重要動物組織切片制作技術(shù)

重要動物組織切片制作技術(shù)1第1頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、擊頭法如大、小鼠，可用重物擊頭后部或?qū)⑵漕^后部猛撞桌沿，最好一擊而死。

4、斷頭法

青蛙、小鼠等小動物，可用剪刀剪去其頭部，較大動物如兔子等，可用斧頭迅速砍頭致死。

5、股動脈放血法

動物經(jīng)吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切開股動脈放血。

注意：上述各法，應(yīng)根據(jù)制片需要選用，如空氣栓塞法不宜用作血管注射標(biāo)本的制作；乙醚麻醉對丘腦下神經(jīng)部分泌物染色標(biāo)本不利；股動脈放血法有利于腸系膜鋪片的制作。2第2頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、取材注意事項(xiàng)

1、材料新鮮最好是動物心臟還在跳動時取材，立即投入固定液內(nèi)，臟器的上皮組織最易變質(zhì)，應(yīng)爭取在死后半小時內(nèi)處理完畢。

2、組織塊力求小而薄

組織塊的厚度以不超過5毫米為宜，較理想的厚度為2毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均勻的滲入組織塊內(nèi)部。

3、勿使組織塊受擠壓

切取組織塊時刀剪要鋒利，不要來回挫動，夾取組織時切勿猛壓，取材時組織塊可稍大，以便固定后修塊。3第3頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

4、盡量保持組織的原有形態(tài)新鮮組織經(jīng)固定后，或多或少產(chǎn)生收縮現(xiàn)象，為此可將組織展平，以盡可能維持原形。

5、要熟悉取材部位

要能準(zhǔn)確的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰島較多的胰腺尾部；肺應(yīng)取有細(xì)支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。

6、動物品種的選擇

如觀察肥大細(xì)胞，以大、小鼠皮下組織及腸系膜、大網(wǎng)膜鋪片為佳，欲觀察運(yùn)動終板，可用小鼠的肋間肌等。4第4頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

7、選好組織塊的切面熟悉某些器官組織成分安排，然后決定其切面的走向；如一長管狀器官以橫切面較好。

8、保持材料的清潔

組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等，可用生理鹽水沖洗，然后再入固定液，但要注意防止組織損傷。

9、切除不需要的部分

特別是組織周圍的脂肪等，應(yīng)盡可能清除掉，否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來一些不必要的問題。5第5頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、組織固定法

（一）、固定的方法

1、小塊組織固定法：從人體和動物取下的小塊組織，立即置入液態(tài)固定劑中進(jìn)行固定，這是應(yīng)用最廣泛最經(jīng)常的方法。

2、注射、灌注固定法：某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內(nèi)部或需要對整個臟器或整個動物進(jìn)行固定。這時宜采用注射固定法，將固定液注入血管，經(jīng)血管分支到達(dá)整個組織和全身，從而得到充分的固定。

3、蒸汽固定法:比較細(xì)小而薄的標(biāo)本，可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細(xì)胞涂片以及某些薄膜組織的固定。6第6頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）、固定的目的

1、迅速阻止組織、細(xì)胞的死后變化，防止自溶與腐敗，使之盡量保持生前的狀態(tài)與結(jié)構(gòu)。

2、使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)，以保持其原有狀態(tài)。

3、使組織內(nèi)各種物質(zhì)成分產(chǎn)生不同的折光率，以便染色后易于鑒別和觀察。

7第7頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

4、使組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞。

5、使不同組織成分對染料有不同的親和力，經(jīng)染色處理后易于辨認(rèn)。

6、防止細(xì)胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態(tài)結(jié)構(gòu)。

7、使組織塊硬化，便于制作薄片。8第8頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（三）、注意事項(xiàng)及影響固定的因素

1、組織塊不易過大，一般以厚度5mm，長寬不超過15×15mm。

2、固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜。

3、必須選擇滲透力強(qiáng)，又不使組織過渡收縮或膨脹的試劑作為固定液。

4、有的固定劑是由氧化劑與還原劑混合而成，如甲醛（還原劑）與重鉻酸鉀（氧化劑）混合成的Helly液等。9第9頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

5、固定時間的長短視固定劑的不同要求而定，也與氣溫、組織塊的大小有關(guān)。溫度高時則時間縮短，組織塊過大則應(yīng)延長固定時間。

6、軟組織或較大組織可先經(jīng)2-3小時固定后再修整成小塊重新投入新配制的固定液內(nèi)繼續(xù)固定。

7、特殊要求的組織，常需要特殊的固定液，所以，取組織之前應(yīng)做好準(zhǔn)備。如各種神經(jīng)組織因顯示內(nèi)容不同，需不同的固定液與固定方法。10第10頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（四）、固定液

1、固定液種類：一類是單純固定液，即只有一種試劑；另一類是混合固定液，由兩種或兩種以上試劑組成。作為較好的固定液，應(yīng)有下列特性，首先，有強(qiáng)滲透力，能迅速的滲入組織內(nèi)部；其次，不使組織過渡收縮或膨脹，并能使組織內(nèi)欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質(zhì)；最后，能使組織達(dá)到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強(qiáng)的親和力。

11第11頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、單純固定液（1）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，又可作為單純固定液使用。用于固定時以80%-95%濃度為好。缺點(diǎn)是經(jīng)酒精固定的組織容易變硬，對組織收縮較大。（2）甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的福爾馬林，常用濃度為10%，指以10ml的商品甲醛（37%-40%甲醛水溶液）加入90ml水配成的，此液實(shí)際上只有4%的甲醛。12第12頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）醋酸：亦名乙酸，能與酒精、水、氯仿等多種試劑混合，故為許多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小組織僅1h即可，對組織和細(xì)胞有膨脹作用，且不能凝固細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)，一般與引起收縮的固定液一起使用，以達(dá)到平衡目的。

（4）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白質(zhì)，對脂肪、類脂無作用，滲透力較弱，很少單獨(dú)使用，固定后收縮明顯，用含苦味酸的固定液固定組織一般不宜超過24小時。13第13頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（5）重鉻酸鉀：其穿透速度快，對組織收縮小并稍有膨脹，重鉻酸鉀常備水溶液為3-5%。其混合固定液，如Zenker液、Helly液及Regaud液等被廣泛用于組織學(xué)，凡經(jīng)重鉻酸鉀、鉻酸、鉻酸鹽固定的組織，必須以流水沖洗后方能轉(zhuǎn)入脫水劑。

（6）鋨酸：鋨酸一般只用于某些特殊染色或電鏡切片染色或固定，配制時要用洗滌干凈的玻塞棕色瓶，最好用雙蒸水配制，鋨酸穿透力弱，且易使組織硬脆，因此它固定的組織必須小而薄，體積最好在3×3×2mm以內(nèi)。14第14頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（7）鉻酸：鉻酸能沉淀蛋白質(zhì)，適用于核蛋白的固定，并能增強(qiáng)核的染色能力，穿透速度慢，一般組織塊的固定，需經(jīng)12-24h，硬化程度中等，收縮顯著，除用作固定液外，萬分之一的鉻酸水溶液，可制作分離標(biāo)本。

（8）丙酮：丙酮能使蛋白質(zhì)沉淀，滲透力強(qiáng)，但對核固定欠佳，且使組織劇烈收縮。廣泛用于組織化學(xué)中酶的固定，其作用基本與酒精相同。（9）三氯醋酸：作用與醋酸相似，很少單獨(dú)使用，在混合固定液中對組織起膨脹作用。15第15頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、常用混合固定液（1）Bouin液：飽和苦味酸水溶液：75ml；甲醛水溶液（40%）：25ml；冰醋酸：5ml。三者在配方中的實(shí)際比例為1：5：15，為實(shí)驗(yàn)室常用固定劑，其滲透力強(qiáng)，對組織固定均勻且收縮較小，染色效果好。冰醋酸固定染色質(zhì)，苦味酸使組織適當(dāng)硬化，甲醛水溶液調(diào)節(jié)兩種試劑對組織的膨脹作用。其固定時間以12-24h為宜。

16第16頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）Carnoy液：冰醋酸一份，氯仿三份，無水酒精六份。此液浸透速度快，固定時間不宜過長，小塊組織2-3小時即可，固定后直接入無水酒精脫水。常用于糖原及尼氏體固定。一般固定時須放在冰箱中，低溫環(huán)境可明顯減少收縮作用。

（3）中性甲醛液：最常用的固定液之一，配方:40%甲醛120ml,蒸餾水880ml，磷酸二氫鈉4g，磷酸氫二鈉13g，pH7.0。（4）中性緩沖甲醛液：為免疫組織化學(xué)最常用的固定液。固定時間24h為宜，配方：40%甲醛10ml，0.01mol/LpH7.4的PBS90ml17第17頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第二章：固定后處理及切片

一、洗滌與修切

1、水洗法一般常用流水沖洗，凡用含鉻或鋨的固定液固定的組織塊，必須用流水沖洗24h左右。常用的固定液為10%的甲醛水溶液，也必須用流水沖洗，一般時間也為24h左右，固定時間長的標(biāo)本，沖洗時間也應(yīng)延長。

2、酒精洗滌法

凡含苦味酸或酒精的固定液固定的組織塊，大多采用酒精洗滌，如苦味酸影響著色，但易溶于70%酒精。18第18頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、取材注意事項(xiàng)

1、材料新鮮最好是動物心臟還在跳動時取材，立即投入固定液內(nèi)，臟器的上皮組織最易變質(zhì)，應(yīng)爭取在死后半小時內(nèi)處理完畢。

2、組織塊力求小而薄

組織塊的厚度以不超過5毫米為宜，較理想的厚度為2毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均勻的滲入組織塊內(nèi)部。

3、勿使組織塊受擠壓

切取組織塊時刀剪要鋒利，不要來回挫動，夾取組織時切勿猛壓，取材時組織塊可稍大，以便固定后修塊。19第19頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、脫水與透明

（一）、脫水的意義與目的

組織經(jīng)固定和水洗后含大量水分，水與石蠟不能混合，因此在浸蠟和包埋前，必須進(jìn)行脫水，脫水是借某些溶媒置換組織內(nèi)水分的過程。脫水時必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉(zhuǎn)入高濃度脫水劑，以防組織過度收縮而變形，或脫水不完全而影響制片效果。脫水劑必須具有下列特性:脫水劑能與水按比例混合；高濃度，一般指不含水分；脫水劑也能與透明劑混合。20第20頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、脫水劑（1）酒精：是最常用的脫水劑，脫水能力強(qiáng)，并能使組織硬化。其主要缺點(diǎn)是易使組織收縮、變脆，故應(yīng)勿直接用高濃度酒精，一般從70%酒精開始；脫水時間勿過長。在70%可長時間保存。（2）丙酮：脫水作用比酒精強(qiáng)，但對組織塊的收縮較大，價(jià)格較高，主要用于快速脫水或固定兼脫水，脫水時間一般為1-3h左右。21第21頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）正丁醇和叔丁醇：正丁醇是無色液體，脫水能力較弱，可和水、酒精和石蠟互溶，因此這種脫水的組織塊可直接浸蠟和包埋。叔丁醇是目前常用的一種脫水劑，它不易使組織收縮或變硬，且脫水后不經(jīng)透明直接浸蠟，電鏡標(biāo)本制作時常用作中間脫水劑。（4）其余脫水劑：還可以用作脫水劑的有：異丙醇、還氧己烷、四氫呋喃、環(huán)己酮和松脂醇等，但由于某些原因，現(xiàn)在都不常用。22第22頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、透明或媒浸（1）二甲苯：是最常用的常規(guī)透明劑，它對組織的收縮性強(qiáng)，易使組織變硬變脆，在二甲苯中一般30min即可使組織透明，組織塊可先經(jīng)過無水酒精-二甲苯混合液處理，再浸入二甲苯。也常用于切片染色后透明，且不會使染料退色。（2）苯和甲苯：對組織收縮性較小，與二甲苯相比不易使組織變脆，但透明速度慢且揮發(fā)快，適用于處理致密結(jié)締組織、肌肉及腺體等組織的透明。23第23頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）氯仿：不易使組織變硬變脆，但透明能力比二甲苯差，用作透明劑時，多用于大塊組織的透明（1cm），而且在容器內(nèi)放置無水硫酸銅。

（4）其他透明劑：四氯化碳、苯甲酸甲酯和水楊酸甲酯、香柏油（皮膚、子宮、肌肉和肌腱）、松油醇、丁香油、冬青油與苯胺油和火棉膠包埋的媒浸液等。24第24頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、浸蠟組織經(jīng)透明后，在溶化的石蠟內(nèi)浸漬的過程稱浸蠟。一般用于浸蠟的石蠟熔點(diǎn)為52-56℃，在夏天較熱時一般用高熔點(diǎn)石蠟，在冬天氣溫較低時用低熔點(diǎn)石蠟，主要是有利于切片的制作。時間不易過長，否則容易造成組織脆硬，時間不足，也難制作良好的切片。

25第25頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、組織的包埋與包埋方法組織塊經(jīng)過浸透劑浸透后，再用包埋劑（石蠟、火棉膠、碳蠟和樹脂等）包起的過程稱包埋。不同的包埋方法有不同的要求，包埋后均可制成組織的塊。經(jīng)過包埋后，可使組織達(dá)到一定的硬度和韌度，有利于切成薄片。26第26頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（一）、石蠟包埋法

石蠟包埋法為組織學(xué)技術(shù)中最常用的一種包埋法。石蠟具有不同的熔點(diǎn)，夏天一般用50℃以上熔點(diǎn)（硬蠟）石蠟包埋，冬天用50℃以下熔點(diǎn)（軟蠟）石蠟包埋，軟的組織用軟蠟包埋，硬的組織用硬蠟包埋，一般常用的包埋熔點(diǎn)使52-56℃，如果需要切4微米以下的切片，則用56-60℃的石蠟，較厚的切片則用熔點(diǎn)為52-54℃的石蠟。新蠟必須在溫箱內(nèi)溶化一次，以使其所含的揮發(fā)性物質(zhì)蒸發(fā)，無論新蠟和舊蠟都必須加熱過濾后再包埋。27第27頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）、石蠟包埋法包埋過程

組織塊透明后，即可放入已熔的石蠟內(nèi)浸蠟；一般厚度約5mm的實(shí)質(zhì)性器官，總的浸蠟時間約2-3h，均在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行。較理想的的浸蠟溫度是石蠟剛?cè)芑臏囟?，或在蠟杯底部尚殘留一小部分未熔完蠟時的溫度，浸蠟完成后，即做成包有組織的蠟塊。包埋蠟塊的器材有專用的包埋框，也有自己制作的包埋盒，只要是具有一定形狀的容器，我們都可以把它用作包埋盒。包埋的具體過程詳述。28第28頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（三）、其他包埋法

除上述常用包埋法以外，還有其他一些包埋方法，如塑料包埋法、碳蠟包埋法、明膠包埋法、松脂醇包埋法、甲基丙烯酸甲酯包埋法、雙重包埋法及二甲氧基丙烷石蠟包埋法等。29第29頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（五）、火棉膠包埋法

火棉膠常用于大塊組織的包埋。課避免纖維組織和肌肉組織的過度硬化，減少纖維組織的收縮和扭轉(zhuǎn)，利于保持原有的組織結(jié)構(gòu)。（六）、樹脂包埋法樹脂包埋法適用于不脫鈣骨髓活檢組織，肝、腎穿刺活檢和淋巴組織等，可觀察細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)。樹脂選用親水性甲基丙烯酸-2-羥基乙基酯，組織不需脫水，對細(xì)胞形態(tài)影響輕。30第30頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、切片石蠟切片是以石蠟作為組織的支持媒介制作切片的。切片前的處理：

A:修切蠟塊：切片前應(yīng)先修塊，即切去組織周圍過多的石蠟，一般留下至少約2mm寬度的蠟邊為宜。注意蠟塊不能留得太窄，在切片時易損壞組織；蠟邊不能留得太多，否則影響展片。室溫過高時，可將修好的蠟塊放到冰箱中冷卻一定時間。31第31頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

B:切片用品準(zhǔn)備（1）切片刀：預(yù)先磨好切片刀備用或切片前更換新的一次性切片，切片刀對組織塊的傾角非常重要，一般在10°以內(nèi)，過小則組織塊不能先與刀刃的刀口接觸，過大時，使刀口刮組織蠟塊表面，切片易碎。（2）載物片：載物片經(jīng)清潔液、95%乙醇處理后備用。（3）展片儀：加入溫水，接通電源，調(diào)整溫度（4）其他用品：準(zhǔn)備好毛筆、記號筆、鑷子、等。32第32頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

六、粘片粘片的目的是將石蠟切片粘附在載玻片上，借水的張力和一定的溫度，使略皺的蠟片伸展平整，以便染色和鏡檢。

粘片有兩種方式：水撈法——將一個盛水的容器加熱至35-40°，將蠟帶光澤面向下鋪于溫水上，待蠟片伸展平整后，即可用長鑷子分離每一個蠟片，再用載玻片伸入水中，從蠟片下面撈起，直立玻片使水流掉并置溫箱內(nèi)烘干。33第33頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

干粘法——可將已經(jīng)切離的蠟片單個的放在加有數(shù)滴蒸餾水的載玻片上，然后在酒精燈上搖晃烘烤，此時應(yīng)注意控制水的溫度勿使過高，待蠟片平整后，傾去玻片上的水，用細(xì)針調(diào)正蠟片的位置，繼續(xù)在酒精燈上烘烤至蠟片呈半透明狀為止，以后在溫箱內(nèi)烘干即可。當(dāng)蠟片已放在有水的載玻片上后，可不經(jīng)酒精燈烘烤，而在調(diào)好溫度的電熱板上烘烤。34第34頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月第三章：染料、常用染液及常規(guī)蘇木素-伊紅染色法

一、染料性質(zhì)

染料：含有發(fā)色團(tuán)的有機(jī)化合物鹽類物質(zhì)溶解于水并具有電荷組織著色堿性染料：具有陽電荷。含氨基（-NH2)、二甲氨基〔-N(CH3)2〕等堿性助色團(tuán)。酸性染料：具有陰電荷。含羧基（-OOH）、羥基（-OH）或磺基（-SO3H）等酸性助色團(tuán)。35第35頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、染色原理：

嗜堿性：細(xì)胞和組織中的酸性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)（嗜堿性物質(zhì)）與堿性染料親和力強(qiáng)。

嗜酸性：細(xì)胞和組織中的堿性物質(zhì)或結(jié)構(gòu)（嗜酸性物質(zhì)）與酸性染料親和力強(qiáng)。

中性：與兩種染料的親和力均不強(qiáng)。在組織染色中所謂的“嗜酸性”及“嗜堿性”一詞，是說該物質(zhì)易被酸性或堿性染料所染，而細(xì)胞本身的酸性或堿性正與其相反。36第36頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、常用染液及染色法：

1、細(xì)胞核常用染色法

A：蘇木精-蘇木精是從蘇木用乙醚連續(xù)提取的淡黃色或棕黃色結(jié)晶，溶于酒精，甘油及熱水中。蘇木精不能單獨(dú)使用，主要是對組織的親和力小，欲使其成為一種染料，必須在蘇木精溶液中加入復(fù)鹽和氧化劑。配制蘇木精的常用氧化劑有過錳酸鉀、氧化汞、碘酸鈉及過氧化氫等，或?qū)⑴渲煤玫奶K木精在空氣中自然氧化，所以放置時間較長的蘇木精染液染色效果較好。37第37頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月B：硫堇或甲苯胺藍(lán)染色法-切片入1%硫堇或甲苯胺藍(lán)水溶液染12-24h，然后95%酒精分色，結(jié)果：核藍(lán)色，粘液，軟骨基質(zhì)，肥大細(xì)胞顆粒呈藍(lán)紫色。

C：堿性品紅-堿性品紅對顯示多數(shù)糖類及彈性纖維效果良好，也可顯示核酸。作為細(xì)胞核的一般染色，可用0.5-1%水溶液染色數(shù)分鐘。

D：媒染染料細(xì)胞核染色法-指在配制染料時需加入一些媒染劑如氯化鋁，鋁礬等類似的復(fù)鹽才易著色。如天青石藍(lán)B染色法：天青石藍(lán)B0.1克，鐵礬5克，蒸餾水100ml，混合后煮沸數(shù)分鐘，冷后過濾，切片染2-3分鐘，此液可代替蘇木精染細(xì)胞核。38第38頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月2、細(xì)胞質(zhì)常用染色法

A：伊紅-伊紅種類很多，但常用為伊紅B和伊紅Y。同時一般均配成0.5-1%水溶液或酒精溶液，在染藍(lán)色核后，經(jīng)伊紅復(fù)染，最后用95%酒精分色。

B：酸性品紅-酸性品紅常用于結(jié)締組織染色，染色后色澤鮮艷，缺點(diǎn)是易于退色，不易長久保持。

C：藻紅-使用法與伊紅相同。

D：焰紅-使用法與伊紅相同。39第39頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

四、蘇木精-伊紅染色法：

為最常用及最普通的染色方法。一般觀察的組織切片都用本法染色。簡稱：HE染色。

蘇木精伊紅嗜堿性結(jié)構(gòu)：細(xì)胞核粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)游離核糖體等嗜酸性結(jié)構(gòu)：細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)溶酶體、線粒體等細(xì)胞器膠原纖維等40第40頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

五、染色后透明封片：

經(jīng)過HE染色后，通過各梯度酒精后進(jìn)入二甲苯溶液，其主要作用是透明組織，透明后在組織塊處滴上樹膠后用蓋玻片分片，自然干燥后即可在顯微鏡下觀察。

41第41頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月石蠟切片法

組織經(jīng)石蠟包埋后制成的蠟塊，用切片機(jī)制成切片的過程稱為石蠟切片法。一般切5-8微米的厚度，要觀察病變的連續(xù)性可制作連續(xù)切片。除此之外，石蠟包埋的組織塊便于長期保存，因此，石蠟切片仍是目前各種切片制作方法中最常用，最普遍的一種方法。第四章：石蠟切片法制作過程42第42頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

切片法主要步驟

1、取材與固定

（1）取材：從動物體取下所需的器官材料。取材的動物要健康，材料愈新鮮愈好，應(yīng)在致死后立即取材，防止組織細(xì)胞自溶變性；取材的器械要鋒利；所取材料力求小而?。ㄒ圆怀^0.5cm為宜），不能擠壓和損傷。43第43頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）固定：將所取的材料立即投入固定液中，目的是使組織蛋白迅速凝固，使細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和成分不再發(fā)生變化，保持組織細(xì)胞與活體相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，固定后的組織塊變硬，便于進(jìn)一步處理。常用的固定劑有甲醛、乙醇、苦味酸或混合固定液。實(shí)驗(yàn)室常用Bouin固定液，固定時間為12～24小時，其固定的組織塊不需進(jìn)行水洗，可直接進(jìn)行脫水。44第44頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、脫水與透明

（1）脫水：固定后的組織塊內(nèi)含有的大量水分要徹底脫去，以便石蠟的浸入。常用的脫水劑為乙醇，脫水過程必須循序漸進(jìn)，從低濃度開始，逐步升高，使組織塊中的水分逐漸被乙醇所取代。具體操作為：Bouin固定液固定的組織塊可直接進(jìn)入70％的乙醇進(jìn)行脫水，時間12小時左右。（若材料暫不制片，可保存于70％乙醇中。）然后將組織塊依次移入85％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各8-12小時，→95％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各2小時，→100％乙醇（Ⅰ）、（Ⅱ）各1小時。因無水乙醇對組織有脆化作用，故在無水乙醇中時間不能超過2小時。

45第45頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）透明：由于乙醇與石蠟不能相溶，故浸蠟前要對脫水后的組織塊進(jìn)行透明。常用透明劑有二甲苯、氯仿、苯、香柏油或冬青油等，透明劑能同與乙醇和石蠟相溶，并能增強(qiáng)組織塊的折光系數(shù)，故透明后的組織塊呈半透明狀。使用二甲苯作透明劑的透明過程為：將脫水后的組織塊放入無水乙醇與二甲苯混合液（1:1）中30分鐘，再移入二甲苯中15-20分鐘。

46第46頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、浸蠟與包埋

（1）浸蠟：將透明后的組織塊置于剛過熔點(diǎn)的熔化石蠟中浸漬，使石蠟逐漸滲入并完全置換出透明劑。過程為：先將透明的組織塊移入二甲苯與石蠟混合液（1:1）中，在60℃溫箱中放置30分鐘，再移入熔化的石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）中，在溫箱中每級各1小時。（2）包埋：將浸蠟后的組織塊置于盛有熔化石蠟的模具中，并使之凝固成蠟塊。47第47頁，課件共52頁，創(chuàng)作于2023年2月4、切片與貼片

（1）切片：將修整后的蠟塊夾在切片機(jī)的固定器內(nèi)，使蠟塊的被切面與刀口平行，刀和蠟塊成一斜角，以