原核基因表達(dá)調(diào)控模式

原核基因表達(dá)調(diào)控模式第1頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第2頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月KeyTermsAninducerisasmallmoleculethattriggersgenetranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.Apositiveregulatorproteinthatrespondstoasmallmoleculeisusuallycalledanactivator.Arepressorisaproteinthatinhibitsexpressionofagene.Acorepressorisasmallmoleculethattriggersrepressionoftranscriptionbybindingtoaregulatorprotein.第3頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Activator&Repressor第4頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1InductionVSRepression

Inductioncanbeachievedbyinactivatingarepressororactivatinganactivator.Repressioncanbeachievedbyactivatingarepressororinactivatinganactivator第5頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第6頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Negativecontrol:Regulationmediatedbyfactorsthatblockorturnoff

transcription.Positivecontroldescribesasysteminwhichageneisnotexpressedunlesssomeactionoccurstoturniton.2

Negativeversuspositivecontrol第7頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月NegativeversuspositivecontrolGenesundernegativecontrolareexpressedunlesstheyareswitchedoffbyarepressorprotein.(Anyactionthatinterfereswithgeneexpressioncanprovideanegativecontrol.)Forgenesunderpositivecontrol,expressionispossibleonlywhenanactiveregulatorproteinispresent.第8頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Positivevs.negativecontrol第9頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Allostericregulationdescribestheabilityofaproteintochangeitsconformation(andthereforeactivity)atonesiteastheresultofbindingasmallmoleculetoasecondsitelocatedelsewhereontheprotein.第10頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月AllostericregulationTheeffectsofallostericeffectorsonthe

DNA-bindingactivitiesofactivatorsandrepressors.第11頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月operonAnoperonisaunitofbacterialgeneexpressionandregulation,includingstructuralgenesandcontrolelementsinDNArecognizedbyregulatorgeneproduct(s).Bacterialstructuralgenesareoftenorganizedintoclustersthatincludegenescodingforproteinswhosefunctionsarerelated.第12頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月重點概念A(yù)trans-actingproductcanfunctiononanycopyofitstargetDNA.ThisimpliesthatitisadiffusibleproteinorRNA.Acis-actingsiteaffectstheactivityonlyofsequencesonitsownmoleculeofDNA(orRNA);thispropertyusuallyimpliesthatthesitedoesnotcodeforprotein.AstructuralgenecodesforanyRNAorproteinproductotherthanaregulator.Aregulatorgenecodesforaproduct(typicallyprotein)thatcontrolstheexpressionofothergenes(usuallyattheleveloftranscription).TheoperatoristhesiteonDNAatwhicharepressorproteinbindstopreventtranscriptionfrominitiatingattheadjacentpromoter.第13頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月LacoperonThebasicconceptforhowtranscriptioniscontrolledinbacteriawasprovidedbytheclassicformulationofthemodelforcontrolofgeneexpressionbyJacobandMonodin1961(JacobandMonod,1961).TheydistinguishedbetweentwotypesofsequencesinDNA:sequencesthatcodefortrans-actingproducts;andcis-actingsequencesthatfunctionexclusivelywithintheDNA.Geneactivityisregulatedbythespecificinteractionsofthetrans-actingproducts(usuallyproteins)withthecis-actingsequences(usuallysitesinDNA).第14頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月LacoperonLacZ（半乳糖苷酶）3510bpLacY（半乳糖苷通透酶）780bpLacA（半乳糖乙酰酶）825bp結(jié)構(gòu)基因啟動子（P）TGTTGACATTTATTTGTTATAATGCAT6~9bp4~7bp操縱子（O）53識別部位結(jié)合部位乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因（R）1040bp第15頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月JacobandMonodmodeloftranscriptionalregulationofthe

lac

operon

by

lac

repressorThelacgenesarecontrolledbyarepressor第16頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Thelacoperoncanbeinduced

AdditionofinducerresultsinrapidinductionoflacmRNA,andisfollowedafterashortlagbysynthesisoftheenzymes;removalofinducerisfollowedbyrapidcessationofsynthesis.第17頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月ThequaternarystructureofthelacrepressorcomplexedtoDNA第18頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Theallosterictransition:LacIComparisonofinteractionsatthedimerinterfaceinvolvingLys84intheIPTG-bound(left)andoperator-bound(right)structuresComparisonofinteractionsneartheinducer-bindingpocketinthestructuresoftherepressorboundtoIPTG(left)andoperator–ONPF(right).TheONPFand IPTGmoleculesare showninredinball-and- stick.NoticethattheHis 74–Asp278ionpair formedintheIPTG- boundconformationis brokenintheoperator- boundconformation,and thattheinteractionsof Gln78arealsoaltered.第19頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Theallosterictransition:LacI第20頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月三個結(jié)構(gòu)基因的功能lacZ編碼β-半乳糖苷酶，此酶由500kd的四聚體構(gòu)成，它可以切斷乳糖的半乳糖苷鍵，而產(chǎn)生半乳糖和葡萄糖lacY編碼β一半乳糖苷透性酶，這種酶是一種分子量為30kDd膜結(jié)合蛋白，它構(gòu)成轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，將半乳糖苷運(yùn)入到細(xì)胞中。lacA編碼β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶，其功能只將乙酰-輔酶A上的乙?；D(zhuǎn)移到β-半乳糖苷上。第21頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月The

metabolism

oflactose.The

enzyme

β-galactosidasecatalyzesareactioninwhichwaterisaddedtotheβ-galactosidase

linkage

tobreaklactoseintoseparatemoleculesofgalactoseandglucose.Theenzymelactosepermeaseisrequiredtotransportlactoseintothecell.第22頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Glucoserepressioncontrolsuseofcarbonsources

Glucoserepression(Cataboliterepression)describesthedecreasedexpressionofmanybacterialoperonsthatresultsfromadditionofglucose.Inducerexclusiondescribestheinhibitionofuptakeofothercarbonsourcesintothecellthatiscausedbyuptakeofglucose.PTS(phosphoenolpyruvate:glycosephosphotransferasesystem磷酸烯醇式丙酮酸Intheabsenceofinducer,theoperonistranscribedataverylowbasallevel第23頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月CRPactivator(CAPactivator)isapositiveregulatorproteinactivatedbycyclicAMP.ItisneededforRNApolymerasetoinitiatetranscriptionofmanyoperonsofE.coli.AdenylatecyclaseisanenzymethatusesATPasasubstratetogeneratecyclicAMP,inwhich5and3positionsofthesugarringareconnectedviaaphosphategroup.第24頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Catabolitecontrolofthelacoperon.TheoperonisinduciblebylactosetothemaximallevelswhencAMPandCAPformacomplex.第25頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月NegativeandpositivecontrolofthelacoperonbytheLacrepressorandcataboliteactivatorprotein(CAP),respec-tively.ASummaryofthe

lac

Operon第26頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月ASummaryofthe

lac

Operonvedio第27頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月藍(lán)白斑篩選第28頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月α-互補(bǔ)藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。第29頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月設(shè)計適用于藍(lán)白斑篩選的基因工程菌為β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。這種宿主菌的染色體基因組中編碼β-半乳糖苷酶的基因突變，造成其編碼的β-半乳糖苷酶失去正常N段一個146個氨基酸的短肽（即α肽鏈），從而不具有生物活性，即無法作用于X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。用于藍(lán)白斑篩選的載體具有一段稱為lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的啟動子；編碼α肽鏈的區(qū)段；一個多克隆位點(MCS)。MCS位于編碼α肽鏈的區(qū)段中，是外源DNA的選擇性插入位點，但其本身不影響載體編碼α肽鏈的功能活性。雖然上述缺陷株基因組無法單獨編碼有活性的β-半乳糖苷酶，但當(dāng)菌體中含有帶lacz'的質(zhì)粒后，質(zhì)粒lacz'基因編碼的α肽鏈和菌株基因組表達(dá)的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突變體互補(bǔ)，具有與完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成藍(lán)色物質(zhì)的能力，這種現(xiàn)象即α-互補(bǔ)。第30頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第31頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月操作中，添加IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。以上是攜帶空載體的菌株產(chǎn)生的表型。當(dāng)外源DNA（即目的片段）與含lacz'的載體連接時，會插入進(jìn)MCS，使α肽鏈讀碼框破壞，這種重組質(zhì)粒不再表達(dá)α肽鏈，將它導(dǎo)入宿主缺陷菌株則無α互補(bǔ)作用，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。第32頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月二轉(zhuǎn)錄水平上的其他調(diào)控第33頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月Theholoenzyme(completeenzyme)isthecomplexoffivesubunitsincludingcoreenzyme(α2ββandσ).ThecoreenzymeisthecomplexofRNApolymerasesubunitsthatundertakeselongation.Itdoesnotincludeadditionalsubunitsorfactorsthatmayneededforinitiationortermination.SigmafactoristhesubunitofbacterialRNApolymeraseneededforinitiation;itisthemajorinfluenceonselectionofpromoters.第34頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月第35頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1、σ因子的更換

在E.coli中,當(dāng)細(xì)胞從基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制轉(zhuǎn)入各種特定基因表達(dá)時，需要不同的因子指導(dǎo)RNA聚合酶與各種啟動子結(jié)合。作用機(jī)制：因子結(jié)合在調(diào)控基因上游的不同區(qū)域（如啟動子），主要參與雙鏈DNA解開為單鏈，從而選擇模板鏈和轉(zhuǎn)錄的起始。第36頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月大腸桿菌中的各種σ因子比較σ因子編碼基因主要功能σ70rpoD參與對數(shù)生長期和大多數(shù)碳代謝過程基因的調(diào)控σ54rpoN參與多數(shù)氮源利用基因的調(diào)控σ38rpoH分裂間期特異基因的表達(dá)調(diào)控σ32rpoS熱休克基因的表達(dá)調(diào)控σ28rpoF鞭毛趨化相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控σ24rpoE過度熱休克基因的表達(dá)調(diào)控第37頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月溫度較高,誘導(dǎo)產(chǎn)生各種熱休克蛋白由σ32參與構(gòu)成的RNA聚合酶與熱休克應(yīng)答基因啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的熱休克蛋白，適應(yīng)環(huán)境需要?？莶菅挎邨U菌芽孢形成有序的σ因子的替換，RNA聚合酶識別不同基因的啟動子，使芽孢形成有關(guān)的基因有序地表達(dá)。第38頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月3、弱化子對基因活性的影響

當(dāng)操縱子被阻礙，RNA合成被終止時，起終止轉(zhuǎn)錄信號作用的一段核甘酸被稱為弱化子。起信號作用的是有特殊負(fù)載的氨酰-tRNA的濃度。微調(diào)？第39頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月4、細(xì)菌的應(yīng)急反應(yīng)

應(yīng)急反應(yīng)信號是鳥甘酸四磷酸（ppGpp）和鳥甘酸五磷酸（pppGpp）。

當(dāng)氨基酸缺乏時，空載tRNA會激活焦磷酸轉(zhuǎn)移酶，使ppGpp大量合成，而ppGpp將關(guān)閉許多基因，同時也將打開一些合成氨基酸的基因，以應(yīng)付緊急情況。第40頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月ppGpp作用機(jī)制：（1）RNA聚合酶有不同的構(gòu)象，可以識別不同的啟動子區(qū)，ppGpp與RNA聚合酶結(jié)合會使它的構(gòu)象穩(wěn)定下來，從而改變了基因轉(zhuǎn)錄的效率。（2）基因轉(zhuǎn)錄起始位點附近有一些保守序列可能是ppGpp或有關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點；當(dāng)這些序列與ppGpp結(jié)合后，就不能與RNA聚合酶結(jié)合，基因關(guān)閉。第41頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月一、翻譯起始的調(diào)控

RBS（核糖體結(jié)合位點）：mRNA鏈上起始密碼子AUG上游的一段非翻譯區(qū)。在RBS中有SD序列，長度一般為5bp，核糖體16SrRNA與SD序列互補(bǔ)配對，促使核糖體結(jié)合到mRNA上，有利于翻譯的起始。RBS的結(jié)合強(qiáng)度取決于SD序列的結(jié)構(gòu)及其與起始密碼子AUG之間的距離。

SD-4-10（9）-AUG第42頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月

mRNA的二級結(jié)構(gòu)也是翻譯起始調(diào)控的重要因素：核糖體30S亞基必須與mRNA結(jié)合，要求mRNA5’端有一定的空間結(jié)構(gòu)。SD序列的微小變化，往往會導(dǎo)致表達(dá)效率上百倍甚至上千倍的差異。這是因為核苷酸的變化影響了核糖體30S亞基與mRNA結(jié)合，從而造成了蛋白質(zhì)合成效率上的差異。第43頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月二、稀有密碼子對翻譯的影響dnaG、rpoD和rpsU屬于大腸桿菌基因組上的同一個操縱子；50個拷貝的dnaG蛋白、2800個拷貝的rpoD和40000個拷貝的rpsU。第44頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月幾種蛋白質(zhì)中異亮氨酸密碼子使用頻率比較蛋白質(zhì)AUU/%AUC%AUA%結(jié)構(gòu)蛋白37621σ亞基26740DnaG蛋白363232

細(xì)胞內(nèi)對應(yīng)于稀有密碼子的tRNA較少，高頻率使用這些密碼子的基因翻譯過程容易受阻，影響了蛋白質(zhì)合成的總量。第45頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月TrpB–谷氨酸-異亮氨酸-終止GAA--AUC--UGA--UGGAAAUG——GAA甲硫氨酸–谷氨酸–trpAtrpE—蘇氨酸—苯丙氨酸—終止ACU--UUC--UGA--UGGCUAUG——GCU

甲硫氨酸--丙氨酸--

trpD

翻譯終止時核糖體立即處在起始環(huán)境中，這種重疊的密碼子保證了同一核糖體對兩個連續(xù)基因進(jìn)行翻譯的機(jī)制。這樣可以保證2個基因的產(chǎn)物數(shù)量上相等。三、重疊基因?qū)Ψg的影響第46頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月四、poly(A)對翻譯的影響

研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成旺盛時，mRNA鏈上核糖體數(shù)量多，mRNA鏈上的poly(A)較長；當(dāng)某些mRNA不再翻譯時，核糖體就被釋放出來，poly(A)也相應(yīng)縮短。第47頁，課件共55頁，創(chuàng)作于2023年2月1、一個操縱子（元）通常含有

(A)

數(shù)個啟