醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白-課件

醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、了解電泳的一般原理、掌握醋酸纖維素薄膜電泳操作技術(shù)；2、掌握醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白的方法。實(shí)驗(yàn)六1ppt課件【實(shí)驗(yàn)原理】

由于各種血清蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，因此在pH8.6的緩沖液中，各種血清蛋白質(zhì)所帶電荷量不同，同時(shí)由于它們的相對(duì)分子質(zhì)量也不同，造成電泳遷移率不同，所以在醋酸纖維薄膜上電泳后，可將各種血清蛋白質(zhì)分離開(kāi)。2ppt課件血清中含有清蛋白，α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中遷移速度不同。分子量小、等電點(diǎn)低、在相同堿性PH值緩沖體系中，帶負(fù)荷電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場(chǎng)中遷移速度快。例如，以醋酸纖維素薄膜為支持物，正常人血清在PH8.6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動(dòng)最快，其余依次為α1-、α2-、β-及γ-球蛋白（如圖3-5）。3ppt課件圖3-5正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖1為清蛋白，2，3，4，5分別α1-，α2-，β-及γ-球蛋白，6為點(diǎn)樣原點(diǎn)

4ppt課件這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進(jìn)行光吸收掃描自動(dòng)繪出區(qū)帶吸收峰及相對(duì)百分比。此法由于操作簡(jiǎn)單，快速，分辨率高及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。它不僅可用于分離血清蛋白，還可用于分離脂蛋白、血紅蛋白及同工酶的分離測(cè)定。5ppt課件【實(shí)驗(yàn)材料】1．電泳儀包括直流電源整流器和電泳槽兩個(gè)部分。

2．醋酸纖維素薄膜。

6ppt課件⑵試劑4試劑①巴比妥-巴比妥鈉緩沖液(pH8.6,0.07mol/L,離子強(qiáng)度0.06)稱(chēng)取1.66g巴比妥（AR）和12.76g巴比妥鈉（AR），置于三角燒瓶中，加蒸餾水約600mL，稍加熱溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000mL。置40C保存，備用。②血清蛋白染色染色液（0.5%氨基黑10B）：稱(chēng)取0.5g氨基黑10B，加蒸餾水40mL，甲醇（AR）50mL，冰乙酸（AR）10mL，混勻溶解后置具寒試劑瓶?jī)?nèi)貯存。漂洗液：取95%乙醇（AR）45mL，冰乙酸（AR）5mL和蒸餾水50mL，混勻置具塞試劑瓶中貯存。7ppt課件③透明液：臨用前配制。甲液：取冰乙酸（AR）15mL，無(wú)水乙醇（AR）85mL，混勻置試劑瓶?jī)?nèi)，塞緊瓶塞，備用。乙液：取冰乙酸（AR）25mL，無(wú)水乙醇（AR）75mL，混勻置試劑瓶?jī)?nèi)，塞緊瓶塞，備用。④保存液：液體石蠟。⑤定量洗脫液（0.4mol/LNaOH溶液）：稱(chēng)取16g氫氧化鈉（AR）用少量蒸餾水溶解后定容至1000ml。8ppt課件【實(shí)驗(yàn)方法與步驟】4實(shí)驗(yàn)方法與步驟

⑴儀器與薄膜的準(zhǔn)備1、儀器與薄膜的準(zhǔn)備①醋酸纖維素薄膜的潤(rùn)濕與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心地平放在盛有緩沖液的平皿中，若漂浮于液面的薄膜在15-30s內(nèi)迅速潤(rùn)濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤(rùn)濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點(diǎn)等，則表示薄膜厚薄不均勻應(yīng)棄去，以免影響電泳結(jié)果。將選好的薄膜用竹子輕壓，使其完全浸泡于緩沖液中約30min后，方可用于電泳。9ppt課件

②電泳槽的準(zhǔn)備根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個(gè)電極槽中，各倒入等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個(gè)膜支架上，各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長(zhǎng)邊與支架前沿對(duì)齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當(dāng)濾紙條全部潤(rùn)濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)趕氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個(gè)電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，因而稱(chēng)為濾紙橋。③電極槽的平衡用平衡裝置（或自制平衡管）連接兩個(gè)電泳槽，使兩個(gè)電極槽內(nèi)的緩沖液彼此處于同一水平狀態(tài)，一般需平衡15-20min。注意，取出平衡裝置時(shí)應(yīng)將活塞關(guān)緊。10ppt課件⑵點(diǎn)樣2、點(diǎn)樣取一張干凈濾紙（10×10cm），在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點(diǎn)樣標(biāo)志區(qū)。用竹夾子取出浸透的薄膜，夾在兩層濾紙間以吸去多余的緩沖液。無(wú)光澤面向上平放在點(diǎn)樣模板上，使其底邊與模板底邊對(duì)齊。點(diǎn)樣區(qū)距陰極端1.5cm處。點(diǎn)樣時(shí)，先用玻璃棒或血色素吸管取2-3μL血清，均勻涂在加樣器上，再將點(diǎn)樣器輕輕印在點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，如圖3-6所示，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細(xì)均勻的直線。此步是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，點(diǎn)樣前應(yīng)在濾紙上反復(fù)練習(xí)，掌握點(diǎn)樣技術(shù)后再正式點(diǎn)樣。11ppt課件

圖3-6醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點(diǎn)樣位置示意圖（虛線處為點(diǎn)樣位置）12ppt課件⑶電泳3、電泳用竹夾子將點(diǎn)樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上（點(diǎn)樣面朝下），另一端平貼在陽(yáng)極端支架上，如圖3-7所示，要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時(shí)安放幾張薄膜，則薄膜之間應(yīng)相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導(dǎo)線將電泳槽的正、負(fù)極與電泳儀的正、負(fù)極分別連接，注意不要接錯(cuò)。在室溫下電泳，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，用電泳儀上細(xì)調(diào)節(jié)旋扭調(diào)到每厘米膜寬電流強(qiáng)度為0.3mA（8片薄膜則為4.8mA）。通電10-15min后，將電流調(diào)節(jié)到每厘米膜寬電流強(qiáng)度為0.5mA（8片共8mA），電泳時(shí)間約50-80min。電泳后調(diào)節(jié)旋扭使電流為零，關(guān)閉電泳儀切斷電源。13ppt課件

圖3-7電泳裝置剖視示意圖1.紙橋2.電泳槽3.醋酸纖維素薄膜4.電泳槽膜支架5.電極室中央隔板14ppt課件⑷染色與漂洗（血清蛋白染色與漂洗脫色）4、染色與漂洗（血清蛋白染色與漂洗脫色）用解剖鑷子取出電泳后的薄膜，放在含0.5%氨基黑10B染色液的培養(yǎng)皿中，浸染5min，取出后再用漂洗液浸洗脫色，每隔10min 換漂洗液一次，連續(xù)數(shù)次，直至背景藍(lán)色脫盡。取出薄膜放在濾紙上，用吹風(fēng)機(jī)的冷風(fēng)將薄膜吹干。15ppt課件圖3-8血清蛋白與脂蛋白醋酸纖維素薄膜電泳圖譜比較示意圖a.蛋白染色b.脂蛋白染色16ppt課件⑹結(jié)果判斷與定量6、結(jié)果判斷與定量一般血清蛋白電泳經(jīng)蛋白染色后，可顯示5條區(qū)帶，其排列順序見(jiàn)圖3-8a，未經(jīng)透明處理的電泳圖譜可直接用于定量測(cè)定?？刹捎孟疵摲ɑ蚬馕諕呙璺ǎ瑴y(cè)定各蛋白組分相對(duì)百分含量。17ppt課件

本實(shí)驗(yàn)不要求進(jìn)行定量分析，如有需要，可采用薄層掃描儀進(jìn)行掃描定量，或采用洗脫后再進(jìn)行比色的方法進(jìn)行定量。下面為后者的具體操作步驟：取試管6支，編好號(hào)碼，分別用吸管取0.4N氫氧化鈉4ml，剪開(kāi)薄膜上各條蛋白色帶，另于空白部位剪一平均大小的薄膜條，將各條分別浸于上述試管內(nèi)，不時(shí)搖動(dòng)，使藍(lán)色洗出。約半小時(shí)后，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，波長(zhǎng)用650nm，以空白薄膜條洗出液為空白對(duì)照，讀取白蛋白A、α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。18ppt課件光密度總和T＝A+α1＋α2＋β＋γ各部分蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)為：A（清蛋白）%=A/T×100α1-球蛋白%=α1/T×100α2-球蛋白%=α2/T×100β-球蛋白%=β/T×100γ-球蛋白%=γ/T×100附：遷移率是膠體顆粒的一個(gè)物理常數(shù)，可用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)等物質(zhì)以及研究它們的某些理化性質(zhì)．現(xiàn)將人血漿蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，遷移率等列于下表，供分析參考。19ppt課件蛋白質(zhì)名稱(chēng)等電點(diǎn)泳動(dòng)脈/(cm2·V-1·S-1)分子量清蛋白4.88-5.9×10-569000α1-球蛋白5.06-5.1×10-5200000α2-球蛋白5.06-4.1×10-5300000β-球蛋白5.12-2.8×10-59000-150000γ-球蛋白6.85-7.50-1.0×10-5156000-300000纖維蛋白元5.40-3.1×10-5

正常值：白蛋白57～72%α1球蛋白2～5％

α2球蛋白4～9％β球蛋白6.5～12％

γ球蛋白12～20％表3-12人血漿蛋白質(zhì)的等電及遷移率20ppt課件備注

備注：①醋酸纖維薄膜電泳分析血清蛋白的正常結(jié)果不同于紙上電泳，主要是白蛋白偏高，個(gè)別正常人白蛋白僅超過(guò)70％。Α-，α-，和β，γ都偏低，個(gè)別正常人γ球蛋臼可低到12％左右。上述正常值僅供參考。②經(jīng)電泳，染色之干燥膜浸于冰醋酸：95％乙醇（2:8）溶液中20分鐘，取出后將薄膜平貼于玻璃板上。干燥過(guò)程中，薄膜漸變透明。此透明薄膜可用掃描光密度計(jì)繪出電泳曲線，并可根據(jù)曲線的面積計(jì)算各組分的百分?jǐn)?shù)。目前國(guó)內(nèi)已有自動(dòng)定量的光密度計(jì)生產(chǎn)。此透明薄膜可長(zhǎng)期保存，供教學(xué)示教用。21ppt課件【注意事項(xiàng)】5注意事項(xiàng)

⑴醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理⑴醋酸纖維素薄膜的預(yù)處理薄膜的浸潤(rùn)與選膜是電泳成敗的重要關(guān)鍵之一。將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，其目的是選擇膜片厚薄及均勻度，如漂浮15-30s時(shí)，膜片吸水不均勻，則有白色斑點(diǎn)或條紋，這提示膜片厚薄不均，應(yīng)棄去不用，以免造成電泳后區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復(fù)。點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)將膜片表面多余的緩沖液用濾紙吸去，以免緩沖液太多引起樣品擴(kuò)散。但也不能吸得太干，太干則樣品不易進(jìn)入薄膜的網(wǎng)孔內(nèi)，而造成電泳起始點(diǎn)參差不齊，影響分離效果。吸水量以不干不濕為宜。為防止指紋污染，取膜時(shí)，應(yīng)戴指套或用夾子。22ppt課件⑵緩沖液的選擇

⑵緩沖液的選擇醋酸纖維素薄膜電泳常選用pH8.6巴比妥緩沖液，其濃度為0.05-0.09mol/L。選擇何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。在選擇時(shí)，先初步定下某一濃度，如電泳槽兩極之間的膜長(zhǎng)度為8-10cm，則需電壓25V/cm膜長(zhǎng)，電流強(qiáng)度為0.4-0.5mA/cm膜寬。當(dāng)電泳時(shí)達(dá)不到或超過(guò)這個(gè)值時(shí)，則應(yīng)增加緩沖液濃度或進(jìn)行稀釋。緩沖液濃度過(guò)低，則區(qū)帶泳動(dòng)速度快，并由于擴(kuò)散變寬；緩沖液濃度過(guò)高，則區(qū)帶泳動(dòng)速度慢，區(qū)帶分布過(guò)于集中，不易分辨。23ppt課件⑶加樣量

⑶加樣量加樣品量的多少與電泳條件、樣品的性質(zhì)、染色方法與檢測(cè)手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測(cè)方法越靈敏，加樣量則越少，對(duì)分離更有利。如加樣量過(guò)大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至互相干擾，染色也較費(fèi)時(shí)。如電泳后用洗脫法定量時(shí)，每厘米加樣線上需加樣品10.-5μL，相當(dāng)于5-1000μg的蛋白，血清蛋白常規(guī)電泳分離時(shí)，每厘米加樣線加樣量不超過(guò)1μL，相當(dāng)于60—80μg的蛋白質(zhì)。但糖蛋白和脂蛋白電泳時(shí)，加樣量則應(yīng)多些。對(duì)每種樣品加樣量均應(yīng)先作預(yù)實(shí)驗(yàn)加以選擇。點(diǎn)樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。24ppt課件⑷電量的選擇

⑷電量的選擇電泳過(guò)程應(yīng)選擇合適的電流強(qiáng)度，一般電流強(qiáng)度為0.4-0.5mA/cm寬膜為宜。電流強(qiáng)度高，則熱效應(yīng)高，尤其在溫度較高的環(huán)境中，可引起蛋白變性或由于熱效應(yīng)引起緩沖液中水分蒸發(fā)，使緩沖液濃度增加，造成膜片干涸。電流過(guò)低，則樣品泳動(dòng)速度慢且易擴(kuò)散。25ppt課件⑸染色液的選擇

⑸染色液的選擇對(duì)醋酸纖維素薄膜電泳后染色應(yīng)根據(jù)樣品的特點(diǎn)加以選擇。其原則是染料對(duì)被分離樣品有較強(qiáng)的著色力，背景易脫色；應(yīng)盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免引起醋酸纖維素薄膜溶解。應(yīng)控制染色時(shí)間。時(shí)間長(zhǎng)，薄膜底色深不易脫去；時(shí)間太短，著色淺不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時(shí)可進(jìn)行復(fù)染。26ppt課件⑹透明及保存

⑹透明及保存透明液應(yīng)臨用前配制，以免冰乙酸及乙醇揮發(fā)而影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前，薄膜應(yīng)完全干燥。透明時(shí)間應(yīng)掌握好，如在透明乙液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)則薄膜溶解，太短則透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液體石蠟中，使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟不易浸入，薄膜不易展平。27ppt課件【實(shí)驗(yàn)方法】1．準(zhǔn)備與點(diǎn)樣(1)將薄膜切成2.5cm×8cm的小片。在薄膜無(wú)光澤面(正面)的一端約2cm處用硬鉛筆劃一點(diǎn)樣線。(2)將薄膜無(wú)光澤面向下，置巴比妥緩沖中，使膜條自然浸濕。(3)將充分浸透的膜條取出，用濾紙吸去多余的緩沖液，把膜條置潔凈濾紙上。(4)用載玻片點(diǎn)樣。28ppt課件2．電泳

將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)，無(wú)光澤面(即點(diǎn)樣面)向下，點(diǎn)樣端置于陰極，槽架上以四層濾紙作橋墊，膜條與濾紙需貼緊，待平衡5min后通電，電壓為110V，電流為0.4～0.6mA/cm，通電1h左右關(guān)閉電源。29ppt課件3．染色