轉(zhuǎn)錄組+代謝組專題（四） 中藥活性物質(zhì)研究及文章分享

轉(zhuǎn)錄組+代謝組專題（四）|中藥活性物質(zhì)研究及文章分享一、背景概述中藥的研究一直離不開其核心的有效成分，雖然中藥已經(jīng)存在近6000年，但是對(duì)于有效成分的合成通路了解依舊甚少，而有效成分合成通路的研究對(duì)于提高植物體內(nèi)有效成分的含量以及體外建立基因工程通路具有重大意義，例如2015年利用轉(zhuǎn)錄組+代謝組技術(shù)完善桃兒七中鬼臼毒素的合成通路為體外建立完善的鬼臼毒素合成通路建立了夯實(shí)的基礎(chǔ)，因此利用現(xiàn)代研究技術(shù)助力藥用植物合成通路研究，成為科學(xué)家們關(guān)注的重點(diǎn)。中國(guó)女藥學(xué)家屠呦呦發(fā)現(xiàn)青蒿素獲2015年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)二、中藥活性物質(zhì)中藥活性物質(zhì)是中藥藥材中產(chǎn)生的對(duì)人有特殊活性的代謝產(chǎn)物，其在不同的物種、組織、生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期存在差異，大多數(shù)的活性物質(zhì)都是次生代謝產(chǎn)物，包括生物堿、黃酮、萜類、香豆素、木脂素等物質(zhì)類型，這類物質(zhì)是植物非生長(zhǎng)所必須的小分子有機(jī)化合物，其主要是由于植物生長(zhǎng)適應(yīng)外界復(fù)雜環(huán)境產(chǎn)生，對(duì)這些代謝產(chǎn)物的鑒定是中藥活性成分合成通路研究的基礎(chǔ)。表1不同中藥物種中活性物質(zhì)類型及功能三、中藥活性物質(zhì)合成相關(guān)基因和通路1.中藥活性物質(zhì)合成相關(guān)基因2.中藥活性物質(zhì)合成相關(guān)通路●喜樹堿合成通路●●萜類代謝物合成通路●●鬼臼毒素合成通路●四、經(jīng)典文獻(xiàn)解讀葛根中葛根素合成通路中的碳糖基化黃酮的分子機(jī)制期刊：TheplantJournal影響因子：IF=6.14發(fā)表時(shí)間：2017.01（一）研究背景類黃酮是一類通常以O(shè)-或C-糖苷形式存在的植物次級(jí)代謝產(chǎn)物。類黃酮-C-糖苷展現(xiàn)出多種生理功能，包括抗UV，防御病原體，抑制害蟲生長(zhǎng)和植物花色素的形成。它們也具有潛在的健康益處，如抑制癌癥發(fā)展，預(yù)防低血壓和肥胖。C-糖基轉(zhuǎn)移酶（C-glycosyltransferases，CGTs）是負(fù)責(zé)黃酮類化合物和異黃酮類C-糖苷合成的重要酶。類黃酮CGT已經(jīng)在幾種植物中識(shí)別到。但是目前為止，還沒有任何植物物種報(bào)道過編碼異黃酮CGT的基因。異黃酮C-糖苷的一個(gè)重要物質(zhì)是葛根素，是葛根中的主要藥用活性物質(zhì)。關(guān)于在葛根素生物合成期間發(fā)生的C-葡糖基化的知識(shí)仍然不足。（二）技術(shù)路線（三）研究結(jié)果1.葛根中UGT候選基因的分析基于葛根素主要在葛根的根部積累，所以選擇UGT候選基因的前提是在根部表達(dá)。對(duì)葛根葉片及根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，已獲得全部的UGT候選基因。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，有22條假定的全長(zhǎng)PIUGTs基因在葛根中顯著表達(dá)。對(duì)22條候選基因做系統(tǒng)發(fā)育樹分析這些UGT基因的相關(guān)性。22條基因根據(jù)生化活性被分為7類，其中只有PIUGT43在植物類黃酮C-糖基化類（簇6）（圖1）。并且，在22個(gè)假定PIUGTs基因中，只有PIUGT43在根中的表達(dá)水平與進(jìn)入異黃酮骨架的關(guān)鍵基因2-HIS的表達(dá)水平相符，其余基因表達(dá)量都比較低。以上數(shù)據(jù)表明葛根素合成通路的最好候選基因?yàn)镻IUGT43。PIUGT43基因與作者前期的文章中報(bào)道的GT03H24有83%的同源性。此外，系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，GT03H24是與植物2-羥基黃烷酮CGTs進(jìn)化枝中PlUGT43的親緣關(guān)系更近的UGT（圖1）。因此，作者決定研究GT03H24和PlUGT43在葛根素生物合成中的作用。圖1PIUGT43與其他UGTs基因的系統(tǒng)發(fā)育樹2.PIUGT43在葛根素合成通路中顯示CGT活性為了驗(yàn)證PIUGT43和GT03H24的生化特性，將其用HIS標(biāo)簽進(jìn)行純化并在大腸桿菌中表達(dá)。在UDP-葡萄糖的存在下，首先用大豆黃素和2-羥基異黃烷酮（它們是葛根素生物合成最可能的底物）測(cè)試純化的重組蛋白的活性。在不存在重組蛋白的情況下進(jìn)行對(duì)照測(cè)定。通過加入甲醇停止反應(yīng)。當(dāng)使用大豆黃素作為底物時(shí)，在與PlUGT43的反應(yīng)中產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于葛根素的產(chǎn)物（峰1），但在對(duì)照測(cè)定中不產(chǎn)生（圖2a）。峰1的保留時(shí)間和MS/MS信號(hào)離子基本上與葛根素標(biāo)準(zhǔn)品相同（圖2c，d）。與對(duì)照相比，以2-羥基異黃烷酮為底物時(shí)，產(chǎn)生極少量葛根素，有可能是2-羥基異黃烷酮自發(fā)脫水為大豆黃素的結(jié)果，因此說明，PlUGT43不能將2-羥基異黃烷酮轉(zhuǎn)化。另外，以大豆黃素或2-羥基異黃烷酮為底物的情況下，GT03H24未顯示出活性。因此，體外驗(yàn)證表明，PlUGT43具有控制葛根素生物合成的能力。圖2重組PIUGT43催化大豆苷元和染料木黃酮的C-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)3.PlUGT43對(duì)異黃酮顯示嚴(yán)格的底物專一性使用UDP-葡萄糖作為蔗糖供體，測(cè)試PIUGT43在葛根素生物合成中的可能底物（圖3a）。體外測(cè)定以及LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，除了大豆黃素之外，PIUGT43僅對(duì)染料木黃酮有活性，并未檢出對(duì)其他底物有活性。PIUGT43將染料木黃酮轉(zhuǎn)化為峰2中的物質(zhì)。峰2的MS1分析顯示產(chǎn)物比染料木黃酮的分子量多162個(gè)Da，表明產(chǎn)物是染料木素單葡糖苷。峰2的MS/MS碎片梨子的信號(hào)為313和283，分別丟失了120和150Da（圖2e和3f）。信號(hào)產(chǎn)物質(zhì)荷比313缺失了120的情況下，是C-糖基化的特征，我們根據(jù)這個(gè)特征推斷峰2的物質(zhì)是C糖基化黃酮。在黃酮的C-糖苷中，先前已經(jīng)報(bào)道了6-C-或8-C-糖苷共軛物，MS/MS分析是區(qū)分C6或C8糖苷的最佳技術(shù)之一。例如，當(dāng)以正模式進(jìn)行MS/MS分析時(shí)，通常僅在C8-異構(gòu)體的碎裂中觀察到[M+H-90]次要離子產(chǎn)物;相反，[M+H-4H2O]片段通常僅在C6-糖苷的碎裂中發(fā)現(xiàn)。PlUGT43與任何上述底物的反應(yīng)中未檢測(cè)到O-葡糖苷，表明PlUGT43不具有O-糖基化活性。因此，這些結(jié)果表明PlUGT43對(duì)類異黃酮具有嚴(yán)格的底物特異性。相反，GT03H24在本研究中沒有顯示任何測(cè)試的底物的活性。圖3PlUGT43對(duì)異黃酮顯示出底物特異性4PlUGT43的過度表達(dá)導(dǎo)致大豆中產(chǎn)生葛根素大豆中可以產(chǎn)生異黃酮通路上游的核心代謝產(chǎn)物大豆黃素，但是未表現(xiàn)出異黃酮碳糖基化的活性，并且文章中也未報(bào)道過大豆中有碳糖基化黃酮。在大豆中過表達(dá)PlUGT43基因來檢測(cè)PlUGT43在植物中的酶功能。圖4所示，LC-MS僅在轉(zhuǎn)化PlUGT43的大豆根部檢測(cè)到正離子模式下有一個(gè)417的母離子的峰（峰1），峰1與葛根素的二級(jí)譜信息一致，表明轉(zhuǎn)入PlUGT43基因后，大豆中可以產(chǎn)生碳糖基化黃酮。圖4葛根中的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶（PIUGT43）表現(xiàn)出對(duì)異黃酮的偏好性（四）研究結(jié)果葛根素是葛根中特有的代謝產(chǎn)物，在豆類物種中都不產(chǎn)生，本文通過轉(zhuǎn)錄組分析，找到控制葛根素合成的候選基因，并利用代謝組的檢測(cè)方法去驗(yàn)證基因的功能，從而發(fā)現(xiàn)了控制葛根素合成的關(guān)鍵基因，并且將基因轉(zhuǎn)入大豆中，實(shí)現(xiàn)了體外葛根素的合成。參考文獻(xiàn)：WangXin,LiChangfu,ZhouChene