反膠團萃取教學課件

反膠團萃取36、如果我們國家的法律中只有某種神靈，而不是殫精竭慮將神靈揉進憲法，總體上來說，法律就會更好?！R克·吐溫37、綱紀廢棄之日，便是暴政興起之時?！ての锾?8、若是沒有公眾輿論的支持，法律是絲毫沒有力量的?！屏ζ账?9、一個判例造出另一個判例，它們迅速累聚，進而變成法律?！炷岫蛩?0、人類法律，事物有規(guī)律，這是不容忽視的?！獝郢I生反膠團萃取反膠團萃取36、如果我們國家的法律中只有某種神靈，而不是殫精竭慮將神靈揉進憲法，總體上來說，法律就會更好?！R克·吐溫37、綱紀廢棄之日，便是暴政興起之時?！ての锾?8、若是沒有公眾輿論的支持，法律是絲毫沒有力量的。——菲力普斯39、一個判例造出另一個判例，它們迅速累聚，進而變成法律?！炷岫蛩?0、人類法律，事物有規(guī)律，這是不容忽視的?！獝郢I生反膠團萃取技術(shù)反膠團萃取技術(shù)的產(chǎn)生傳統(tǒng)的分離方法，如液-液萃取技術(shù)很難應用于對生化產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素等）的提取與分離，原因在于這類物質(zhì)多數(shù)不溶于非極性有機溶劑，或與有機溶劑接觸后會引起變性和失活；而鹽析、沉淀、層析、電泳等生化分離方法又不能實現(xiàn)連續(xù)和放大操作。因此，針對這兩大難題，在20世紀70年代中期反膠團萃取技術(shù)就發(fā)展起來了。一、概述反膠團萃取技術(shù)反膠團萃取技術(shù)的產(chǎn)生

傳統(tǒng)的分離方法，如液-液萃取技術(shù)很難應用于對生化產(chǎn)品（如蛋白質(zhì)、氨基酸、抗生素等）的提取與分離，原因在于這類物質(zhì)多數(shù)不溶于非極性有機溶劑，或與有機溶劑接觸后會引起變性和失活；而鹽析、沉淀、層析、電泳等生化分離方法又不能實現(xiàn)連續(xù)和放大操作。因此，針對這兩大難題，在20世紀70年代中期反膠團萃取技術(shù)就發(fā)展起來了。一、概述反膠團的突出優(yōu)點

(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性;(2)分離、濃縮可同時進行，過程簡便;(3)能解決蛋白質(zhì)

(如胞內(nèi)酶)在非細胞環(huán)境中迅速失活的問題;

(4)由于構(gòu)成反膠團的表面活性劑往往具有細胞破壁功效，因而可直接從完整細胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶;(5)反膠團萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復使用等。2.1膠團和反膠團的形成

膠團或反膠團的形成均是表面活性劑分子自聚集的結(jié)果，是熱力學穩(wěn)定體系。（1）正向微膠團:

在水溶液中形成的膠體或微膠團，是由于表面活性劑中極性基團定向排列的結(jié)果?！欤卜茨z團的形成及特性極性“頭”水非極性的“核”非極性“尾”

表面活性劑的極性頭部（親水基）朝外（水）

，疏水的尾部朝內(nèi)，中間形成非極性的“核”。這種膠團稱為正向膠團，或簡稱正膠團。膠團的形成膠團（2）反相膠團

如果溶劑為非極性液體，當加入表面活性劑至一定濃度時，由于表面活性劑的極性和非極性基團的定向排列，也會形成微膠團結(jié)構(gòu)。極性“頭”有機溶劑極性的“核”非極性“尾”反膠團：表面活性劑的極性頭朝內(nèi)，疏水的尾部向外，中間形成極性的“核”。反膠團的形成反微團內(nèi)溶解的水稱為微水相或水池反膠團是兩性表面活性劑在非極性有機溶劑中親水性基團自發(fā)地向內(nèi)聚集而成的，內(nèi)含微小水滴的，空間尺度僅為納米級的集合型膠體。是一種自我組織和排列而成的，并具熱力學穩(wěn)定的有序構(gòu)造。2.2常用的表面活性劑

可在非極性溶劑中形成反膠團。在用反膠團萃取技術(shù)分離蛋白質(zhì)的研究中使用得最多的是陰離子型表面活性劑AOT(AerosolOT)，其化學名稱是丁二酸二異辛酯磺酸鈉。丁二酸二異辛酯磺酸鈉這種表面恬性劑容易獲得，其特點是具有雙鏈，極性基團較小，形成反膠團時不需加入助表面活性劑，并且形成的反膠團較大，半徑為170nm，有利于大分子蛋白質(zhì)進入。溶劑

通常為異辛烷(2，2，4-三甲基戊烷)AOT能溶解于有機溶劑中，也能溶解于水中，并形成反相微膠團。AOT在形成反膠團時的Wo值較大，可達170。因此在反相微膠團內(nèi)就可以溶解較多的生物大分子而提高了萃取效率。2.3反膠團的兩個特異性功能

(1)具有分子識別并允許選擇性透過的半透膜的功能;(2)在疏水性環(huán)境中具有使親水性大分子如蛋白質(zhì)等保持活性的功能。2.4反膠團的形狀和大小

反膠團的形狀多為球形或近似球形，有時也呈柱狀結(jié)構(gòu)，其半徑一般為10～100nm。膠團的大小取決于鹽的種類和濃度、溶劑和表面活性劑的種類和濃度以及溫度等。2.5Wo值

表征膠團大小較好的參數(shù)是Wo——水與表面活性劑的摩爾比。用非極性溶劑中的水濃度和表面活性劑濃度之比來表示:

Wo=[H20]/[表面活性劑]Wo值的物理意義

Wo值越大，反相微膠團內(nèi)的水分含量就越多，形成的反相微膠團的半徑就越大。能溶解水溶性成分的量就越多。因此，Wo值大小可以反映出反相微膠團的大小和溶解能力。2.6CMC

表面活性劑的臨界濃度：

表面活性劑要形成反相微膠團，在溶劑中的濃度必須達到一定值，否則就不能形成微膠團，這個形成微膠團所必需的最低濃度值，叫做表面活性劑形成微膠團的臨界濃度(CMC)。

不同的表面活性劑的CMC值在0.l-1.0mmol/L之間，隨溫度、壓力和溶劑的變化而變化。2.7水池的性質(zhì)

表面活性劑分子的聚集使反膠團內(nèi)形成極性核，反膠團內(nèi)溶解的水通常稱為微水相或“水池”。由于反膠團內(nèi)存在“水池”，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子，為生物分子提供適宜存在的親水微環(huán)境。因此，“水池”的物理化學性質(zhì)直接影響到反膠團萃取的適用范圍和效率。當反膠團的含水率較低時，反膠團“水池”內(nèi)水的理化性質(zhì)與正常水相差懸殊。例如，以AOT為表面活性劑，當wo小于6～8時，反膠團內(nèi)微水相的水分子受表面活性劑親水基團的強烈束縛，表觀黏度上升50倍，疏水性也極高。隨著wo的增大，這些現(xiàn)象逐漸減弱，當wo大于16時，微水相的水與正常的水接近，反膠團內(nèi)可形成雙電層。

即使當wo值很大時，“水池”內(nèi)水的理化性質(zhì)也不可能與正常的水完全相同，特別是接近表面活性劑親水頭的區(qū)域內(nèi)。反膠團內(nèi)的水由于表面活性劑分子極性頭電離具有很高的電荷濃度，因此“水池”中水的pH值不同于主體水的pH值。

這一結(jié)論對于在反膠團內(nèi)固定蛋白質(zhì)的研究尤為重要?！?反膠團萃取蛋白質(zhì)的過程

蛋白質(zhì)進入反膠團溶液是一種協(xié)同過程，即在宏觀兩相(有機相和水相)界面間的表面活性劑層，同鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用而變形，接著在兩相界面形成了包含有蛋白質(zhì)的反膠團，此反膠團擴散進入有機相中，從而實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取。改變水相條件(如pH值和離子種類及其強度等)又可使蛋白質(zhì)由有機相重新返回水相，實現(xiàn)反萃取過程生物大分子反膠團形成的方法最常用到的有3種:（1）注入法（2）轉(zhuǎn)移法（3）溶解法（1）注入法

通過將含有生物大分子的水溶液注入到含有表面活性劑的有機相中，從而實現(xiàn)萃取過程。（2）相轉(zhuǎn)移法

通過將含生物大分子的水相與溶解有表面活性劑的有機相接觸，緩慢地攪拌，在形成反向微膠團的同時，其中的生物大分子即轉(zhuǎn)入到反相微膠團中，直到處于萃取平衡狀態(tài)為止。（3）溶解法

對于固體粉末中含有的生物大分子，或不溶于水的生物大分子，可采用溶解法進行。3.1蛋白質(zhì)溶入反膠團的推動力

蛋白質(zhì)溶解于反膠團的主要推動力是表面活性劑與蛋白質(zhì)的靜電相互作用。此外，反膠團與蛋白質(zhì)等生物分子間的空間相互作用對蛋白質(zhì)的溶解率也有重要影響。3.1.1靜電作用力

在反膠團萃取體系中，表面活性劑與蛋白質(zhì)都是帶電的分子，因此靜電相互作用是萃取過程中的一種主要推動力。其中一個最直接的因素是pH值，它決定了蛋白質(zhì)帶電基團的離解速率及蛋白質(zhì)的凈電荷，這與蛋白質(zhì)等電點pI有關(guān)。即隨著pH值的改變，被萃取蛋白質(zhì)所帶電荷的性質(zhì)和帶電量是不同的。

對于陽離子表面活性劑形成的反膠團體系，萃取只發(fā)生在水溶液的pH>pI時，此時蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭問相互吸引；

pH<pI時，靜電排斥力將抑制蛋白質(zhì)的萃取。對于陰離子表面活性劑形成的反膠團體系，情況正好相反。3.1.2空間位阻效應

反膠團“水池”的物理性能(大小、形狀等)及其中水的活度是可以用Wo的變化來調(diào)節(jié)的，并且會影響大分子如蛋白質(zhì)的增溶或排斥，達到選擇性萃取的目的，這就是所謂的位阻效應。許多反膠團萃取的實驗研究已經(jīng)表明，隨著Wo的降低，反膠團直徑減小，空間位阻作用增大．蛋白質(zhì)的萃取率也減少?？臻g位阻效應也體現(xiàn)在蛋白質(zhì)分子大小對分配系數(shù)的影響上。在各種蛋白質(zhì)等電點處的反膠團萃取實驗研究表明，隨著蛋白質(zhì)分于量的增大，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(溶解率)下降。當相對分子質(zhì)量超過20000時，分配系數(shù)很小。該實驗在蛋白質(zhì)等電點處進行，排除了靜電相互作用的影響，表明隨分子量增加，空間位阻作用增大，蛋白質(zhì)萃取率下降。因此，也可以根據(jù)分子量的差異利用反膠團萃取實現(xiàn)蛋白質(zhì)選擇性分離。3.2影響反膠團萃取蛋白質(zhì)的主要因素

由上述分析可知，任何可以增加蛋白質(zhì)與反膠團的靜電作用或?qū)е滦纬奢^大反膠團的因素，都有助于蛋白質(zhì)的萃取。影響反膠團萃取蛋白質(zhì)的主要因素，見表2-10。只要通過對這些因索進行系統(tǒng)的研究，確定最佳操作條件，就能得到合適的目標蛋白質(zhì)萃取率。從而達到分離純化的目的。(1)水相pH值的影響

水相的pH值決定了蛋白質(zhì)表面電荷的狀態(tài)，從而對萃取過程造成影響。當?shù)鞍踪|(zhì)所帶的電荷與反膠團內(nèi)表面電荷，也就是表面活性劑極性基團所帶的電荷性質(zhì)相反時，由于靜電引力，可使蛋白質(zhì)溶于反膠團中。(2)離子的種類和強度的影響

與反膠團相接觸的水溶液離子強度以幾種不同方式影響著蛋白質(zhì)的分配。①離子強度增大后，反膠團內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠團內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度。②反膠團內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團之間的斥力，使反膠團變小，從而使蛋白質(zhì)不能進入其中。

③離子強度增加時，增大了離子向反膠團內(nèi)“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，蛋白質(zhì)從反膠團內(nèi)再被鹽析出來。④鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可以改變?nèi)芙庑阅埽}的濃度越高，其影響就越大。陽離子的種類對萃取率的影響

如Mg2+、Na+、Ca2+、K+對萃取率的影響主要體現(xiàn)在改變反膠團內(nèi)表面的電荷密度上。通常反膠團中表面活性劑的極性基團不是完全電離的，有很大一部分陽離子仍在膠團的內(nèi)表面上(相反離子締合)。極性基團的電離程度愈大，反膠用內(nèi)表面的電荷密度愈大，產(chǎn)生的反膠團也愈大。表面活性劑電離的程度與離子種類有關(guān)。同一離子強度下的四種離子對反膠團的Wo的影響見表2-11。由表211-可知，極性基團的電荷密度按K+

、Ca2+、Na+、Mg2+的順序逐漸增大，電離程度也相應的增大。(3)表面活性劑的種類和濃度的影響

陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑都可用于形成反膠團，關(guān)鍵是應從反膠團萃取蛋白質(zhì)的機理出發(fā)，選用有利于增強蛋白質(zhì)表面電荷與反膠團內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠團大小的表面活性劑。除此以外，還應考慮形成反膠團及使反膠團變大(由于蛋白質(zhì)的進入)所需的能量的大小以及反膠團內(nèi)表面的電荷密度等因素，這些都會對萃取產(chǎn)生影響。

增大表面活性劑的濃度可增加反膠團的數(shù)量，從而增大對蛋白質(zhì)的溶解能力。但表面活性劑濃度過高時，有可能在溶液中形成比較復雜的聚集體，同時會增加反萃取過程的難度。因此，應選擇蛋白質(zhì)萃取率最大時的表面活性劑濃度為最佳濃度。(4)溶劑體系的影響

溶劑的性質(zhì)，尤其是極性，對反膠團的形成和大小都有很大的影響，常用的溶劑有烷烴類(正己烷、環(huán)己烷、正辛烷、異辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等。有時也添加助溶劑，如醇類(正丁醇等)來調(diào)節(jié)溶劑體系的極性，改變反膠團的大小，增加蛋白質(zhì)的溶解度?！?反膠團萃取的過程及工藝開發(fā)4.1反膠團萃取過程水相中的溶質(zhì)進入反膠團相需經(jīng)歷三步傳質(zhì)過程：①通過表面液膜從水相到達相界面；

②在界面處溶質(zhì)進入反膠團中