GM-CSF對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響及VEGF的作用-課件

GM-CSF對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響及VEGF的作用

1ppt課件前言2ppt課件

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)一直被認(rèn)為是一種慢性進(jìn)展的血管壁脂質(zhì)沉積性疾病。近些年的研究逐漸闡明了炎癥在AS病理過(guò)程中的重要作用。炎癥學(xué)說(shuō)認(rèn)為，炎癥可導(dǎo)致不穩(wěn)定斑塊形成，斑塊破裂甚至急性冠狀動(dòng)脈綜合癥（acutecoronarysyndrome,ACS）等臨床嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。而不穩(wěn)定斑塊的重要特征之一就是斑塊內(nèi)血管新生。斑塊內(nèi)血管新生與斑塊不穩(wěn)定之間的關(guān)系已逐漸成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

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血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的過(guò)程，見(jiàn)于許多生理和病理情況。血管新生的過(guò)程極其復(fù)雜，受到促進(jìn)血管生成因子和抑制血管生成因子的共同調(diào)控。4ppt課件AS斑塊內(nèi)的新生血管主要來(lái)自外膜血管滋養(yǎng)管（vasavasorum）。通過(guò)新生血管，血液中的血漿脂蛋白和大量炎細(xì)胞流入斑塊內(nèi)，加重炎癥反應(yīng)。新生血管本身無(wú)平滑肌和周細(xì)胞支持，管壁薄弱，易于引起斑塊內(nèi)出血、斑塊破裂甚至一系列臨床嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。5ppt課件實(shí)驗(yàn)?zāi)康?ppt課件

研究炎性因子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,

GM-CSF）對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)的作用。探討GM-CSF和VEGF與AS斑塊穩(wěn)定性及病變進(jìn)展之間的關(guān)系。7ppt課件實(shí)驗(yàn)方法8ppt課件原代培養(yǎng)HUVECs

應(yīng)用Matrigel建立穩(wěn)定的血管形成的體外培養(yǎng)體系。

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Matrigel的用法：

Matrigel凍存于-20℃，使用前置于4℃

過(guò)夜，融化成黃色膠狀液體。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究所得的經(jīng)驗(yàn)：用預(yù)冷的微量進(jìn)樣器在短時(shí)間內(nèi)迅速加入預(yù)冷的24孔板中，每孔80μl/cm2（厚度約為0.5mm）。輕輕搖晃培養(yǎng)板，使其鋪平。最后將培養(yǎng)板放入37℃孵育箱內(nèi)，30分鐘后即可使用。10ppt課件

HUVECs原代培養(yǎng):

采用本實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的Jaffe氏培養(yǎng)法。取健康新生兒臍帶（最好不超過(guò)12h），PBS沖洗干凈，0.25%胰酶消化（37℃，5分鐘），用含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，收集消化液。離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘）。棄上清，用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以5.0×105/cm2接種于涂有Matrigel的培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),24小時(shí)后換液。11ppt課件實(shí)驗(yàn)分組

GM-CSF作用的檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)因素濃度和不同的作用時(shí)間，分別設(shè)計(jì)成濃度效應(yīng)組和時(shí)間效應(yīng)組。

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濃度效應(yīng)組：正常對(duì)照組（無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液）、rhGM-CSF不同濃度組（25、50、100ng/ml），分別作用48h。時(shí)間效應(yīng)組：取相同濃度rhGM-CSF（100ng/ml）不同作用時(shí)間組（12、24、48h）。13ppt課件

VEGF作用的檢測(cè)正常對(duì)照組（無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液）、rhGM-CSF（100ng/ml）組、rhGM-CSF（100ng/ml）+

VEGF165（10ng/ml）組，分別作用24h。14ppt課件相差顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組血管腔形成情況。各實(shí)驗(yàn)組用95%冰乙醇固定，4℃過(guò)夜。用CD34免疫細(xì)胞化學(xué)方法（SP法）顯示各組血管形態(tài)。15ppt課件計(jì)數(shù)管腔數(shù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組在40倍鏡下選取3處血管密集的視野，100倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)視野的管腔數(shù)。應(yīng)用SPSS、microsoftexcel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。16ppt課件實(shí)驗(yàn)結(jié)果17ppt課件Matrigel對(duì)體外培養(yǎng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的誘導(dǎo)作用

本研究提示，應(yīng)用Matrigel可在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu)。內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)后18小時(shí)開(kāi)始形成管腔結(jié)構(gòu)，24小時(shí)即可建立穩(wěn)定的血管形成的體外模型。18ppt課件

圖1在普通明膠上培養(yǎng)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)形態(tài)，內(nèi)皮細(xì)胞呈短梭形或多角形，達(dá)到亞融合（倒置相差顯微鏡x100）

19ppt課件圖2Matrigel誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在24小所建立的血管形成的體外模型（倒置相差顯微鏡x100）20ppt課件圖3Matrigel誘導(dǎo)培養(yǎng)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在24小時(shí)所建立的血管形成的體外模型（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）21ppt課件

本研究提示，與在普通明膠上生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞相比，在Matrigel上生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期較短，并且細(xì)胞不發(fā)生融合，而是形成相互連接的毛細(xì)血管樣的血管網(wǎng)絡(luò)。細(xì)胞間界限不清。22ppt課件不同濃度GM-CSF作用的檢測(cè)23ppt課件圖4正常對(duì)照組作用48小時(shí)形成的管腔數(shù)較少（倒置相差顯微鏡x100）

24ppt課件圖5rhGM-CSF（25ng/ml）作用48小時(shí)形成的管腔數(shù)有所增多（倒置相差顯微鏡x100）25ppt課件圖6

rhGM-CSF（50ng/ml）作用48小時(shí)形成的管腔數(shù)進(jìn)一步增多（倒置相差顯微鏡x100）26ppt課件

圖7rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小時(shí)形成明顯的管腔結(jié)構(gòu)，連接成血管網(wǎng)絡(luò)（倒置相差顯微鏡x100）27ppt課件

圖8

不同濃度rhGM-CSF對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響（各組間P值均小于0.001）28ppt課件相同濃度GM-CSF不同作用時(shí)間的檢測(cè)29ppt課件圖9

rhGM-CSF（100ng/ml）作用12小時(shí)形成的管腔數(shù)較少（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）30ppt課件圖10

rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小時(shí)形成的管數(shù)有所增多（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）31ppt課件

圖11rhGM-CSF（100ng/ml）作用48小時(shí)形成明顯的管腔結(jié)構(gòu)，連接成血管網(wǎng)絡(luò)（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）32ppt課件圖12相同濃度rhGM-CSF作用不同時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響（各組間P值均小于0.001）33ppt課件VEGF作用的檢測(cè)34ppt課件圖13正常對(duì)照組作用24小時(shí)形成的管腔數(shù)較少（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）35ppt課件圖14rhGM-CSF（100ng/ml）作用24小時(shí)形成的管腔數(shù)有所增多（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）36ppt課件

圖15rhGM-CSF（100ng/ml）與VEGF165（10ng/ml）共同作用24小時(shí)形成明顯的管腔結(jié)構(gòu)，連接成血管網(wǎng)絡(luò)（CD34免疫細(xì)胞化學(xué)染色x100）37ppt課件圖16VEGF對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響（各組間P值均小于0.001）38ppt課件討論39ppt課件AS的炎癥機(jī)制和斑塊的不穩(wěn)定性

炎癥學(xué)說(shuō)認(rèn)為，AS是一種特殊的慢性炎癥性疾病，表現(xiàn)為一系列高度特異的分子細(xì)胞反應(yīng)，每一種特異性病變都表現(xiàn)為動(dòng)脈炎癥過(guò)程的不同階段。在病變的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，脂蛋白、細(xì)胞成分（單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、ECs、SMCs）及ECM、炎性因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子相互作用。如果這個(gè)過(guò)程不減弱或過(guò)度發(fā)展，將導(dǎo)致晚期更為復(fù)雜的病變。40ppt課件

不穩(wěn)定AS斑塊的病變特征：①偏心的管腔周緣；②含有厚度易變或較薄的纖維帽；③脂質(zhì)豐富；④局部巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)、活化；⑤新生微血管增多等。41ppt課件血管新生的過(guò)程及其調(diào)節(jié)

血管新生是由既存的血管以出芽的方式形成新血管的生物學(xué)過(guò)程。

一般來(lái)講，血管新生見(jiàn)于胚胎發(fā)育晚期及個(gè)體出生后。血管新生亦可見(jiàn)于許多病理情況，如缺血、創(chuàng)傷修復(fù)、AS、腫瘤、糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。

42ppt課件VEGF也稱(chēng)血管通透因子（vascular

permeabilityfactor，VPF）。

VEGF家族包括VEGF-A、-B、-C、-D、-E和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子。

VEGF-A由于其mRNA剪切的不同可產(chǎn)生9種不同的蛋白異構(gòu)體，其中最為常見(jiàn)的是VEGF121和VEGF165。43ppt課件VEGF由內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生后，與僅存于內(nèi)皮細(xì)胞膜上的兩種酪氨酸蛋白激酶受體Flt-1、Flk-1/KDR特異性結(jié)合。通過(guò)自分泌或旁分泌途徑介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖，進(jìn)而誘導(dǎo)血管新生。44ppt課件AS斑塊內(nèi)血管新生及其調(diào)節(jié)

斑塊內(nèi)的新生血管大多位于內(nèi)彈力膜附近，周?chē)写罅垦准?xì)胞，常有含鐵血黃素沉積或伴新鮮出血，說(shuō)明在病灶局部出血、吸收經(jīng)常發(fā)生。隨著病變的發(fā)展，新生血管的檢出率也逐漸增加，尤其在不穩(wěn)定斑塊更為明顯。新生血管的數(shù)目、大小、形狀也隨之變化。45ppt課件

斑塊內(nèi)的新生血管與大血管的管腔相通，可作為更多的血漿脂蛋白進(jìn)入斑塊的通道而促進(jìn)斑塊生長(zhǎng)。血液中的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞通過(guò)新生血管流入到斑塊內(nèi)，釋放多種炎性因子刺激血管生長(zhǎng)因子的表達(dá)；另一方面，炎細(xì)胞也可以直接表達(dá)血管生長(zhǎng)因子并釋放多種蛋白水解酶如MMPs、膠原酶（Collagenases）、uPA等，促進(jìn)了斑塊內(nèi)血管新生。而新生血管又為炎細(xì)胞在斑塊內(nèi)聚集提供了重要通道，從而形成惡性循環(huán)。46ppt課件

新生血管促進(jìn)病變發(fā)展導(dǎo)致斑塊破裂的機(jī)制：

新生血管無(wú)平滑肌及周細(xì)胞支持，無(wú)感受血流和血壓的受體，管壁薄弱，易于引起斑塊內(nèi)出血、血栓及潰瘍形成。新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)黏附分子，促進(jìn)炎細(xì)胞聚集于斑塊內(nèi)，后者表達(dá)生長(zhǎng)因子并分泌蛋白水解酶，降解纖維帽。47ppt課件

在AS斑塊內(nèi)，VEGF的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與內(nèi)膜血管新生程度呈正相關(guān)，分布也高度一致，即主要位于斑塊肩部及纖維帽。

VEGF可能直接促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，也可能促進(jìn)骨髓中內(nèi)皮前體細(xì)胞（endothelialprecursorcells，EPCs）的釋放，后者遷移至AS斑塊處參與血管新生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入外源性VEGF后，培養(yǎng)體系的血管形成顯著增多。48ppt課件炎性因子對(duì)血管新生的影響及其作用機(jī)制

GM-CSF作為一種炎性因子，可由斑塊處的巨噬細(xì)胞和SMCs、ECs分泌。GM-CSF具有促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能的作用。但目前關(guān)于GM-CSF與血管新生之間關(guān)系的研究報(bào)道甚少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著GM-CSF濃度的逐漸增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)體系的血管形成隨之增多。49ppt課件

本實(shí)驗(yàn)的成功之處在于，在體外培養(yǎng)HUVECs，應(yīng)用Matrigel建立穩(wěn)定的血管形成的體外培養(yǎng)體系，來(lái)觀察GM-CSF對(duì)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞血管形成的影響。目前在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道。50ppt課件

Matrigel在-20℃中至少可保存3個(gè)月，呈淡黃色。在2-8℃過(guò)夜后液化，在22-37℃迅速聚合成具有生物活性的玫瑰紅色膠狀物質(zhì)。在37℃條件下可保存12天。

Matrigel在未稀釋的情況下可涂成薄層（0.5mm）或厚層（1.0mm）,用無(wú)血清的培養(yǎng)液稀釋?zhuān)?:3）可涂成薄層（0.5mm）作為培養(yǎng)底物。尤其要注意的是，在使用過(guò)程中避免反復(fù)凍融。51ppt課件

Matrigel應(yīng)用于生命科學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)的研究已有15年。

Matrigel為細(xì)胞的遷移、侵襲、管腔結(jié)構(gòu)的形成及細(xì)胞的生化功能、基因表達(dá)的研究提供了相關(guān)的環(huán)境。52ppt課件

目前認(rèn)為，GM-CSF促進(jìn)血管新生可能是由于細(xì)胞內(nèi)JAK2/STAT3途徑激活。在今后的研究中，有待于對(duì)這一機(jī)制作