基因結(jié)構(gòu)與功能分析

基因結(jié)構(gòu)與功能分析第1頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第二十二章

基因結(jié)構(gòu)與功能分析技術(shù)

TheAnalysisTechnologyforGeneStructureandFunction第2頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月人類的多種疾病都與基因的結(jié)構(gòu)或功能異常有關(guān)，因此，要闡明疾病發(fā)生的分子機制和進行有效的診斷與防治，均需首先揭示基因的結(jié)構(gòu)與功能。DNA序列測定基因轉(zhuǎn)錄起點及其啟動子的分析基因編碼序列的分析基因拷貝數(shù)及其表達產(chǎn)物的分析基因功能獲得和/或缺失策略隨機突變篩選策略第3頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)

基因結(jié)構(gòu)分析技術(shù)第4頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、基因一級結(jié)構(gòu)解析技術(shù)基因的一級結(jié)構(gòu)是指脫氧核苷酸的排列順序，解析一級結(jié)構(gòu)最精確的技術(shù)就是DNA測序（DNAsequencing）。第5頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）雙脫氧法和化學(xué)降解法是兩種常規(guī)的DNA測序方法Sanger雙脫氧測序（dideoxysequencing）法第6頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月Maxam-Gilbert化學(xué)降解測序法第7頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）全自動激光熒光DNA測序技術(shù)的原理基于Sanger雙脫氧法1.四色熒光法：采用四種不同的熒光染料標(biāo)記同一引物或4種不同的終止底物ddNTP，最終結(jié)果均相當(dāng)于賦予DNA片段4種不同的顏色。因此，一個樣品的4個反應(yīng)產(chǎn)物可在同一個泳道內(nèi)電泳。2.單色熒光法：采用單一熒光染料標(biāo)記引物5′-端或dNTP，所有產(chǎn)物的5′-末端均帶上了同一種熒光標(biāo)記，一個樣品的四個反應(yīng)必須分別進行，相應(yīng)產(chǎn)物也必須在四個不同的泳道內(nèi)電泳第8頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）焦磷酸測序是一種基于發(fā)光法測定焦磷酸的測序技術(shù)焦磷酸測序技術(shù)操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）分析、等位基因頻率測定、細菌和病毒等微生物的分型鑒定、CpG甲基化分析、掃描與疾病相關(guān)基因序列中的突變點等領(lǐng)域。該方法的測序長度一般短于Sanger法。第9頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（四）循環(huán)芯片測序被稱為第二代測序技術(shù)循環(huán)芯片測序（cyclic-arraysequencing）①可實現(xiàn)大規(guī)模并行化分析②不需電泳，設(shè)備易于微型化③樣本和試劑的消耗量降低，降低了測序成本優(yōu)勢：技術(shù)平臺：454測序、Solexa測序（Illumina測序）、SOLiD測序等。第10頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月基本流程：①將基因組DNA隨機切割成為小片段DNA；②在所獲小片段DNA分子的末端連上接頭，然后變性得到單鏈模板文庫；③將帶接頭的單鏈小片段DNA文庫固定于固體表面；④對固定片段進行克隆擴增，從而制成polony芯片。⑤針對芯片上的DNA，利用聚合酶或連接酶進行一系列循環(huán)反應(yīng)，通過讀取堿基連接到DNA鏈過程中釋放出的光學(xué)信號而間接確定堿基序列。第11頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）單分子測序技術(shù)被稱為第三代測序技術(shù)主要策略：①通過摻入并檢測熒光標(biāo)記的核苷酸，來實現(xiàn)單分子測序，如單分子實時技術(shù)（singlemoleculerealtimetechnology，SMRT）；②利用DNA聚合酶在DNA合成時的天然化學(xué)方式來實現(xiàn)單分子測序；③直接讀取單分子DNA序列信息。第12頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、基因轉(zhuǎn)錄起點分析技術(shù)轉(zhuǎn)錄起點（transcriptionstartsite，TSS）（一）用cDNA克隆直接測序法鑒定TSS以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉(zhuǎn)錄酶的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上polyC尾，并以此引導(dǎo)合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆于適宜載體，通過對克隆cDNA的5-末端進行測序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡單，尤其適于對特定基因TSS的分析。但可導(dǎo)致5-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。第13頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）用5-cDNA末端快速擴增技術(shù)鑒定TSS常用的技術(shù)包括5-末端基因表達系列分析（5-endserialanalysisofgeneexpression，5-SAGE）和帽分析基因表達（capanalysisgeneexpression，CAGE）技術(shù)。第14頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）用數(shù)據(jù)庫搜索TSS利用對寡核苷酸帽法構(gòu)建的全長cDNA文庫5-末端測序所得的數(shù)據(jù)信息建立了一個TSS數(shù)據(jù)庫（databaseoftranscriptionstartsites，DBTSS），并在此基礎(chǔ)上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一種TSS測序法，從而實現(xiàn)了一次測試可產(chǎn)生1×107個TSS的數(shù)據(jù)。第15頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月三、基因啟動子結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（一）用PCR結(jié)合測序技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu)該方法最為簡單和直接，即根據(jù)基因的啟動子序列，設(shè)計一對引物，然后以PCR法擴增啟動子，經(jīng)測序分析啟動子序列結(jié)構(gòu)。第16頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）用核酸-蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)分析啟動子結(jié)構(gòu)1.用足跡法分析啟動子中潛在的調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點足跡法（footprinting）是利用DNA電泳條帶連續(xù)性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA區(qū)域，它是研究核酸-蛋白質(zhì)相互作用的方法，而不是專門用于研究啟動子結(jié)構(gòu)的方法。分類：酶足跡法化學(xué)足跡法第17頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（1）用核酸酶進行足跡分析酶足跡法（enzymaticfootprinting）是利用DNA酶處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后通過電泳分析蛋白質(zhì)結(jié)合序列。常用的酶有DNA酶I（DNaseI）和核酸外切酶III。第18頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）用化學(xué)試劑進行足跡分析化學(xué)足跡法（chemicalfootprinting）是利用能切斷DNA骨架的化學(xué)試劑處理DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，由于化學(xué)試劑無法接近結(jié)合了蛋白質(zhì)的DNA區(qū)域，因此在電泳上形成空白區(qū)域的位置就是DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。最常用的化學(xué)足跡法是羥自由基足跡法（hydroxylradicalfootprinting）。第19頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2.用電泳遷移率變動分析和染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)鑒定啟動子電泳遷移率變動分析（EMSA）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）只能確定DNA序列中含有核蛋白結(jié)合位點，故尚需結(jié)合DNA足跡實驗和DNA測序等技術(shù)來確定具體結(jié)合序列。第20頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）用生物信息學(xué)預(yù)測啟動子1.用啟動子數(shù)據(jù)庫和啟動子預(yù)測算法定義啟動子在定義啟動子或預(yù)測分析啟動子結(jié)構(gòu)時應(yīng)包括啟動子區(qū)域的3個部分①核心啟動子（corepromoter）；②近端啟動子（proximalpromoter）：含有幾個調(diào)控元件的區(qū)域，其范圍一般涉及TSS上游幾百個堿基；③遠端啟動子（distalpromoter）：范圍涉及TSS上游幾千個堿基，含有增強子和沉默子等元件。第21頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月2.預(yù)測啟動子的其他結(jié)構(gòu)特征啟動子區(qū)域的其他結(jié)構(gòu)特征包括GC含量、CpG比率、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點、堿基組成及核心啟動子元件等。用于啟動子預(yù)測的數(shù)據(jù)庫：EPD（eukaryoticpromoterdatabases）數(shù)據(jù)庫，主要預(yù)測真核RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，數(shù)據(jù)庫中的所有啟動子數(shù)據(jù)信息都經(jīng)過實驗證實；TRRD（transcriptionregulatoryregiondatabases）是一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)來源于已發(fā)表的科學(xué)論文。第22頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月四、基因編碼序列分析技術(shù)（一）用cDNA文庫法分析基因編碼序列cDNA克隆測序或構(gòu)建cDNA文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長cDNA文庫可以通過mRNA的結(jié)構(gòu)特征進行判斷，mRNA的序列基本都由3部分組成，即5-UTR、編碼序列和3-UTR。

cDNA末端快速擴增（RACE）技術(shù)是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法。核酸雜交法可從cDNA文庫中獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆。第23頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）用RNA剪接分析法確定基因編碼序列高通量分析RNA剪接的方法：①基于DNA芯片的分析法②交聯(lián)免疫沉淀法③體外報告基因測定法選擇性剪接的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過基因表達序列標(biāo)簽（expressionsequencetag,EST）的比較進行鑒定，但這種方法需進行大量的EST序列測定；同時由于大多數(shù)EST文庫來源于非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。第24頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）用數(shù)據(jù)庫分析基因編碼序列在基因數(shù)據(jù)庫中，對各種方法所獲得的cDNA片段的序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內(nèi)含子∕外顯子分析、ORF分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，并可對其編碼產(chǎn)物的基本性質(zhì)進行分析。利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然后，利用NCBI的ORFFinder軟件或EMBOSS中的getorf軟件進行ORF分析，并根據(jù)編碼序列和非編碼序列的結(jié)構(gòu)特點，便可確定基因的編碼序列。第25頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月五、基因拷貝數(shù)分析技術(shù)分析某種基因的種類及拷貝數(shù)，實質(zhì)上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術(shù)包括DNA印跡（Southern印跡）、實時定量PCR技術(shù)等。

DNA印跡是根據(jù)探針信號出現(xiàn)的位置和次數(shù)判斷基因的拷貝數(shù)實時定量PCR是通過被擴增基因在數(shù)量上的差異推測模板基因拷貝數(shù)的異同DNA測序是最精確的鑒定基因拷貝數(shù)的方法第26頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)基因表達產(chǎn)物分析技術(shù)第27頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、通過檢測RNA而在轉(zhuǎn)錄水平分析基因表達根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因轉(zhuǎn)錄水平分析分為封閉和開放性系統(tǒng)研究方法。封閉性系統(tǒng)研究方法（如DNA芯片、RNA印跡、實時RT-PCR等）的應(yīng)用范圍僅限于已知基因。開放性系統(tǒng)研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物PCR指紋分析等）可用于發(fā)現(xiàn)和分析未知基因。第28頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）用核酸雜交法檢測RNA表達水平1.用RNA印跡分析RNA表達RNA印跡被廣泛應(yīng)用于RNA表達分析，并作為鑒定RNA轉(zhuǎn)錄本、分析其大小的標(biāo)準(zhǔn)方法。2.用核糖核酸酶保護實驗分析RNA水平及其剪接情況RNA酶保護實驗（ribonucleaseprotectionassay，RPA）是一種基于雜交原理分析RNA的方法，既可進行定量分析，又可研究其結(jié)構(gòu)特征。第29頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第30頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月3.用原位雜交進行RNA區(qū)域定位原位雜交（ISH）是通過設(shè)計與目標(biāo)RNA堿基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測RNA的技術(shù)，其可對細胞或組織中原位表達的RNA進行區(qū)域定位，同時也可作為定量分析的補充。第31頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）用PCR技術(shù)檢測RNA表達水平1.用逆轉(zhuǎn)錄PCR進行RNA的半定量分析逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析。2.用實時定量PCR進行RNA的定量分析實時定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應(yīng)進行實時監(jiān)測，具有很高的靈敏度和特異性。第32頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）用基因芯片和高通量測序技術(shù)分析RNA表達水平1.基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法基因芯片主要采用cDNA芯片，其便于對不同狀態(tài)下的基因表達譜進行比較，揭示轉(zhuǎn)錄組差異表達的規(guī)律，對探索發(fā)病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標(biāo)具有重要意義。2.用循環(huán)芯片測序技術(shù)分析基因表達譜運用循環(huán)芯片測序技術(shù)，可對基因表達譜進行高通量分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列測定，從而快速獲得轉(zhuǎn)錄組或基因組的全貌。第33頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月二、通過檢測蛋白質(zhì)/多肽而在翻譯水平分析基因表達（一）用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測蛋白質(zhì)/多肽（二）用酶聯(lián)免疫吸附實驗分析蛋白質(zhì)/多肽酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）也是一種建立在抗原-抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)/多肽分析方法，其主要用于測定可溶性抗原或抗體，第34頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達的蛋白質(zhì)/多肽免疫組化實驗包括免疫組織化學(xué)和免疫細胞化學(xué)實驗，二者原理相同，都是用標(biāo)記的抗體在組織/細胞原位對目標(biāo)抗原（目標(biāo)蛋白質(zhì)/多肽）進行定性、定量、定位檢測。（四）用流式細胞術(shù)分析表達特異蛋白質(zhì)的陽性細胞流式細胞術(shù)（flowcytometry）通常利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)流式細胞儀分析熒光信號，根據(jù)細胞表達特定蛋白質(zhì)的水平對某種蛋白質(zhì)陽性細胞做出判斷。第35頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（五）用蛋白質(zhì)芯片和雙向電泳高通量分析蛋白質(zhì)/多肽表達水平1.用蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)/多肽的表達譜根據(jù)制作方法和用途不同，可將其分為蛋白質(zhì)檢測和功能芯片兩大類。蛋白質(zhì)檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可用來研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)∕蛋白質(zhì)-DNA∕蛋白質(zhì)-RNA，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、蛋白質(zhì)-小分子等的相互作用。第36頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)芯片可用于檢測組織∕細胞來源的樣品中蛋白質(zhì)的表達譜；其精確程度、信息范疇取決于芯片上已知多肽的信息多寡。2.用雙向電泳分析蛋白質(zhì)/多肽表達譜雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質(zhì)，對差異表達的蛋白質(zhì)進行鑒定。第37頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)基因的生物學(xué)功能鑒定技術(shù)第38頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月一、用功能獲得策略鑒定基因功能基因功能獲得策略的本質(zhì)是將目的基因直接導(dǎo)入某一細胞或個體中，使其獲得新的或更高水平的表達，通過細胞或個體生物性狀的變化來研究基因功能。方法：轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因敲入技術(shù)第39頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（一）用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得基因功能轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenictechnology）是指將外源基因?qū)胧芫鸦蚺咛ジ杉毎╡mbryonicstemcell），即ES細胞，通過隨機重組使外源基因插入細胞染色體DNA，隨后將受精卵或ES細胞植入假孕受體動物的子宮，使得外源基因能夠隨細胞分裂遺傳給后代。轉(zhuǎn)基因動物（transgenicanimal）是指應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出的攜帶外源基因，并能穩(wěn)定遺傳的動物，其制備步驟主要包括轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建、外源基因的導(dǎo)入和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物的獲得和鑒定、轉(zhuǎn)基因動物品系的繁育等。轉(zhuǎn)基因小鼠最為常見。

第40頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月第41頁，課件共45頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）用基因敲入技術(shù)獲得基因的功能基因敲入（gene