第十章蛋白質(zhì)和氨基酸測定課件

第十章蛋白質(zhì)和氨基酸的測定第一節(jié)概述第二節(jié)蛋白質(zhì)定性測定第三節(jié)蛋白質(zhì)定量測定第四節(jié)氨基酸定性測定第五節(jié)氨基酸定量測定第六節(jié)氨基酸的分離與測定.1第一節(jié)概述一.概況蛋白質(zhì)作用：①生命的物質(zhì)基礎(chǔ)；②構(gòu)成生物體細(xì)胞組織的重要成分；③生物體發(fā)育及修補(bǔ)組織的原料。人體內(nèi)的酸、堿及水分平衡，遺傳信息的傳遞，物質(zhì)代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)都與蛋白質(zhì)有關(guān)。蛋白質(zhì)除了保證食品的營養(yǎng)價(jià)值外，在決定食品的色、香、味及結(jié)構(gòu)等特征上也起著重要的作用。一個(gè)食品的營養(yǎng)高低，主要看蛋白質(zhì)的高低。.21

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蛋白質(zhì)組成蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，它的溶液是典型的膠體分散體系，由兩性氨基酸通過肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要組成元素是C、H、O、N、S、P。另外還有一些微量元素Fe、Zn、I、Cu、Mn。元素CHONSP百分比%50723160—30—3.32.氨基酸組成目前各種氨基酸已達(dá)175種以上，但是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸主要是其中的20種。在構(gòu)成構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸中8種氨基酸在人體中不能合成，必須依靠從食品攝入，故被稱為必需氨基酸，它們對人體有著極其重要的生理功能。亮氨酸異亮氨酸賴氨酸苯丙氨酸蛋氨酸蘇氨酸色氨酸纈氨酸LeuIsoLysPheMetThrTryVal.4第二節(jié)蛋白質(zhì)的定性測定電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質(zhì)結(jié)合并變色。氨基黑——酸性染料。靈敏度較高，花費(fèi)時(shí)間長。溴酚藍(lán)——靈敏度低，摩爾質(zhì)量低的蛋白質(zhì)可能染不上顏色?？捡R斯亮藍(lán)——有較多疏水基團(tuán)和蛋白質(zhì)的疏水區(qū)有較大的親和力通過范德華力結(jié)合，而和凝膠基質(zhì)的親和力低，漂洗容易。靈敏度比氨基黑高五倍,微量蛋白染色。.5.6蛋白質(zhì)的測定方法分為兩大類：一類是利用蛋白質(zhì)的共性，即利用含氮量，肽鍵和折射率等測定蛋白質(zhì)含量；一類是利用蛋白質(zhì)中特定氨基酸殘基、酸、堿性基團(tuán)和芳香基團(tuán)測定蛋白質(zhì)含量。第三節(jié)蛋白質(zhì)的定量測定.7一般來說，蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%，在用凱氏定氮法定量蛋白質(zhì)時(shí)，將測得的總氮乘上蛋白質(zhì)的換算系數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的蛋白質(zhì)含量。在食品中常包括蛋白質(zhì)，可能還包括有非蛋白質(zhì)含氮的化合物（如核酸、含氮碳水化合物、生物堿等；含氮類脂、卟啉和含氮的色素）。注意：當(dāng)測定的樣品其含氮的系數(shù)與100/16相差較大時(shí)，采用6.25將會引起顯著的偏差。蛋=6.25，肉=6.25，牛乳=6.38，稻米=5.95，大麥=5.83，玉米=6.25，小麥=5.83，麩皮=6.31，面粉=5.70

一、凱氏定氮法由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法,可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量的測定。.8（一）常量凱氏定氮法1.原理：樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。再用H3BO3吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。.9整個(gè)過程分三步：消化、蒸餾、吸收與滴定⑴消化

總反應(yīng)式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4＝（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O濃硫酸的脫水性：98%，有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氮。濃硫酸的氧化性：碳氧化為二氧化碳，硫酸被還原為二氧化硫。

2H2SO4+C＝CO2+2SO2+2H2O

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

.10為加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，常加入下列物質(zhì)：<1>硫酸鉀，增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)而加快有機(jī)物分解，它與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應(yīng)溫度，純硫酸沸點(diǎn)340℃，加硫酸鉀（1689℃）后可以提高至400℃以上。原因主要在于隨著消化過程中硫酸不斷的被分解，水分不斷逸出而使硫酸鉀濃度增大，故沸點(diǎn)升高。K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4＝K2SO4+H2O↑+SO3硫酸鉀加入量不能太大，否則消化體系溫度過高，又會引起已生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失：

（NH4）2SO4

NH3↑+（NH4）HSO4

△△.112（NH4）HSO4NH3↑+SO3+H2O也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點(diǎn)，但效果不如硫酸鉀。<2>硫酸銅，催化劑，消化終點(diǎn)指示劑，做蒸餾時(shí)堿性指示劑。硫酸銅的作用機(jī)理如下：C+2CuSO4Cu2SO4+SO2↑+CO2↑Cu2SO4+2Ｈ2SO42CuSO4+SO2+2H2O△△除硫酸銅外還可以加氧化汞、汞（均有毒，價(jià)格貴）、硒粉、二氧化鈦（偏低）等，應(yīng)用最廣泛的是硫酸銅。

.12<3>氧化劑如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機(jī)物氧化速度。但要防止氨進(jìn)一步氧化為氮。一般說來，若有足夠的其他還原劑，如碳，則添加氧化劑不致使測定結(jié)果偏低。目前使用雙氧水較多，但必須注意須待消化液完全冷卻后再加入。.13儀器：凱氏消化裝置。要防止爆沸。.142.蒸餾

消化液+40%氫氧化鈉（過量）加熱蒸餾，放出氨氣。

.153.吸收與滴定<1>用4%硼酸吸收，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，指示劑用混合指示劑（甲基紅—溴甲基酚綠混合指示劑，國標(biāo)用亞甲基蘭+甲基紅）。指示劑紫紅色綠色淡紫紅

（酸）（堿）（酸）<2>用過量的H2SO4或HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收，再用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定過剩的酸液，用甲基紅指示劑。（pH4.4～6.2紅黃）吸收滴定硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影響指示劑變色反應(yīng)，它有吸收氨的作用。.16

注意：①所用試劑溶液應(yīng)用無氨蒸餾水配制。②消化時(shí)不要用強(qiáng)火，應(yīng)保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內(nèi)壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。③消化時(shí)應(yīng)注意不時(shí)轉(zhuǎn)動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，并促進(jìn)其消化完全。.17④樣品中若含脂肪較多時(shí)，消化過程中易產(chǎn)大量泡沫，在開始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑。⑤當(dāng)樣品消化液不易澄清透明時(shí)，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30％過氧化氫2—3mL后再繼續(xù)加熱消化。⑥若取樣量較大，如干試樣超過5g可按每克試樣增加5mL硫酸。

.18⑦消化至呈透明后，繼續(xù)消化30min即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時(shí)，需適當(dāng)延長消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，含鐵量多時(shí)，呈深綠色。⑧蒸餾裝置不能漏氣。⑨蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。

⑩蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1min后關(guān)掉熱源，避免吸收液倒吸。.19二、 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量由50ml10ml,滴定用鹽酸濃度由0.1mol/L0.01mol/L,凱氏燒瓶100ml可用微量滴定管。3、蒸餾裝置。①②.20

三、自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30min可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12min完成1個(gè)樣。.21常量，微量，改良凱氏定氮法區(qū)別微量法：樣品質(zhì)量和試劑用量較少；有一套微量定氮裝置。常量，微量法采用硫酸銅作為催化劑。改良法：催化劑中增加了二氧化鈦，消化（氨化）完全并且縮短時(shí)間、簡化了操作過程。.22傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不需大儀器，但除自動凱氏定氮法外，均操作費(fèi)時(shí)，且有環(huán)境污染，影響操作人員健康。為滿足生產(chǎn)單位對工藝過程的快速控制分析，盡量減少環(huán)境污染和操作簡便省時(shí)，因此又陸續(xù)創(chuàng)立了不少快速測定法。包括：

雙縮脲法、紫外分光光度法、染料結(jié)合法、水楊酸比色法等。.23一.雙縮脲法1.原理脲（尿素）NH2—CO—NH2加熱至150~160℃時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。

雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡(luò)和物，此反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵（—CO—NH—），在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其吸光度，確定含量。（560nm）.242.方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。.25二、紫外吸收法1．原理：利用蛋白質(zhì)的特有基團(tuán)，│R（—NH—CH—CO--）在紫外區(qū)內(nèi)對某一波長具有一定的光選擇吸收，在280nm下，光吸收與蛋白質(zhì)濃度（3~8mg/ml）成直線關(guān)系，因此，通過測定蛋白質(zhì)溶液的吸光度從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出蛋白質(zhì)的含量。.262．特點(diǎn)：本法操作簡便迅速。由于許多非蛋白質(zhì)成分在紫外光區(qū)也有吸收作用，加之光散射作用的干擾。優(yōu)點(diǎn)：1.快速；2.對蛋白質(zhì)無破壞性。缺點(diǎn)：1.不是嚴(yán)格的定量方法。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中不含酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）殘基時(shí)，該方法就不能檢出蛋白。（此法用于測粗提總蛋白濃度較為適宜）

2.核酸可引起強(qiáng)烈干擾。靈敏度：0.2mg/ml~2mg/ml。.27三、染料結(jié)合法1．原理在特定條件下，蛋白質(zhì)可與某些染料（如氨基黑10B或酸性橙12等）定量結(jié)合而生成沉淀，用分光光度計(jì)測定沉淀反應(yīng)完成后剩余的染料量可計(jì)算出反應(yīng)消耗的染料量，進(jìn)而可求得樣品中蛋白質(zhì)含量。2．適用范圍本法適用于牛乳、冰淇淋、酪乳、巧克力飲料、脫脂乳粉等食品。.28四、水楊酸比色法：原理：樣品中的蛋白質(zhì)經(jīng)H2SO4消化轉(zhuǎn)化為銨鹽溶液后，在一定的酸度和溫度下與水楊酸鈉和次氯酸鈉作用生成有藍(lán)色的化合物，可以在波長660nm處比色測定，求出樣品含氮量，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。.29第四節(jié)氨基酸定性測定.301.茚三酮法原理:凡含有自由氨基的化合物與水合茚三酮共熱時(shí)，能產(chǎn)生紫色化合物。氨基酸與茚三酮的反應(yīng)分兩個(gè)步驟。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮與另一個(gè)茚三酮分子和NH3縮合生成有色化合物。.312．吲哚醌法原理：各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認(rèn)氨基酸。氨對吲哚醌顯色沒有妨礙，但其靈敏度較茚三酮法稍差，顯色不穩(wěn)定，顏色只有在絕對干燥的環(huán)境中才能保存。.323．鄰苯二甲醛法原理：鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物。鄰苯二甲醛法是目前紙上層析、硅膠薄層層析熒光顯色氨基酸最靈敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量。氨基酸紙上層析靈敏度達(dá)0.5μmoL，在硅膠薄層層析上為0.05～0.2μmoL(不嚴(yán)密,因?yàn)楦鞣N氨基酸顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度不同,所以因指明是什么AA。).33

第五節(jié)氨基酸一般定量測定一、甲醛滴定法（1）原理：氨基酸本身有堿性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2—結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定—COOH基。用堿完全中和-COOH基時(shí)的pH值為8.4~9.2。.34（2）特點(diǎn)：簡單、快速。測定發(fā)酵液中含氮量，控制發(fā)酵等。（適于食品中游離氨基酸的測定）。脯氨酸與甲醛作用時(shí)產(chǎn)生不穩(wěn)定的化合物，使結(jié)果偏低；酪氨酸含有酚羥基，滴定時(shí)也會消耗一些堿而致使結(jié)果偏高；溶液中若有銨存在也可使結(jié)果偏高。.352、茚三酮的比色法

原理：α氨基酸在堿性條件下與茚三酮起反應(yīng)，生成藍(lán)紫色化合物，可比色（570nm）定量。脯氨酸除外茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣影響氧化變紅，使用前純化。.36第六節(jié)氨基酸的分離與測定

一．薄層色譜法（TLC法）ThinLayerChromatography一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點(diǎn)在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達(dá)到分離、鑒定和定量的目的。它的應(yīng)用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。.37（一）原理：

取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進(jìn)行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質(zhì)具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種混合物可達(dá)到彼此被分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸進(jìn)行對比，鑒別各種氨基酸種類，從顯色斑點(diǎn)顏色的深淺可以大致確定其含量。