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第一章轉(zhuǎn)化外源基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)第二節(jié)DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控第三節(jié)DNA甲基化對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控第四節(jié)提高轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的策略第一節(jié)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)化外源基因的瞬時表達(dá)在合適的條件下,轉(zhuǎn)化的外源基因通常在數(shù)小時后就能檢測到其表達(dá)的產(chǎn)物,并在1-2天內(nèi)達(dá)到最高值,隨后又逐漸降低,至十多天后完全消失。這種短時間內(nèi)的外源基因表達(dá)稱之為瞬時表達(dá)。1外源基因瞬時表達(dá)的機(jī)制(1)瞬時表達(dá)是未整合的外源基因的表達(dá)(2)瞬時表達(dá)是一種正常的表達(dá)方式基因擴(kuò)增是指細(xì)胞內(nèi)某些特定基因的拷貝數(shù)專一性地大量增加的現(xiàn)象。擴(kuò)增的基因片斷游離在細(xì)胞核內(nèi)。2外源基因瞬時表達(dá)的影響因素(1)質(zhì)粒DNA的基因結(jié)構(gòu);(2)細(xì)胞內(nèi)源核酸酶的影響(3)受體細(xì)胞生理狀態(tài)及其內(nèi)源Gus酶抑制劑的影響;3外源基因瞬時表達(dá)的應(yīng)用(1)在基因轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化能力的檢測;②優(yōu)化基因轉(zhuǎn)化條件,選擇導(dǎo)入DNA的方法,確定農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的時間等(2)植物基因表達(dá)調(diào)控的研究①啟動子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子、終止子的功能研究②外界因素對基因表達(dá)調(diào)控的影響;③植物激素的調(diào)控機(jī)理。轉(zhuǎn)化外源基因的穩(wěn)定表達(dá)所謂穩(wěn)定表達(dá)是指外源基因整合到和基因組DNA分子上,并能穩(wěn)定地遺傳的外源基因的表達(dá)。需符合以下條件:(1)表達(dá)時間長,無迅速衰退現(xiàn)象(2)DNA已整合到植物基因組中(3)能夠傳遞給后代,并符合分離規(guī)律。第二節(jié)DNA序列對轉(zhuǎn)化外源基因表達(dá)的調(diào)控植物基因工程中常用的啟動子按作用方式及功能不同可將啟動子分為三類:1.組成型啟動子組織特異性啟動子3.誘導(dǎo)型啟動子1.組成型啟動子在該類型啟動子控制下,結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一定水平上,在不同組織部為表達(dá)水平也沒有明顯差異,為此稱之為非特異性表達(dá)組成型啟動子。其特點(diǎn)是:表達(dá)具持續(xù)性表達(dá)量相對穩(wěn)定;不表現(xiàn)時空特異性;不受外界因素誘導(dǎo);在結(jié)構(gòu)上存在六聚體花紋序列TGACTG),往往以重復(fù)形式出現(xiàn)并被6-8個核苷酸隔開。(1)caMV35S啟動子該啟動子來自花椰菜花葉病毒(CaMV),其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的沉降系數(shù)為35S,故名最近發(fā)現(xiàn)35S啟動子可以劃分為兩個區(qū)域:從90~+8為A區(qū)域,主要負(fù)責(zé)在胚根、胚乳的根及根組織內(nèi)表達(dá);從-343~90為B區(qū)域,主要負(fù)責(zé)在胚的子葉及成熟植株的葉組織及維管組織內(nèi)表達(dá),在B區(qū)域內(nèi)的增強(qiáng)子序列可以提高表達(dá)水平。(2)
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