免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)酶免疫技術(shù)

教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(xué)(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物（或稱示蹤物），標(biāo)記抗體或抗原進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)；并借助于熒光顯微鏡，射線測量儀，酶標(biāo)檢測儀，電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果直接鏡檢觀察或進(jìn)行自動(dòng)化測定；可以在細(xì)胞、亞細(xì)胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對(duì)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定性、定量和定位研究；一免疫標(biāo)記技術(shù)概述免疫標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展歷程酶免ELISA（Engvall，1971）放射免疫分析（Berson和Yalow，1960）免疫熒光分析（Coons，1941）金標(biāo)免疫分析（Faulk和Taylor，1971）化學(xué)發(fā)光免疫分析（Arakawa，1977）時(shí)間分辨熒光免疫分析（Soini和Hemmila，1979）電化學(xué)發(fā)光免疫分析（Leland，1990）液相芯片（美國Luminex公司，1997）AgAb*Ag-Ab*熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)免疫組化技術(shù)特點(diǎn)分類酶免疫技術(shù)(ng)放射免疫技術(shù)(pg)熒光免疫技術(shù)免疫電鏡技術(shù)免疫膠體金技術(shù)發(fā)光免疫測定技術(shù)高度靈敏、特異、快速，定性、定量、定位

酶免疫分析技術(shù)是以酶標(biāo)記抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應(yīng)的抗體或抗原。將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結(jié)合的一種免疫檢測技術(shù)。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)第一節(jié)酶標(biāo)志物的制備

一、常用的酶和底物標(biāo)記酶的條件：

1.活性高，純度高2.作用專一性強(qiáng)3.性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián)4.測定方法簡便易行、敏感、精確5.酶和底物對(duì)人體無害且價(jià)廉易得1.辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值越大純度越高RZ值與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要

ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記用酶

常用酶HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2OHRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種。H2O2為受氫體，不穩(wěn)定，需在用前臨時(shí)配置。OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍(lán)色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

2.堿性磷酸酶

是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌中提取。ALP底物

對(duì)-硝基苯磷酸酯（pNPP）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對(duì)硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。二、制備酶標(biāo)記抗體(抗原）的方法制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡單、產(chǎn)量高，避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物，標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。

主要方法：1.戊二醛交聯(lián)法

2.改良過碘酸鈉法

三、酶標(biāo)記物的純化與鑒定純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。常用的是凝膠層析法和硫酸銨鹽析法，硫酸銨鹽析法操作簡便。酶標(biāo)記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標(biāo)記率的測定

四、固相載體（一）固相載體的要求①結(jié)合抗體或抗原的容量大；②與抗原或抗體結(jié)合穩(wěn)定且不易脫落；③不影響所固定的抗體或抗原的活性；④固化方法應(yīng)簡便、快速。

（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應(yīng)板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)ELISA屬于免疫標(biāo)記技術(shù)的一種，1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出，由于其操作過程簡單易行并可以定量，從而使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA）第二節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA方法操作簡單，測定模式多，應(yīng)用方便，亦可自動(dòng)化，但測定線性范圍較窄，批間變異相對(duì)較大，手工操作受影響因素較多，國內(nèi)多用在抗原和抗體的定性檢測，但也可用于定量檢測。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定法和其他免疫方法一樣，都是以抗體和抗原的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)，其差別在于酶聯(lián)免疫方法以酶或者輔酶作為標(biāo)記物來標(biāo)記抗原或抗體，用酶促反應(yīng)的放大作用來顯示初級(jí)免疫學(xué)反應(yīng)。其最大的特點(diǎn)是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板（或球）吸附抗原或者抗體使之固相化，在其中進(jìn)行免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)。一、ELISA的檢測原理

將已知抗原或抗體吸附在固相載體表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌的方法將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。加入酶的底物后，通過酶對(duì)底物催化的顯色反應(yīng)程度，對(duì)標(biāo)本中抗原或抗體進(jìn)行定性或定量。待測樣品（含待測物）與酶標(biāo)抗原或抗體反應(yīng)洗滌的方法將固相載體上的復(fù)合物與其他物質(zhì)分離將抗原或抗體固定于合適的載體上，并保持其生物活性

使抗原或抗體與某種酶連接，形成酶標(biāo)抗原或抗體加入酶反應(yīng)底物，復(fù)合物上的酶催化底物使其分解，氧化或還原成有色產(chǎn)物1.包被2.抗原抗體反應(yīng)3.洗滌4.顯色ELISA基本原理二、ELISA的方法類型（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，適用于檢測含有至少兩個(gè)抗原決定簇的較大分子抗原的測定。

E固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體EE底物如果血清標(biāo)本中含有類風(fēng)濕因子（RF），則可出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。因?yàn)轭愶L(fēng)濕因子是一種抗變性IgG的自身抗體，它可同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體的Fc段發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。

（二）雙位點(diǎn)一步法測定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。如果待檢標(biāo)本中抗原濃度過高，容易形成“鉤狀效應(yīng)（hookeffect）”。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)，可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，必要時(shí)可將待檢標(biāo)本適當(dāng)稀釋后重新測定。

EEE底物固相抗體標(biāo)本（含抗原）酶標(biāo)抗體（三）間接法間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（亦稱為酶標(biāo)二抗）來檢測已與固相結(jié)合的待測抗體。此法由于受血清中高濃度非特異性IgG的干擾，通常要將待測標(biāo)本進(jìn)行一定稀釋后才能測定。

固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)二抗底物EEE（四）競爭法競爭法既可用于檢測抗原，也可用于檢測抗體。1.競爭法測抗原待測抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與待測抗原的量呈反比，待測抗原越多，其結(jié)合特異性抗體越多，而酶標(biāo)抗原與特異性抗體結(jié)合就減少，底物顯色反應(yīng)淺；顯色越深，待測抗原量則越少。酶標(biāo)抗原

EEEE固相抗體標(biāo)本（含抗原）底物E競爭法主要用于檢測小分子抗原，因小分子抗原只有一個(gè)抗原決定簇

。

2.競爭法檢測抗體HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法，但其測定具體模式有區(qū)別。（1）競爭法檢測HBcAb：先將HBcAg包被在固相載體上，形成固相抗原，之后加入待測樣本和酶標(biāo)的特異抗體，待測樣本的抗體將與酶標(biāo)抗體競爭與固相載體上的特異抗原結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶底物顯色，顯色的強(qiáng)弱與待測抗體的含量成反比

。固相抗原標(biāo)本（含抗體）底物酶標(biāo)抗體EEEEE競爭法檢測HBcAb（2）競爭法檢測HBeAb：先將HBeAb包被在固相載體上，形成固相抗體，同時(shí)加入待測樣本和中和抗原HBeAg，待測樣本的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原HBeAg結(jié)合。加入酶標(biāo)的特異抗體，再加入酶底物，則顯色的強(qiáng)弱與待測樣本中的相應(yīng)抗體的含量成反比。固相抗體標(biāo)本（含抗體）抗原酶標(biāo)抗體EE底物E競爭法檢測HBeAb

(五)捕獲法固相載體上連接的是IgM的第二抗體，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲，然后再分別加入特異抗原和酶標(biāo)抗體（動(dòng)物源性IgG），形成抗人IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測IgM成正相關(guān)。最后加入底物，依據(jù)顯色程度來確定待測血清中IgM的含量。

固相抗人lgM抗體E標(biāo)本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體在應(yīng)用此法時(shí)需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結(jié)合，又能與隨后加入的酶標(biāo)抗體結(jié)合，從而導(dǎo)致假陽性結(jié)果。(六)雙抗原夾心法將已知抗原包被在固相載體上，待測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體可分別與固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合，形成固相抗原-抗體-酶標(biāo)抗原的復(fù)合物，加入底物后依據(jù)顯色程度來確定待測抗體的含量。

E固相抗原標(biāo)本（含抗體）酶標(biāo)抗原底物EE三、ELISA的關(guān)鍵技術(shù)（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。

3．酶標(biāo)結(jié)合物的制備

（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強(qiáng)陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

（三）測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化

1．加樣應(yīng)力求準(zhǔn)確，并注意不可產(chǎn)生氣泡。2．溫育注意反應(yīng)的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定的要求，整塊反應(yīng)板的溫度應(yīng)一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機(jī)洗滌兩種方法，若用洗板機(jī)洗滌要適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。4．顯色要控制好顯色時(shí)間。四、評(píng)價(jià)與應(yīng)用（一）評(píng)價(jià)ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境無污染，儀器、設(shè)備要求簡單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行定性、定量分析，已經(jīng)成為臨床免疫檢驗(yàn)中的常用技術(shù)。（二）應(yīng)用1.病原微生物測定2.激素測定3.藥物測定4.腫瘤標(biāo)志物5.蛋白質(zhì)測定教學(xué)目標(biāo)知識(shí)目標(biāo)1.熟練掌握：ELISA的基本原理（重難點(diǎn)）、方法類型。2.掌握：酶免疫分析技術(shù)的技術(shù)分類（重難點(diǎn)）、常用的酶及酶的底物、酶標(biāo)記抗體的方法、酶聯(lián)免疫測定的應(yīng)用、免疫印跡試驗(yàn)。3.了解斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)。能力目標(biāo)思政-素質(zhì)目標(biāo)免疫學(xué)思維質(zhì)控、生物安全、理論聯(lián)系實(shí)際、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)1.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的原理、方法類型、應(yīng)用及注意事項(xiàng)。2.酶免疫分析技術(shù)的分類。3.常用的酶及酶的底物。4.其他酶免疫技術(shù)的基本原理及應(yīng)用。本章要點(diǎn)目錄一免疫標(biāo)記技術(shù)概述二酶標(biāo)志物的制備三酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)三其他酶免疫技術(shù)第三節(jié)其他酶免疫技術(shù)一、均相酶免疫技術(shù)

（一）酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)（二）克隆酶供體免疫分析酶擴(kuò)大免疫分析技術(shù)示意圖克隆酶供體免疫分析示意圖

液相酶免疫技術(shù)是非均相酶免疫技術(shù)的方法類型之一，因抗原抗