PCR引物設計原則課件

引物設計引物引物的重要性引物設計的原則引物與PCR引物設計軟件如何使用PrimerPremier5.0引物同源性分析引物設計引物1引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補?！?’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物（primers)引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個2引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。引物的重要性在整個PCR體系中,引物占有十分重要的地位。P3引物設計原則引物長度堿基分布的均衡性Tm值引物二級結構引物3’端引物5’端引物的內部穩(wěn)定性引物的保守性與特異性擴增區(qū)域的二級結構引物設計原則4引物長度

一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。引物長度一般為15-30個核苷酸，在做長片段PCR或做某些5堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個GC含量一般40-60%GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。堿基分布的均衡性同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應超過5個6引物Tm值一般要求：55℃-65℃。計算：對于低于20個堿基的引物，Tm值可根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)來粗略估算對于較長引物，Tm值則需要考慮熱動力學參數(shù)，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現(xiàn)有的引物設計軟件最常用的計算方式。Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物Tm值一般要求：55℃-65℃。7引物二級結構引物二聚體盡可能避免兩個引物分子之間3’端有有較多堿基互補發(fā)夾結構尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。引物二級結構引物二聚體8引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進行任何修飾，否則不能進行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3’端最后一個堿基最好不與密碼子第三個堿基配對。引物3’端引物的延伸從3’端開始，因此3’端的幾個堿基9引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴性序列。5’端加上限制性核酸內切酶位點序列（酶切位點5’端加上適當數(shù)量的保護堿基）。5’端的某一位點修改某個堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點的點突變以作研究。5’端標記放射性元素或非放射性物質（如生物素、地高辛等）。引物5’端引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引10引物的內部穩(wěn)定性過去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進行延伸，故3’端最好為G或C。現(xiàn)在的觀點認為，引物的5’端應是相對穩(wěn)定結構，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩(wěn)定性結構，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。僅僅3’端幾個堿基與非特異位點上的堿基形成的低穩(wěn)定性結構是難以有效引發(fā)引物延伸的。如果3’端為富含G、C的結構，只需3’端幾個堿基與模板互補結合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。引物的內部穩(wěn)定性過去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能11引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物盡可能多的型別特異性：避免非特異性擴增引物的保守性與特異性保守性：通用引物——檢測同一類病原微生物12擴增區(qū)域的二級結構模板DNA的某些區(qū)域具有高度復雜的二級結構，在選擇引物時，應使擴增區(qū)域盡可能避開這些區(qū)域。擴增區(qū)域的自由能（△G。）小于58.61kJ/mol引物Tm值與PCR產(chǎn)物Tm值相差一般不超過30℃Tmproduct=81.5+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))+0.41(%G+%C)-500/lengt擴增區(qū)域的二級結構模板DNA的某些區(qū)域具有高度復雜的二級結構13引物與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L引物濃度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(單位：L)退火溫度最適退火溫度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。引物與PCR引物濃度：一般為0.1-0.5umol/L14引物設計軟件PrimerPremier5.0生物軟件網(wǎng)下載安裝后，用文本編輯器打開WIN.INI，將vspace=DU改為vspace=PU便可以使用全部功能。Oligoprimer3ThePrimerGeneratorNetPrimer引物設計軟件PrimerPremier5.015如何使用PrimerPremier5.0引物設計一般引物設計5’帶酶切位點引物設計巢式PCR引物設計多重PCR引物設計探針設計引物評析如何使用PrimerPremier5.0引物設計16