淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與分離演示文稿課件

淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)楊星1淋巴細(xì)胞的分離

人淋巴細(xì)胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高、純度較好、失活較低。根據(jù)不同試驗(yàn)有相對純度，無論采用哪種方法，應(yīng)盡最大可能保持細(xì)胞應(yīng)有活性。分離的技術(shù)可由細(xì)胞的物理性狀和表面標(biāo)志設(shè)計(jì)，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康目刹捎妹芏忍荻入x心法、吸附分離法和其它特殊分離法。2外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個(gè)核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

1.092密度分類（PBMC）3密度梯度離心法原理：外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。為此利用一種密度介于1.075～1.092之間而近于等滲的溶液（分層液）做密度梯度離心，使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。4（一）Ficoll分層液法

Ficoll為合成性蔗糖聚合物的商品名，無毒，但高濃度溶液往往不等滲，且粘性高，易使細(xì)胞聚集。組成：2份6%聚蔗糖蒸餾水溶液+1份泛影葡胺生理鹽水Ficoll分層液法主要用于分離外周血中的單個(gè)核細(xì)胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。分離人外周淋巴細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳。別名：淋巴細(xì)胞分離液5實(shí)驗(yàn)方法1.采血，稀釋（外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）63.20℃，1500r/min，離心30min

1500rpm,20℃

,30minPBMC紅細(xì)胞、粒細(xì)胞稀釋的血漿、血小板FicollFicoll74.沿管壁周緣輕輕吸取PBMC層移入另一試管中。5.加足量稀釋液充分洗滌，1800r/min離心10min，棄上清。6.重復(fù)洗滌一次，1400r/min離心10min，棄上清。7.適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)。分離單個(gè)核細(xì)胞純度為95%。淋巴細(xì)胞約占90%～95%。8（二）Percoll分層液法1、一種連續(xù)密度梯度離心分離法。2、主要成分：硅膠顆粒，其大小不一，經(jīng)高速離心后形成連續(xù)密度梯度。

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PBMC懸液主要含淋巴細(xì)胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細(xì)胞及少量粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。那么怎樣獲得高純度的淋巴細(xì)胞及其亞群呢？10淋巴細(xì)胞及其亞群的分離(一)紅細(xì)胞的去除一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。(二)血小板的去除將PBMC懸液通過離心洗滌2～3次，?？扇コ齈BMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板。11(三)單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的去除1．粘附去除法

原理：單核細(xì)胞和粒細(xì)胞在37℃和Ca離子存在條件下能主動粘附在玻璃、塑料、尼龍毛、棉花纖維或葡聚糖凝膠。采集的非粘附細(xì)胞即為淋巴細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，對細(xì)胞損傷極少。缺點(diǎn)：B細(xì)胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細(xì)胞丟失。該法去除單核細(xì)胞后，大約95%的單個(gè)核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。122．羰基鐵粉吞噬法

原理：單核細(xì)胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細(xì)胞密度增大。方法一：經(jīng)聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細(xì)胞沉積于管底而被去除。方法二：用磁鐵將細(xì)胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細(xì)胞。133．苯丙氨酸甲酯去除法

?原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有親溶酶體性質(zhì)，能滲入細(xì)胞溶酶體內(nèi)被水解為游離氨基酸，導(dǎo)致溶酶體內(nèi)因滲透壓改變而破裂，釋放出的酶類物質(zhì)可引起細(xì)胞溶解。?用該法可溶解含溶酶體的細(xì)胞，如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和成纖維母細(xì)胞等，B細(xì)胞和大多數(shù)T細(xì)胞因缺乏溶酶體酶，因而不受影響。?該法去除單核細(xì)胞后，約99%的單個(gè)核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞，活性大于95%。14（四）、淋巴細(xì)胞亞群的分離原理：根據(jù)相應(yīng)細(xì)胞的特性和不同的標(biāo)志加以選擇性純化。常用方法：（1）E花環(huán)分離法（2）尼龍纖維分離法（3）流式細(xì)胞術(shù)（4）磁珠分離術(shù)（5）親和板結(jié)合分離法15(1)E花環(huán)分離法原理：人類T細(xì)胞表面上有能與綿羊紅細(xì)胞相結(jié)合的受體（E受體，CD2）,能與經(jīng)溴化二氨基異硫基異硫脲氰化物（AET）處理的綿羊紅細(xì)胞結(jié)合，形成穩(wěn)定的、細(xì)胞體積和比重較大的E花環(huán)。方法：淋巴細(xì)胞+SRBC懸液→加入分層液→T細(xì)胞形成E花環(huán)而沉于管底→懸液中為B細(xì)胞。16E花環(huán)1718（2）尼龍纖維分離法

原理：B細(xì)胞在37℃時(shí)易粘附于尼龍棉（聚酰胺）纖維上，而T細(xì)胞不具此能力。方法：淋巴細(xì)胞→通過聚酰胺纖維管→洗脫下來的是T細(xì)胞。19（3）流式細(xì)胞術(shù)又叫熒光激活細(xì)胞分離儀(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法

原理：

細(xì)胞經(jīng)熒光染色后，通過高速流動系統(tǒng)，細(xì)胞排成單行，逐個(gè)流經(jīng)檢測區(qū)進(jìn)行測定。當(dāng)細(xì)胞從流動室噴嘴處流出時(shí)，超聲振蕩動液流，使液流斷裂成一連串的均勻小滴(4000個(gè)/s)，每小滴內(nèi)最多含一個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)激光束照射產(chǎn)生熒光和散射光，由光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換成脈沖信號，數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理，分辨細(xì)胞的類型。

20激發(fā)系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)熒光激活細(xì)胞分離儀分離法

檢測與訊號處理系統(tǒng)細(xì)胞流動系統(tǒng)及氣壓流速控制系統(tǒng)21流式細(xì)胞分析儀22（4）磁珠分離術(shù)

磁珠分離術(shù)是將磁性材料顆粒表面進(jìn)行外理，微球的核心為小金屬顆粒，核心處包裹高分子材料（聚苯乙烯），可結(jié)合不同的生物大分子物質(zhì)（抗原、抗體、核酸等），若微球表面包被有免疫物質(zhì)則稱為免疫磁珠，其兼有免疫配基的性質(zhì)和磁響應(yīng)性質(zhì)，即在磁場中顯示磁性，移出磁場時(shí)磁性消除。

目前商品出售的磁珠有直徑為1～5um等不同的規(guī)格，表面活性基團(tuán)有氨基（－NH2）、羧基（－COOH）和羥基（－OH）等。

包被的免疫物質(zhì)有：一抗、二抗等。23方法：

將包被有關(guān)抗體的磁珠與待分離細(xì)胞充分作用，這樣借助于抗體磁珠，將與相應(yīng)的細(xì)胞結(jié)合成：細(xì)胞－抗體－磁珠復(fù)合物，該細(xì)胞在磁場中運(yùn)動與其他細(xì)胞產(chǎn)生明顯差別。

如采用層析的方法，將層析柱放于強(qiáng)磁場中，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞運(yùn)動將受限，而未與磁珠結(jié)合的細(xì)胞將先被洗脫下出來。

再將該柱移出磁場，與磁珠結(jié)合的細(xì)胞也將被洗脫下來，達(dá)到分離目的。24單克隆抗體CD3羊抗鼠修飾磁球Biomag抗CD3磁球磁球結(jié)合T細(xì)胞加入B和T細(xì)胞中負(fù)向選擇正向選擇磁架進(jìn)行分離直接法對細(xì)胞進(jìn)行分類間接法對T細(xì)胞進(jìn)行分離25免疫磁珠法細(xì)胞分選過程26免疫磁珠細(xì)胞分選裝置27（5）親和板結(jié)合分離法原理：各種淋巴細(xì)胞亞群具有不同的抗性。①分離CD4+或CD8+細(xì)胞，可用抗CD4或CD8單克隆抗體吸附。②分離B細(xì)胞用抗Ig抗體。③分離有C3受體的細(xì)胞用活化的C3包被。28將相應(yīng)抗體結(jié)合于塑料平板上抗原陽性的細(xì)胞與相應(yīng)抗體結(jié)合29淋巴細(xì)胞的保存和活力測定1、分離細(xì)胞的保存（1）短期保存用含有10～20%滅活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640培養(yǎng)液可保存數(shù)周。30（2）長期保存及復(fù)蘇保存：在保護(hù)劑二甲基亞砜中于液氮（-196℃)中保存。其過程是：先對需凍存的細(xì)胞作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，低速離心后，取沉積細(xì)胞用含有10%二甲亞砜的小牛血清配制成適當(dāng)濃度的細(xì)胞懸液，分裝于凍存管內(nèi)，立即放入降溫過渡站(-80℃)中，繼而進(jìn)行降溫(-196℃)冷凍。復(fù)蘇：將其從液氮中取出，立即放入40℃溫水中，融化后加入10倍的培養(yǎng)液混勻，低速離心，洗去保護(hù)劑，再懸于新培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)并檢查細(xì)胞活力。312、細(xì)胞活力的檢測

常用方法是臺盼藍(lán)染色法。這種染料不能透過活細(xì)胞正常完整的細(xì)胞膜，故活細(xì)胞不著色，死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增高，可使染料進(jìn)入細(xì)胞而使細(xì)胞著色（藍(lán)色）。32淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)正常情況下，人外周血中是沒有分裂相細(xì)胞的，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn)。外周血淋巴細(xì)胞一般情況下處于增殖期中的G1期，未經(jīng)培養(yǎng)的外周血中很難找到正在分裂的淋巴細(xì)胞。植物血細(xì)胞凝集素(PHA)是人類淋巴細(xì)胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下，能使處于G1期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，進(jìn)而進(jìn)行有絲分裂。利用PHA這一特性，淋巴細(xì)胞經(jīng)過含有PHA培養(yǎng)液培養(yǎng)，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細(xì)胞群體，加之，淋巴細(xì)胞遍及全身，并在所有器官組織中不斷循環(huán)，能反映個(gè)體整體水平情況而不象體細(xì)胞那樣具有局限性。33培養(yǎng)條件1、無污染環(huán)境培養(yǎng)環(huán)境無毒和無菌是保證細(xì)胞生存的首要條件，也是實(shí)驗(yàn)成功與否的先決條件。收獲細(xì)胞前的所有步驟都要保持高度的無菌，嚴(yán)防細(xì)菌和病毒的污染。當(dāng)細(xì)胞放置于體外培養(yǎng)時(shí)，與體內(nèi)相比細(xì)胞丟失了對生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質(zhì)積累等，可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。342、恒定的溫度維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長，必須有恒定適宜的溫度。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36．5±0．5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。如果溫度高于37℃，細(xì)胞的生長速度減慢；如果溫度高于40℃，細(xì)胞受損，超過43℃，則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。培養(yǎng)箱的溫度應(yīng)嚴(yán)格控制在37±0.5℃，為了能精確有效的控溫，在普通的隔水式恒溫培養(yǎng)箱上可加裝一個(gè)電子控溫儀。若溫度過高或過低，則會延緩分裂周期，造成收獲時(shí)細(xì)胞分裂相減少。353、氣體環(huán)境氣體是人體細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有02和C02。C02既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長繁殖所需成分，他在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH為7.2～7.4，培養(yǎng)基的pH值也應(yīng)調(diào)整到7.2～7.4之間，偏離這一范圍對細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。偏酸時(shí)細(xì)胞發(fā)育不良，偏堿時(shí)細(xì)胞會出現(xiàn)輕度固縮。細(xì)胞培養(yǎng)液pI-I的調(diào)節(jié)最常用的為加NaHCO，的方法，因?yàn)镹aHCO3，可供C02，但C02易于逸出，故最適用于封閉培養(yǎng)。364、培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)用無機(jī)鹽、胎牛血清(FCS)、HEPES、肝素、淋巴細(xì)胞分離液、植物凝集素(PHA)和白細(xì)胞介素等。植物凝集素(PHA)是體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，只有在PHA的作用下才能進(jìn)入有絲分裂，因此要考慮它的質(zhì)量和嘗試，質(zhì)量有問題藥效會降低，濃度過高可能會導(dǎo)致紅細(xì)胞凝集，都會造成實(shí)驗(yàn)效果差。37操作步驟1、洗滌將收集到的淋巴細(xì)胞集中于離心管中用培養(yǎng)液洗滌兩次，分別以2500和2000rpm離心各10min，棄上清，之后進(jìn)行接種。2、細(xì)胞接種細(xì)胞接種通常是在無菌室超凈工作臺內(nèi)的酒精燈火焰區(qū)進(jìn)行。接種時(shí)無菌操作是否規(guī)范，直接影響到細(xì)胞培養(yǎng)的成敗。如接種時(shí)如不慎將手接觸到培養(yǎng)瓶的瓶塞，或接觸了注射器的針頭，可能會造成細(xì)菌中霉菌的污染。接種操作是在酒精燈附近進(jìn)行，接種時(shí)還應(yīng)注意避免高溫破壞。操作時(shí)手與酒精燈的距離以火焰不燙手為宜，離火焰太近，細(xì)胞可能被破壞，甚至被燒焦成塊，肉眼可見呈團(tuán)塊；同時(shí)也會造成針頭堵塞。出現(xiàn)這種情況，應(yīng)及時(shí)更換針頭。如已接種，應(yīng)更換一瓶培養(yǎng)液。383、搖床培養(yǎng)將接種后的培養(yǎng)瓶放于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。從72h開始每48h添加等體積的新鮮培養(yǎng)液。39注意事項(xiàng)一、嚴(yán)格無菌操作對實(shí)驗(yàn)室以及培養(yǎng)過程中所接觸的試劑、液體、器皿、儀器的消毒,均應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)的參考書的要求進(jìn)行操作。無菌觀念要貫穿整個(gè)實(shí)驗(yàn)的始終,不可松懈。二、血清的選擇淋巴細(xì)胞對血清的要求較高,所以選用血清時(shí)要注意生產(chǎn)廠家。但胎牛血清價(jià)格昂貴,新生小牛血清或小牛血清也價(jià)格不菲,而使用自身血清不僅細(xì)胞長得好,而且更接近體內(nèi)環(huán)境,避免了外來因素的干擾,使實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更嚴(yán)密。血清濃度在5%～20%時(shí)細(xì)胞生長比較好,當(dāng)超過30%時(shí)反而不利于細(xì)胞生長。40三、pH值細(xì)胞生長的最適pH為7.0～7.2,可忍耐的pH范圍為6.6～7.8,當(dāng)pH低于6.8或大于7.6時(shí),都會抑制細(xì)胞生長。RPMI1640培養(yǎng)基加入血清后pH值一般升高0.2～0.4,故配1640培養(yǎng)液及其他用液時(shí)使pH值達(dá)到7.2比較合適,并且需經(jīng)常檢測pH值。四、培養(yǎng)空間培養(yǎng)液與液面上的空間二者的體積比例一般以1∶10為宜,培養(yǎng)液液面高度最好維持在2～5mm的范圍,以便于氣體交換。五、恒溫培養(yǎng)箱溫度應(yīng)維持在37℃,CO2濃度為5%,O2為95%,100%的飽和濕度。41常見失敗原因

1.污染污染仍是細(xì)胞培養(yǎng)失敗的主要原因,包括細(xì)菌和真菌,中藥制劑尤易出