如：貓叫綜合征（46，5p-），慢性骨髓性白血?。?6，22q-，也稱(chēng)費(fèi)城染色體，ph）。(3)環(huán)狀染色體(ringchromosome)：

染色體兩臂各發(fā)生一次斷裂，其帶有著絲粒的節(jié)段的兩斷端連接形成一個(gè)環(huán)時(shí)，稱(chēng)為環(huán)狀染色體；如果是一條較長(zhǎng)的無(wú)著絲粒斷片的兩端連接，就形成無(wú)著絲粒環(huán)。(4)倒位(inversion)：當(dāng)某一染色體發(fā)生兩次斷裂后，其中間節(jié)段倒轉(zhuǎn)180再重接，稱(chēng)為倒位。倒位的類(lèi)型——臂內(nèi)倒位與臂間倒位臂內(nèi)倒位：不包括著絲粒區(qū)域的倒位。臂間倒位：包括著絲粒區(qū)域的倒位。(5)插入和重復(fù)(insertionandduplication)：當(dāng)一個(gè)染色體發(fā)生三處斷裂，帶有兩斷端的斷片插入到另一臂的斷裂處或另一染色體的斷裂處重接起來(lái)，稱(chēng)為插入。如此時(shí)有缺失的染色體和有插入的染色體是同源染色體，且分別有一處斷裂發(fā)生于同一位點(diǎn)，則插入將使該染色體連續(xù)出現(xiàn)兩段完全相同的節(jié)段，此時(shí)稱(chēng)為重復(fù)。重復(fù)的類(lèi)型染色體內(nèi)重復(fù)——順向重復(fù)（銜接重復(fù)）、反向重復(fù)（倒位重復(fù)）

1234564567812345665478(6)易位(translocation)：從某個(gè)染色體斷下的節(jié)段接到另一染色體上稱(chēng)為易位。單方易位：兩個(gè)染色體各發(fā)生一處斷裂，僅一個(gè)染色體的節(jié)段連接到另一個(gè)染色體上稱(chēng)為單方易位，又叫不對(duì)稱(chēng)易位相互易位：兩個(gè)染色體各發(fā)生一處斷裂，其節(jié)段相互交換重接形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)重排的染色體稱(chēng)為相互易位，又叫對(duì)稱(chēng)易位。復(fù)雜易位：三個(gè)或三個(gè)以上染色體發(fā)生斷裂，其節(jié)段相互交換重接形成的具有結(jié)構(gòu)重排的染色體稱(chēng)為復(fù)雜易位。

易位的類(lèi)型——平衡易位與不平衡易位相互易位：也稱(chēng)平衡易位，是指兩條非同源染色體互相交換染色體片段的易位。較常見(jiàn)，也研究得較多。單方易位：不平衡易位：也稱(chēng)移位（shift），是指一條染色體的片段轉(zhuǎn)移到另一非同源染色體上的易位。2.染色體單體畸變

指某一位點(diǎn)的損傷只涉及姐妹染色單體中的一條。(1)染色單體裂隙、斷裂和缺失：含義與染色體型畸變的裂隙、斷裂和缺失基本相同，不同的是染色體中一條染色單體的結(jié)構(gòu)改變。染色單體斷片在下一次細(xì)胞分裂中也可滯留于細(xì)胞質(zhì)而成為微核。(2)染色單體交換（chromatidexchange)

是兩條或多條染色單體斷裂后變位重接的結(jié)果。在同一染色體內(nèi)的染色單體交換稱(chēng)為內(nèi)換，在不同染色體之間的染色單體交換稱(chēng)為互換。

(3)姐妹染色單體交換(sisterchromatidexchange,SCE)：

當(dāng)使用差示染色法時(shí)，可見(jiàn)到染色體的兩條姐妹染色單體染色一深一淺。如某一染色體在姐妹染色單體間發(fā)生同源節(jié)段的內(nèi)換，就會(huì)使兩條姐妹染色單體都出現(xiàn)深淺相同的染色，但同源節(jié)段仍然是一深一淺。這種現(xiàn)象稱(chēng)為SCE。1978年ISCN(人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)命名國(guó)際體制)將SCE列入染色單體型畸變的范圍，但其發(fā)生機(jī)理目前傾向于與染色單體斷裂無(wú)關(guān)。原理：半保留復(fù)制

(二)染色體數(shù)目異常

各種生物都有其固定的染色體數(shù)目和核型。以動(dòng)物正常體細(xì)胞染色體數(shù)目2n為標(biāo)準(zhǔn)，染色體數(shù)目異?？赡鼙憩F(xiàn)為整倍性畸變和非整倍性畸變。整倍性畸變可能出現(xiàn)單倍體、三倍體或四倍體。超過(guò)二倍體的整倍性畸變也統(tǒng)稱(chēng)為多倍體。非整倍性畸變系指比二倍體多或少一條或多條染色體。例如：缺體是指缺少一對(duì)同源染色體，單體或三體系指某一對(duì)同源染色體相應(yīng)地少或多一個(gè)，四體則指其比同源染色體多一對(duì)染色體；于是在染色體數(shù)目上相應(yīng)為2n-2、2n-1，2n+1和2n+2。

第二節(jié)化學(xué)誘變的分子機(jī)理一、直接以DNA為靶的誘變（一）堿基損傷1、堿基類(lèi)似物取代

有些化學(xué)物的結(jié)構(gòu)與堿基非常相似，稱(chēng)堿基類(lèi)似物。它們能在S期中可與天然堿基競(jìng)爭(zhēng)，并取代其位置。例如5－溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）能取代胸腺嘧啶，2－氨基嘌呤(2-AP）能取代鳥(niǎo)嘌呤。

2、烷化劑的影響

烷化劑是對(duì)DNA和蛋白質(zhì)都有強(qiáng)烈烷化作用的物質(zhì)。烷化劑的種類(lèi)很多，最常見(jiàn)的有烷基硫酸酯、N－亞硝基化合物、氮芥和硫芥以及鹵代亞硝基脲等。各類(lèi)烷化劑其分子上的烷基各不相同，因而烷化活性有別，在一般情況下甲基化＞乙基化＞高碳烷基化。目前認(rèn)為最常受到烷化的是鳥(niǎo)嘌呤的N－7位，其次是O－6位。而腺嘌呤的N－1、N－3和N－7也易烷化。目前認(rèn)為鳥(niǎo)嘌呤的N－7位發(fā)生烷化后可導(dǎo)致鳥(niǎo)嘌呤從DNA鏈上脫落，稱(chēng)為脫嘌呤作用。致使在該位點(diǎn)上出現(xiàn)空缺，即堿基缺失，其結(jié)果是移碼突變。即使在復(fù)制時(shí)空缺位上隨機(jī)配上一個(gè)堿基，也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)換型或顛換型堿基置換。3、致突變物改變或破壞堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)

有些化學(xué)物可對(duì)堿基產(chǎn)生氧化作用，從而破壞或改變堿基的結(jié)構(gòu)，有時(shí)還引起鏈斷裂。例如，亞硝酸根能使腺嘌呤和胞嘧啶發(fā)生氧化性脫氨，相應(yīng)變?yōu)榇吸S嘌呤和尿嘧啶。羥胺能使胞嘧啶C－6位的氨基變成羥氨基。這些改變都會(huì)造成轉(zhuǎn)換型堿基置換。但是亞硝酸雖然也能使鳥(niǎo)嘌呤變?yōu)辄S嘌呤，但是由于黃嘌呤的配對(duì)性能與鳥(niǎo)嘌呤一致，故并不發(fā)生堿基置換。61

還有些化學(xué)物質(zhì)可在體內(nèi)形成有機(jī)過(guò)氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡堿等，可間接使嘌呤的化學(xué)結(jié)構(gòu)破壞，容易出現(xiàn)DNA鏈斷裂。

4、平面大分子嵌入DNA鏈`

有些大分子能以靜電吸附形式嵌入DNA單鏈的堿基之間或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰多核苷酸鏈之間，稱(chēng)為嵌入劑，它們多數(shù)是多環(huán)的平面結(jié)構(gòu)，特別是三環(huán)結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度為6.8102nm，恰好是DNA單鏈相鄰堿基距離的兩倍。如果嵌入到新合成的互補(bǔ)鏈上，就會(huì)使之缺失一個(gè)堿基；如果嵌入到模板鏈的兩堿基之間，就會(huì)使互補(bǔ)鏈插入一個(gè)堿基。無(wú)論多或少一個(gè)堿基都造成移碼突變。

（二）DNA鏈損傷

1．二聚體的形成

當(dāng)細(xì)胞或機(jī)體受到紫外線刺激，會(huì)使DNA發(fā)生化學(xué)變化，其主要產(chǎn)生環(huán)丁烷嘧啶二聚體。這些損傷可阻止DNA的復(fù)制，并引起細(xì)胞死亡。紫外線和許多化學(xué)物致突變性表明突變作用作為細(xì)胞過(guò)程的復(fù)雜性，不僅涉及已改變堿基的配對(duì)特異性，而且還涉及與復(fù)制和修復(fù)有關(guān)的細(xì)胞機(jī)制相互作用。輻射的致突變機(jī)制有：使連接A-T、C-G之間的氫鍵斷裂；DNA分子的一個(gè)或兩個(gè)鍵中的糖—磷酸基之間斷裂；

DNA同一條鏈上，相鄰的嘧啶形成二聚體；水的電離，可產(chǎn)生自由基，也可引起突變。此外，輻射可形成DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂，從而引起缺失、倒位、易位，甚至堿基破壞，情況比較復(fù)雜。2．DNA加合物形成DNAadducts

它是活性化學(xué)物與細(xì)胞大分子之間通過(guò)共價(jià)鍵形成的穩(wěn)定復(fù)合物，通常很難用一般的化學(xué)或生物學(xué)方法使其解離。例如，烷化的DNA加合物，O6—甲基脫氧鳥(niǎo)苷，可引起堿基置換，N—乙?；?N-a—乙酰氨基芴的C8—鳥(niǎo)嘌呤加合物引起移碼突變。此外，DNA加合物的形成可活化癌基因，影響調(diào)節(jié)基因和抑癌基因的表達(dá)。3．DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物(DNA-proteincrosslinks，DPC)形成它是致突變物對(duì)生物大分子物質(zhì)的一種重要的遺傳損害，也是一種穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合物。已知許多外來(lái)化合物如烷化劑、苯并(a)芘、砷化合物、醛類(lèi)化合物如甲醛及一些重金屬如鎳、鉻等，均可引起DNA-蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，雖然不同的化學(xué)物引起DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)物的交聯(lián)有所不同，但DPC一旦形成，必將對(duì)DNA構(gòu)象與功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。其原因是核蛋白作為維持DNA構(gòu)象的重要成分，并參與DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，故核蛋白與DNA交聯(lián)形成DPC，DPC出現(xiàn)將造成突變。

二、不以DNA為靶的間接誘變化學(xué)物的間接誘變可能是通過(guò)對(duì)紡錘體作用或干擾與DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶系統(tǒng)。(一)紡錘體抑制一些化學(xué)物能作用于紡錘體，中心?；蚱渌藘?nèi)細(xì)胞器，從而干擾有絲分裂過(guò)程。誘發(fā)這種作用的物質(zhì)稱(chēng)為有絲分裂毒物，又稱(chēng)干擾劑。無(wú)論紡錘體是部份或完全受抑制，都稱(chēng)為有絲分裂效應(yīng)。完全抑制時(shí)細(xì)胞分裂完全抑制，細(xì)胞停滯于分裂中期。秋水仙堿是典型的引起細(xì)胞分裂完全抑制的物質(zhì)，因此這種效應(yīng)又稱(chēng)秋水仙堿效應(yīng)。有些干擾劑僅使細(xì)胞群體的有絲分裂數(shù)減少，被稱(chēng)之為抗有絲分裂劑。干擾劑不直接作用于遺傳物質(zhì)，故嚴(yán)格說(shuō)來(lái)并非真正的致突變物，但它同樣可誘發(fā)突變，特別是誘發(fā)與遺傳性疾病有密切關(guān)系的非整倍體，故引起密切注意，并作為致突變物的一個(gè)特殊類(lèi)型來(lái)看待。

(二)對(duì)酶促過(guò)程的作用

對(duì)DNA合成和復(fù)制有關(guān)的酶系統(tǒng)作用也可間接影響遺傳物質(zhì)。例如，一些氨基酸類(lèi)似物可使與DNA合成有關(guān)的酶系統(tǒng)遭受破壞從而誘發(fā)突變。再有，鈹和錳除可直接與DNA相互作用外，還可與酶促防錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)相作用而產(chǎn)生突變。

第三節(jié)突變后果一、體細(xì)胞突變的后果體細(xì)胞突變的后果中最受注意的是致癌問(wèn)題，其次，胚胎體細(xì)胞突變可能導(dǎo)致畸胎，當(dāng)然畸胎的發(fā)生還與親代生殖細(xì)胞突變有關(guān)。據(jù)報(bào)道人類(lèi)妊娠最初3個(gè)月自然流產(chǎn)中有60%有染色體畸變，在一定程度上,這是致突變物透過(guò)胎盤(pán)作用于胚胎體細(xì)胞所致，而不完全是親代的生殖細(xì)胞突變的后果。

二、生殖細(xì)胞突變的后果

如果突變發(fā)生在生殖細(xì)胞，無(wú)論是在其發(fā)育周期的任何階段，都存在對(duì)下一代影響的可能性，其影響可分為致死性和非致死性兩類(lèi)。致死性影響可能是顯性致死或隱性致死。顯性致死即突變配子與正常配子結(jié)合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。隱性致死需要純合子或半合子才能出現(xiàn)死亡效應(yīng)。如果生殖細(xì)胞突變?yōu)榉侵滤佬?，則可能出現(xiàn)顯性或隱性遺傳性疾病，包括先天性畸形。在遺傳性疾病頻率與種類(lèi)增多的同時(shí)，突變的基因，以及染色體損傷，將使基因庫(kù)（genepool)的遺傳負(fù)荷（geneticload)增加?；驇?kù)是指一個(gè)物種的群體中在生殖細(xì)胞內(nèi)具有并能傳給下一代的全部基因的總和。遺傳負(fù)荷是指一個(gè)物種的群體中每一個(gè)個(gè)體攜帶的可以遺傳給下一代的有害基因的平均水平。第五節(jié)化學(xué)致突變物的檢測(cè)致突變作用的檢測(cè)一般通過(guò)致突變?cè)囼?yàn)來(lái)檢測(cè)。目前已有方法200多種，但重要的有約20種。

一、觀察項(xiàng)目的選擇1．觀察效應(yīng)終點(diǎn)的類(lèi)型

基因突變和染色體畸變的檢測(cè)可直接反映化學(xué)毒物的致突變性，是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物致突變性唯一可靠的方法。還有許多試驗(yàn)所觀察到的現(xiàn)象并不反映基因突變、染色體畸變和染色體分離異常，而僅反映致突變過(guò)程中發(fā)生的其他事件。因此，將試驗(yàn)觀察到的現(xiàn)象所反映的各種事件統(tǒng)稱(chēng)為:遺傳學(xué)終點(diǎn)(geneticendpoint)。

國(guó)際環(huán)境致突變物致癌物防護(hù)委員會(huì)于1983年提出致突變?cè)囼?yàn)的遺傳學(xué)終點(diǎn)分為5類(lèi)：①DNA完整性的改變(形成加合物、斷裂、交聯(lián))；②DNA重排或交換；③DNA堿基序列改變；④染色體完整性改變；⑤染色體分離改變。其中③實(shí)際上指基因突變，④⑤指染色體畸變。下表是較常見(jiàn)的致突變?cè)囼?yàn)所反映的遺傳學(xué)終點(diǎn)。試驗(yàn)DNA完整性改變DNA交換或重排DNA堿基序列改變?nèi)旧w完整性改變?nèi)旧w分離改變?nèi)旧w分析1

微核12顯性致死12可遺傳易位12細(xì)菌回復(fù)突變1哺乳動(dòng)物細(xì)胞正向突變1果蠅伴性隱性致死突變1小鼠特異座位實(shí)驗(yàn)1酵母重組12SCE21細(xì)菌DNA修復(fù)12．成套的觀察項(xiàng)目

（1）概念由于一種致突變?cè)囼?yàn)通常只能反映一個(gè)或兩個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)。實(shí)際工作中，沒(méi)有一種致突變?cè)囼?yàn)?zāi)芎w所有的遺傳學(xué)終點(diǎn)，故需用一組試驗(yàn)配套進(jìn)行檢測(cè)。用何種方法來(lái)評(píng)價(jià)化學(xué)毒物，主要取決于測(cè)試方案制定者的需要。例如，我國(guó)對(duì)食品、農(nóng)藥化學(xué)品和工業(yè)毒物分別提出了相應(yīng)的遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序。從遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)中，包括基因突變、斷裂作用、重組作用、非整倍體或多倍體的測(cè)定試驗(yàn)，受試化合物在任何一種試驗(yàn)中出現(xiàn)可重復(fù)的陽(yáng)性結(jié)果，即可認(rèn)為是遺傳毒物。（2）遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序

通常為一組體內(nèi)、外遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)。因?yàn)椋孩倩瘜W(xué)毒物的種類(lèi)和結(jié)構(gòu)多種多樣，其致突變的機(jī)制不盡相同，作用的靶細(xì)胞也不一樣，有的是體細(xì)胞，或生殖細(xì)胞，或兩者兼而有之。故在成套觀察項(xiàng)目中既要用體細(xì)胞檢測(cè)又要用生殖細(xì)胞；除了從分子水平還要從細(xì)胞水平來(lái)檢測(cè)化學(xué)毒物的遺傳毒性。②致突變物中僅少數(shù)具有直接致突變作用，如烷化劑；大多數(shù)為間接致突變作用，即需要在體內(nèi)代謝活化后，才具有致突變作用。體內(nèi)試驗(yàn)具有完整的活化系統(tǒng)，而體外試驗(yàn)則通過(guò)加入模擬代謝系統(tǒng)，如S9來(lái)彌補(bǔ)缺乏活化系統(tǒng)的不足。這是體內(nèi)與體外試驗(yàn)的主要差別。在選擇體內(nèi)、體外試驗(yàn)時(shí)，還需要對(duì)其方方面面深入了解。③化學(xué)毒物的致突變性有強(qiáng)，也有弱；有的在某一檢測(cè)系統(tǒng)中是強(qiáng)致突變物，而在另一系統(tǒng)中可能是弱的致突變物。對(duì)于弱致突變物在某些系統(tǒng)中比較容易漏檢，即出現(xiàn)假陰性。所以，對(duì)每一化學(xué)毒物都需要一組試驗(yàn)或成套試驗(yàn)，來(lái)評(píng)價(jià)其遺傳毒性。（3）遺傳毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)選擇原則

關(guān)于遺傳毒理學(xué)成套觀察項(xiàng)目中哪些試驗(yàn)可入選的原則有：①已知遺傳毒性主要有基因突變遺傳學(xué)終點(diǎn)。依照上表，選擇細(xì)胞回復(fù)突變?cè)囼?yàn)、微核試驗(yàn)、細(xì)菌DNA修復(fù)試驗(yàn)和SCE等四種致突變?cè)囼?yàn)，即可滿足要求。所以，選擇的遺傳毒性試驗(yàn)原則上應(yīng)包括5種類(lèi)型的遺傳學(xué)終點(diǎn)。②通常的實(shí)驗(yàn)材料有病毒、細(xì)菌、真菌、培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞、植物、昆蟲(chóng)及哺乳動(dòng)物等。一般認(rèn)為配套實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括多種進(jìn)化程度不同的物種，如原核細(xì)胞、低等和高等真核細(xì)胞，這樣觀察化學(xué)毒物在不同系統(tǒng)發(fā)育的多種生物體的致突變性，更具說(shuō)服力。③體內(nèi)試驗(yàn)與體外試驗(yàn)配合。體內(nèi)試驗(yàn)接近實(shí)際情況，但由于毒性動(dòng)力學(xué)或其他原因，有時(shí)會(huì)漏檢致突變物。且在時(shí)間、經(jīng)費(fèi)、人力及物力均比體外試驗(yàn)花費(fèi)大。而體外試驗(yàn)簡(jiǎn)便易行，通常檢出率大大優(yōu)于體內(nèi)試驗(yàn)。它的明顯不是在于生物轉(zhuǎn)化及解毒等方面與體內(nèi)不同。故在配套試驗(yàn)中，依據(jù)試驗(yàn)?zāi)康?，選擇體內(nèi)和體外試驗(yàn)，取長(zhǎng)補(bǔ)短，綜合考慮。

目前，已確認(rèn)的哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞致突變物都在體細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)中得到陽(yáng)性結(jié)果。一般認(rèn)為，當(dāng)體內(nèi)體細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果，并有生殖細(xì)胞接觸證據(jù)時(shí)，再進(jìn)行哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)。通常，對(duì)于一種受試物應(yīng)當(dāng)先用原核細(xì)胞或體細(xì)胞的體外試驗(yàn)按遺傳學(xué)終點(diǎn)合理配套進(jìn)行試驗(yàn)，并對(duì)有陽(yáng)性結(jié)果的遺傳學(xué)終點(diǎn)驗(yàn)證其在體內(nèi)的真實(shí)性，必要時(shí)再選用生殖細(xì)胞致突變?cè)囼?yàn)進(jìn)行遺傳危害的評(píng)價(jià)。

二、致突變?cè)囼?yàn)(一)鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

又稱(chēng)Ames試驗(yàn)，檢測(cè)受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株(his-)回復(fù)突變成野生型(his+)的能力。試驗(yàn)菌株都有組氨酸突變(his-)，不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營(yíng)養(yǎng)平皿上不能生長(zhǎng)，回復(fù)突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營(yíng)養(yǎng)平皿上生長(zhǎng)成可見(jiàn)菌落。計(jì)數(shù)最低營(yíng)養(yǎng)平皿上的回變菌落數(shù)來(lái)判定受試物是否有致突變性。我國(guó)普遍采用的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)菌株有四種：TA97和TA98檢測(cè)移碼突變、TA100檢測(cè)鹼基置換突變、TA102對(duì)醛、過(guò)氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感。這四個(gè)試驗(yàn)菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。

1、TA系列測(cè)試菌株帶有的突變（1）深粗糙型突變(rfa)深糙粗型突變導(dǎo)致細(xì)菌表面的脂多糖屏障部份喪失，增加了對(duì)不能通過(guò)正常細(xì)胞壁的大分子的通透性。（2）切除修復(fù)基因uvrB缺失切除修復(fù)基因缺失使細(xì)菌對(duì)許多致突變物易感性顯著提高。（3）抗藥因子即R因子，是質(zhì)粒的一種（PKM101質(zhì)粒，使細(xì)胞具有抗氨芐青霉素的能力）。這里的作用：

PKM101質(zhì)?？梢源偈辜?xì)胞通過(guò)易誤修復(fù)來(lái)處理DNA損傷，于是使化學(xué)誘變能力提高。（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)

通過(guò)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究，已發(fā)現(xiàn)有幾十個(gè)基因座(locus)可出現(xiàn)各種突變類(lèi)型的突變體(mutant)，常利用抗藥性的出現(xiàn)作為突變?cè)囼?yàn)的觀察終點(diǎn)。由于抗藥性是對(duì)正?；蜃T發(fā)的突變性狀，故稱(chēng)為正向突變?cè)囼?yàn)(forward

mutationrest)。

最常用的基因座有三：

1、hprt基因座

HPRT(即次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶)的編碼基因。hprt位于人和嚙齒動(dòng)物的X染色體。由于X染色體在雌性有一條處于失活狀態(tài)，所以hprt基因座對(duì)于雄性是在結(jié)構(gòu)上為單倍體狀態(tài)，而對(duì)于雌性則是在功能上處于單倍體狀態(tài)。

HPRT催化次黃嘌吟和鳥(niǎo)嘌呤與磷酸核糖焦磷酸反應(yīng)，生成相應(yīng)的核苷-5-單磷酸(NMP)。這是一條生成NMP的補(bǔ)充途徑。如果存在6-巰基嘌呤(MP)、6-硫代鳥(niǎo)嘌嶺(TG)、8-氮鳥(niǎo)嘌呤(AG)等堿基類(lèi)似物，則以這些物質(zhì)為底物可生成相應(yīng)的NMP。NMP參入DNA中將導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此如受試物使hprt基因失活(hprt-)，細(xì)胞中的HPRT活性將大為下降，于是能在足以導(dǎo)致HPRT活性水平正常的細(xì)(hprt+細(xì)胞)死亡的嘌呤類(lèi)似物存在下生長(zhǎng)。即：抑制了生成NMP的補(bǔ)充途徑。合成NMP的補(bǔ)充途徑。一、從頭和成途徑利用磷酸核糖、氨基酸等簡(jiǎn)單原料，經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，合成嘌呤核甘酸的途徑。合成部位主要在肝臟。從頭合成途徑的主要特點(diǎn)是在磷酸核糖分子上逐步合成的。二、合成NMP的補(bǔ)充途徑利用體內(nèi)游離的嘌呤和嘌呤核苷，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的反應(yīng)生成嘌呤核甘酸的過(guò)程。參與此途徑的酶：腺嘌呤核糖核酸轉(zhuǎn)移酶APRT次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶HPRT腺苷激酶AdenosineKinase2、tk基因座

該基因座位于常染色體，其基因產(chǎn)物為胸苷激酶(TK)。該酶的底物是胸苷。野生型細(xì)胞(tk+)可酶促胸苷合成胸苷酸，并進(jìn)一步生成DNA復(fù)制時(shí)必需的胸苷三磷酸。當(dāng)存在堿基類(lèi)似物(如Brdu和三氟胸苷等)時(shí)，由于產(chǎn)生異常的核苷酸而致細(xì)胞死亡。在受試物存在下，如細(xì)胞能對(duì)嘧啶類(lèi)似物有抗性不致死亡，就說(shuō)明該受試物誘發(fā)了tk基因座突變。3、ouar基因座

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的質(zhì)膜上存在著Na+／K+

ATPase。當(dāng)該酶的a-亞單位與烏本苷(ouabain，即毒毛旋花子甙G)結(jié)合，該酶即失活，從而導(dǎo)致死亡。與烏本苷感受性有關(guān)的基因存在于常染色體，如發(fā)生突變，即出現(xiàn)對(duì)烏本苷抗性，此時(shí)Na+／K+

ATPase的a-亞單位與烏本苷的結(jié)合力降低，從而導(dǎo)致細(xì)胞存活。

ouar突變體的表型是顯性的，較穩(wěn)定。

以上幾個(gè)基因座最常用的是hprt，因其有關(guān)結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因發(fā)生堿基置換。移碼、小缺失，甚至X染色體重排，都可引起嘌吟類(lèi)似物抗性。應(yīng)用tk基因座的試驗(yàn)也能檢出堿基置換和移碼等損傷。但是ouar僅能檢出堿基置換，因?yàn)楫?dāng)發(fā)生移碼或其他更嚴(yán)重的損傷時(shí)，基因轉(zhuǎn)錄提前終止，于是其正常產(chǎn)物將部分或全部消失。但是烏本苷抗性的表達(dá)需要該蛋白質(zhì)的質(zhì)量完整，因此堿基置換以外的嚴(yán)重?fù)p傷都將導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而不是突變體細(xì)胞的出現(xiàn)。哺乳動(dòng)物體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變?cè)囼?yàn)常用的測(cè)試系統(tǒng)有小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞，中國(guó)倉(cāng)鼠肺V79細(xì)胞和卵巢CHO細(xì)胞的三個(gè)基因位點(diǎn)的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)、胸苷激酶(TK)及Na+／K+ATP酶(OUA)位點(diǎn)。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點(diǎn)突變可用于上述三種細(xì)胞，OUA位點(diǎn)突變僅適用于CHO細(xì)胞，HGRPT和TK可分別使6－硫代鳥(niǎo)嘌呤(6－TG)轉(zhuǎn)移上磷酸核糖及使5－溴脫氧尿苷磷?；鼈兊拇x產(chǎn)物可摻入DNA引起細(xì)胞死亡，因此正常細(xì)胞在含有這些鹼基類(lèi)似物的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，在致突變物作用下此兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變的細(xì)胞對(duì)這些鹼基類(lèi)似物具有抗藥性，可以增殖成為克隆(細(xì)胞集落)。Na+/K+ATP酶是細(xì)胞膜上的Na+/K泵，烏本苷可抑制此酶活性引起細(xì)胞死亡，當(dāng)致突變物引起該位點(diǎn)突變后Na+/K+ATP酶對(duì)烏本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對(duì)培養(yǎng)基中的烏本苷產(chǎn)生抗藥性，并可增殖為克隆。

6#2011-10-13（三）微核試驗(yàn)

微核(micronucleus)與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個(gè)染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨(dú)形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱(chēng)微核。在細(xì)胞質(zhì)中微核來(lái)源有二：斷片或無(wú)著絲粒染色體在細(xì)胞分裂后期不能定向移動(dòng)，而遺留在細(xì)胞質(zhì)中；有絲分裂毒物的作用使個(gè)別染色體或帶著絲粒的染色體環(huán)和斷片在細(xì)胞分裂后期被留在細(xì)胞質(zhì)中。微核試驗(yàn)(micronucleustest，MNT)是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗(yàn)。其主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑。微核試驗(yàn)的靈敏度與細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)基本相同，但它觀察技術(shù)簡(jiǎn)易而省時(shí)，故發(fā)展迅速。

觀察嗜多染紅細(xì)胞的微核。1、嗜多染紅細(xì)胞呈灰藍(lán)色，成熟紅細(xì)胞呈粉紅色。典型的微核多為單個(gè)的、圓形、邊緣光滑整齊，嗜色性與核質(zhì)一致，呈紫紅色或藍(lán)紫色，直徑通常為紅細(xì)胞的1/20～1/5。2、每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，微核率以千分率表示。3、觀察嗜多染紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞（PCE/RBC），可作為細(xì)胞毒性指標(biāo)之一。4、一般計(jì)數(shù)200個(gè)嗜多染紅細(xì)胞。受試物組未成熟紅細(xì)胞占紅細(xì)胞總數(shù)的比例不應(yīng)少于對(duì)照組的20％.。1、PCE（polychromaticerythrocyte）嗜多染紅細(xì)胞，2、NCE（normochromaticerythrocyte）指正染紅細(xì)胞，3、RBC（redbloodcell）指紅細(xì)胞，包括PCE和NCE

PCE／NCE為評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性的指標(biāo)，代表未成熟紅細(xì)胞與成熟紅細(xì)胞的比值。微核試驗(yàn)中計(jì)算PCE／NCE比值時(shí)，每只動(dòng)物應(yīng)至少計(jì)數(shù)200個(gè)紅細(xì)胞（即：PCE+NCE≥200個(gè)）。PCE／NCE與PCE／RBC（未成熟紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比值）生物學(xué)意義相同，所以也常用PCE／RBC（％）表示。微核試驗(yàn)中未成熟紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的比值不應(yīng)少于對(duì)照組的20％。（討論：為什么？細(xì)胞分裂）

PCEPCE／NCEPCE／RBC目前對(duì)微核試驗(yàn)已有較大的改進(jìn)：①體外微核試驗(yàn)常用細(xì)胞有中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(CHL)，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)及中國(guó)倉(cāng)鼠成纖維細(xì)胞(V79)等，體外試驗(yàn)比體內(nèi)試驗(yàn)易于操作和控制受試物濃度。②周?chē)⒑嗽囼?yàn)使其有可能成為在人群中觀察化學(xué)毒物遺傳毒性的一種手段。③雙核細(xì)胞法以提高微核的靈敏度。④免疫熒光染色法和熒光原位雜交法不僅可提高其靈敏度，還可判斷微核是來(lái)源于斷片還是染色體。(四)染色體畸變?cè)囼?yàn)1.染色體分析觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱(chēng)為染色體分析。在國(guó)外常稱(chēng)為細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗(yàn)，但這一名稱(chēng)有時(shí)廣義地包括微核試驗(yàn)和SCE試驗(yàn)，因?yàn)檫@兩個(gè)試驗(yàn)同樣也是在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色體的改變。

對(duì)于結(jié)構(gòu)畸變，一般只觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環(huán)、粉碎、雙或多著絲粒染色體和射體。對(duì)于缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析。即染色體攝影拍片后，再排列進(jìn)行細(xì)微觀察或用電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象分析。對(duì)于相互易位，除生殖細(xì)胞非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重復(fù)等均需顯帶染色才能發(fā)現(xiàn)。

對(duì)于數(shù)目畸變，需在染毒后經(jīng)過(guò)一次有絲分裂才能發(fā)現(xiàn)。但是經(jīng)過(guò)一次有絲分裂后，一些結(jié)構(gòu)畸變可能因遺傳物質(zhì)的丟失而致細(xì)胞死亡，因此不能發(fā)現(xiàn)。所以應(yīng)安排多次收獲時(shí)間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收獲時(shí)間的安排還應(yīng)考慮外來(lái)化合物可能在細(xì)胞周期的不同時(shí)期產(chǎn)生作用，以及延長(zhǎng)細(xì)胞周期的作用。

2.染色體畸變實(shí)驗(yàn)方法

（1）原理

體細(xì)胞的染色體分析可作體內(nèi)或體外試驗(yàn)，體內(nèi)試驗(yàn)多觀察骨髓細(xì)胞，體外試驗(yàn)常用中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞(CHL)，以及中國(guó)倉(cāng)鼠卵細(xì)胞(CHO)和V79等細(xì)胞系。染色體是細(xì)胞核中具有特殊結(jié)構(gòu)和遺傳功能的小體，當(dāng)化學(xué)物質(zhì)作用于細(xì)胞周期G1期和S期時(shí)，誘發(fā)染色體型畸變，而作用于G2期時(shí)側(cè)誘發(fā)染色體單體型畸變。給試驗(yàn)的大、小白鼠腹腔注入秋水仙素（處死動(dòng)物前2～4h按4mg/kg體重腹腔注入秋水仙素），抑制細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成，以便增加中期分裂相細(xì)胞的比例，并使染色體絲縮短、分散，輪廓清晰。在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目和形態(tài)。

（2）方法大鼠斷頭處死、小鼠頸椎脫臼。取股骨，去附著的肌肉，剪去兩端骨髓，用帶針頭的注射器吸取2～4mL2．2％檸檬酸鈉溶液，將骨髓洗入10mL離心管中，反復(fù)沖洗數(shù)次，然后以1000～1500r／min離心10min，棄去上清液。

低滲處理：

離心后的沉淀物加入4mL0．075mo1／L氯化鉀溶液，混勻后在37℃水浴或恒溫箱中放置10～20min，再以1000～1500r/min離心，棄去上清液。

固定：

將新配制甲醇、冰乙酸固定液4mL沿管壁加入樣品中，10～15min后，用吸管將細(xì)胞團(tuán)塊打碎繼續(xù)固定10～15min，以1000r/mIn離心10min棄去上清液，再加固定液4mL靜置20min后離心，棄上清液，用吸管混勻制成0．5～1．0mL細(xì)胞懸液。

制片：

先將洗凈的載玻片保存于冰水中備用。載玻片，傾斜30°放置，立即吸取細(xì)胞懸液在玻片的1/3處滴3滴，輕吹細(xì)胞懸液：擴(kuò)散平鋪于玻片上。每個(gè)樣品制2～3張玻片，空氣中自然干燥。

染片：

臨用時(shí)取Giemsa儲(chǔ)備液1mL加磷酸緩沖液10mL，置染色缸中，將涂片浸于染液中染色15min左右，取出玻片用水沖洗，空氣中自然干燥。觀察：每只動(dòng)物分析100個(gè)中期相細(xì)胞，每個(gè)劑量組不少于1000個(gè)中期相細(xì)胞。觀察項(xiàng)目為染色體…數(shù)目和結(jié)構(gòu)改變，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用x2檢驗(yàn)。染色體數(shù)目的改變非整倍體：亞二倍體或超二倍體。多倍體：染色體成倍增加。內(nèi)復(fù)制：包膜內(nèi)的特殊形式的多倍化現(xiàn)象。染色體結(jié)構(gòu)的改變斷裂：損傷長(zhǎng)度大于染色體的寬度。微小體；較斷片小而呈圓形。有著絲點(diǎn)環(huán)：帶有著絲點(diǎn)部分，兩端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)并伴有一雙無(wú)著絲點(diǎn)斷片。無(wú)著絲點(diǎn)環(huán)：成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。雙微小體：成對(duì)的染色質(zhì)小體。裂隙：損傷的長(zhǎng)度小于染色單體的寬度。非特定性型變化：如粉碎化、著絲點(diǎn)細(xì)長(zhǎng)化、粘著等。環(huán)狀四價(jià)體鏈狀六價(jià)體和斷片(五)姐妹染色單體交換(SCE)試驗(yàn)

SCE是染色體同源座位上DNA復(fù)制產(chǎn)物的相互交換，SCE可能與DNA的斷裂和重接有關(guān)，提示DNA損傷。SCE試驗(yàn)可分為體外試驗(yàn)、體內(nèi)試驗(yàn)和體內(nèi)、體外結(jié)合試驗(yàn)。體外SCE試驗(yàn)可采用貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，如CHO、V79、CHL等，也可用懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，如人外周血淋巴細(xì)胞。姐妹染色單體交換試驗(yàn)的原理：細(xì)胞在含5-溴脫氧尿苷(BrdU)的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)兩個(gè)周期。經(jīng)過(guò)兩個(gè)分裂周期后，兩條染色單體，其中一條DNA鏈的雙股內(nèi)的胸腺嘧啶核苷均被BrdU取代，另一條只有一股被取代。此時(shí)，用染色劑如吉姆薩和光處理，使雙股含BrdU的染色單體著色淺淡，而單股含BrdU的染色單體著色深。在普通光學(xué)顯微鏡下，可清晰分辨出交換的染色單體，計(jì)數(shù)SCE數(shù)。借此判斷受試物對(duì)DNA是否有損傷作用。對(duì)于分裂的細(xì)胞，如將5溴脫氧尿嘧啶核苷(5—BrdU)加入合成DNA的原料中，許多致突變物可誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞和整體哺乳動(dòng)物的SCE。盡管SCE測(cè)定方便、有效，但有關(guān)SCE的結(jié)果較染色體分析的結(jié)果可信度稍差些。主要是因?yàn)椴荒芸隙⊿CE形成的機(jī)制，形成過(guò)程是否涉及DNA損傷或DNA合成的紊亂。

（六)程序外DNA合成試驗(yàn)

基本方法是測(cè)定S期以外3H-胸苷摻入胞核的量，這一摻入量可反映DNA損傷后修復(fù)合成的量。由于此種合成發(fā)生在DNA正常復(fù)制合成主要時(shí)期以外，故稱(chēng)為程序外DNA合成(unscheduleDNAsynthesis

UDS)試驗(yàn)或DNA修復(fù)合成試驗(yàn)。一般使用人淋巴細(xì)胞或嚙齒動(dòng)物肝細(xì)胞等不處于正在增殖的細(xì)胞較為方便，否則就需要人為地將細(xì)胞阻斷于G1期，使增殖同步化。然后在藥物的抑制下使殘存的半保留DNA復(fù)制降低到最低限度，才能避免摻入水平很高的半保留復(fù)制對(duì)摻入水平很低的程序外DNA合成的觀察。

（七）果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)1、原理

果蠅伴性隱性致死試驗(yàn)(sex-linkedrecessivelethaltest，SLRL)是利用隱性基因在伴性遺傳中具有交叉遺傳特征，即雄蠅的X染色體傳給F1代雌蠅，又通過(guò)F1代傳給F2代雄蠅。選擇黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，給予雄蠅受試物，如雄蠅的X染色體有突變，傳給F1代雌蠅，再通過(guò)F1代雌蠅傳給F2代雄蠅，使位于X染色體上的隱性基因在半合型雄蠅表現(xiàn)出來(lái)。2、方法

利用眼色性狀由x染色體上的基因決定，并與x染色體的遺傳相關(guān)聯(lián)的特征來(lái)作為觀察在x染色體上基因突變的標(biāo)記，故以野生型雄蠅（紅色圓眼，正常蠅）染毒，與Basc（Muller-5）雌蠅交配，如雄蠅經(jīng)受試物處理后，在x染色體上的基因發(fā)生隱性致死，則可通過(guò)上述兩點(diǎn)遺傳規(guī)則于F2代的雄蠅中表現(xiàn)出來(lái)，并籍眼色性狀為標(biāo)記來(lái)判斷試驗(yàn)的結(jié)果。即根據(jù)盂德?tīng)柗诸?lèi)反應(yīng)產(chǎn)生四種不同表型的F2代，有隱性致死時(shí)在F2代中沒(méi)有紅色圓眼的雄蠅。注：Basc（Muller-5）雌蠅（淡杏色棒眼，在兩個(gè)x染色體上各帶一個(gè)倒位以防止F1代把染毒處理過(guò)的父系x染色體和母系X染色體互換）顯性致死即突變配子與正常配子結(jié)合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。隱性致死需要純合子或半合子才能出現(xiàn)死亡效應(yīng)。

果蠅的伴性遺傳SLRLtest的優(yōu)缺點(diǎn)：sex-linkedrecessivelethaltest,SLRL是果蠅各種測(cè)試系統(tǒng)中最敏感的實(shí)驗(yàn)，果蠅具有世代周期短、繁殖率高、飼養(yǎng)方便、經(jīng)濟(jì)、判斷突變終點(diǎn)客觀、不需活化等優(yōu)點(diǎn)，其不足之處是它與哺乳動(dòng)物差異較大，所以對(duì)其結(jié)果外推應(yīng)慎重。一般認(rèn)為，果蠅實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性結(jié)果有高度的實(shí)用價(jià)值，而陰性結(jié)果在沒(méi)有真核系統(tǒng)試驗(yàn)支持前不能完全認(rèn)為無(wú)致突變性。SLRL能檢出點(diǎn)突變、小缺失、重排等幾種遺傳變異的類(lèi)型。(八)顯性致死試驗(yàn)1、原理

顯性致死即突變配子與正常配子結(jié)合后，在著床前或著床后的早期胚胎死亡。顯性致死突變指致突變物可引起哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞染色體畸變，以致不能與異性生殖細(xì)胞結(jié)合或?qū)е率芫言谥睬八劳觯驅(qū)е屡咛ピ缙谒劳?。本試?yàn)是對(duì)雄性動(dòng)物染毒，觀察一個(gè)精子發(fā)育周期中各個(gè)階段雌鼠胚胎早期死亡發(fā)生率的變化，進(jìn)而判斷受試物有無(wú)對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的損害及損害發(fā)生的敏感階段，是否具有致突變作用。它是評(píng)價(jià)化學(xué)毒物對(duì)雄性動(dòng)物的生殖細(xì)胞遺傳較好的實(shí)驗(yàn)方法之一。

2、檢測(cè)范圍顯性致死試驗(yàn)(dominantlethaltest)是一種體內(nèi)試驗(yàn)，用于檢測(cè)整體哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞遺傳性損傷，如單純的染色體斷裂所導(dǎo)致的大缺失或重復(fù)，或者同時(shí)還有因染色體重排所形成的不平衡染色體分離或不分離，即非整倍體。3、動(dòng)物選擇動(dòng)物多選用小鼠，也可用大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠，設(shè)備簡(jiǎn)單，較為實(shí)用。但靈敏度較差，使用動(dòng)物量大。4、方法

（1）交配

于雄鼠給予受試物后，按雌雄鼠2：1比例同籠交配6d后，取出雌鼠另行飼養(yǎng)。雄鼠則于1d后，再以同樣數(shù)量的另一批雌鼠同籠交配，如此共進(jìn)行5～6批。

（2）胚胎檢查以雌雄鼠同籠日算起第15～17d,采用頸椎脫日法處死雌鼠后，立即剖腹取出于宮，仔細(xì)檢查、計(jì)數(shù)，分別記錄每一雌鼠的活胎數(shù)、早期死亡胎數(shù)與晚期死亡胎數(shù).

（3）胚胎鑒別

活胎：完整成形，色鮮紅，有自然運(yùn)動(dòng)，機(jī)械刺激后有運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。

早期死亡胚胎：胚胎形體較小，外形不完整，胎盤(pán)較小或不明顯。最早期死亡胚胎：僅在子宮內(nèi)膜上隆起如一小瘤。如已完全被吸收，僅在子宮內(nèi)膜上留一隆起暗褐色點(diǎn)狀物。

晚期死亡胚胎：成形，色澤暗淡，無(wú)自然運(yùn)動(dòng)，機(jī)械刺激后無(wú)運(yùn)動(dòng)反應(yīng)。

5、統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)以上結(jié)果，計(jì)算出受孕率，總著床數(shù)，早期和晚期胚胎死亡率予以比較評(píng)價(jià)。孕鼠數(shù)（1）受孕率（％）=------------------（1）交配雌鼠數(shù)（2）總著床數(shù)=活胎數(shù)十早期胚胎死亡數(shù)十晚期胚胎死亡數(shù)（2）

總著床數(shù)（3）平均著床數(shù)=------------（3）受雌鼠數(shù)孕

（九)單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（SCGE)

1、原理

又稱(chēng)彗星試驗(yàn)(cometassay)，是一種近年發(fā)展起來(lái)的在單細(xì)胞水平上檢測(cè)有核細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)的方法。增加的DNA遷移是和增加的SSB(單鏈DNA斷裂)的水平有關(guān)。可進(jìn)行體外試驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)。基本方法為：獲得細(xì)胞懸液，制作好含有細(xì)胞的瓊脂糖的載玻片；裂解細(xì)胞以釋放DNA；在堿性溶液中(pH13)獲得單鏈DNA，在堿性條件下電泳，中和堿，DNA染色和彗星顯像，記數(shù)彗星。

2、優(yōu)點(diǎn)與其他遺傳毒性試驗(yàn)相比，此方法的優(yōu)點(diǎn)為：檢測(cè)低水平DNA損傷的敏感性高，對(duì)樣品的細(xì)胞數(shù)要求少，適應(yīng)性高，低花費(fèi)，操作簡(jiǎn)便，使用的實(shí)驗(yàn)物質(zhì)相對(duì)少，完成實(shí)驗(yàn)所需的時(shí)間較短。

（十）觀察方法的新進(jìn)展

目前已知，對(duì)于致突變物有200種以上的測(cè)定方法。然而，大量的遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)主要依賴(lài)相對(duì)較少的幾個(gè)試驗(yàn)，說(shuō)明致突變?cè)囼?yàn)有許多地方需要完善。例如，隨著生活的現(xiàn)代化，人們不得不面對(duì)眾多的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入生活，就需要對(duì)這些化學(xué)物質(zhì)的危害性作出評(píng)價(jià)，包括遺傳毒性的評(píng)價(jià)；對(duì)原有的方法提出新的要求，如自動(dòng)化檢測(cè)。此外，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的日新月異，有可能更準(zhǔn)確地測(cè)定致突變作用，如轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測(cè)系統(tǒng)和熒光原位雜交技術(shù)(FISH)。

(1)轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測(cè)系統(tǒng)：

正常情況下，哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因突變率很低，難以檢測(cè)。故檢測(cè)突變方法大多用于體外培養(yǎng)細(xì)胞。但由于體外試驗(yàn)需加入模擬的代謝系統(tǒng)，其結(jié)果不盡如人意。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，有可能在體內(nèi)檢測(cè)基因突變，這就是轉(zhuǎn)基因小鼠致突變檢測(cè)系統(tǒng)。它是利用穿梭載體于原核和真核間往返轉(zhuǎn)移，帶可回收靶基因載體的轉(zhuǎn)基因小鼠提供哺乳動(dòng)物體內(nèi)基因的檢測(cè)系統(tǒng)，用以測(cè)定自發(fā)和誘發(fā)突變率，分析基因突變的組織專(zhuān)一性和順序變化，闡明DNA修復(fù)、基因毒性、突變和癌變的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指基因組中整合以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入的穩(wěn)定的外源DNA，并能遺傳給后代的一類(lèi)動(dòng)物。

其優(yōu)點(diǎn)有：可根據(jù)需要導(dǎo)入后代后仍能帶有目的基因，從根本上優(yōu)于以前的體外檢測(cè)系統(tǒng)。已建有供致突變?cè)囼?yàn)用的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其注冊(cè)商品名為BigBlu