揭示人類胸腺細(xì)胞的發(fā)育及T細(xì)胞的發(fā)育成熟

揭示人類胸腺細(xì)胞的發(fā)育及T細(xì)胞的發(fā)育成熟，對(duì)重建T細(xì)胞發(fā)育過程意義重大。研究背景胸腺介導(dǎo)T細(xì)胞的成熟和選擇，在建立適應(yīng)性免疫和中樞耐受中起著至關(guān)重要的作用。該器官在生命的早期退化、T細(xì)胞輸出減少與年齡相關(guān)的癌癥、感染和自身免疫性發(fā)病率相關(guān)。來自胎兒肝臟或骨髓的T細(xì)胞前體遷移到胸腺中，在那里它們分化成各種類型的成熟T細(xì)胞。胸腺微環(huán)境協(xié)同支持T細(xì)胞分化。盡管胸腺上皮細(xì)胞（TEC）對(duì)T細(xì)胞命運(yùn)至關(guān)重要，但其他細(xì)胞類型也參與了該過程，例如進(jìn)行抗原呈遞的樹突狀細(xì)胞（DC）和支持TEC分化的間充質(zhì)細(xì)胞。最近，單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）揭示了小鼠胸腺器官發(fā)生的新型TECs。然而，人體器官以物種獨(dú)特的模式和節(jié)奏成熟，因此需要對(duì)人類胸腺進(jìn)行全基因組的全面研究。T細(xì)胞發(fā)育涉及階段性T淋巴細(xì)胞分化的并行過程，并伴隨著用于抗原識(shí)別的多種TCRrepertoire的獲得。這是通過基因組重組過程實(shí)現(xiàn)的，該過程從多個(gè)基因組拷貝中選擇變異（V），連接（J），在某些情況下還選擇了多樣性（D）基因片段。V(D)J基因重組可以優(yōu)先包含某些基因片段，從而導(dǎo)致庫的偏移(淋巴細(xì)胞發(fā)育中免疫球蛋白可變區(qū)基因片段經(jīng)重組而形成完整可變區(qū)序列的過程。重鏈可變區(qū)基因由V、D、J各1個(gè)基因片段組成，輕鏈可變區(qū)基因由V、J各1個(gè)基因片段組成，VDJ基因均有多個(gè)拷貝，各片段通過隨機(jī)組合(即重排)而形成多樣性的抗體可變區(qū)。)。迄今為止，我們對(duì)VDJ重組和庫偏倚的大多數(shù)了解都來自動(dòng)物模型和人類外周血分析，而關(guān)于人胸腺TCRrepertoire的綜合數(shù)據(jù)很少。在這里，作者應(yīng)用scRNA-seq生成了胚胎、胎兒、幼兒和成年階段胸腺細(xì)胞的綜合轉(zhuǎn)錄組圖譜，并將其與TCRrepertoire分析相結(jié)合以重建T細(xì)胞分化過程。研究方案sample:

受孕后的7到17周之間抽取了跨越胸腺發(fā)育階段的15個(gè)胚胎和胎兒胸腺，以及兒科和成年個(gè)體的9個(gè)產(chǎn)后胸腺（在所有參與者的書面知情同意下，根據(jù)《赫爾辛基2000年宣言》中的指南獲得了本研究的所有組織樣品）。通過FACS捕獲表面Marker為CD45,

CD3在,

EpCAM的細(xì)胞。(CD45是免疫細(xì)胞的marker，CD3是T細(xì)胞的marker，EpCAM是上皮細(xì)胞的marker。)測(cè)序數(shù)據(jù)分析介紹：工具:SingleCell3′and5′ReagentKit(10X

Genomics)，IlluminaNexteraXTkit.比對(duì):CellRangerSingle-CellSoftwareSuite(version2.0.2for3′chemistryandversion2.1.0for5′chemistry,10xGenomicsInc.)，GRCh38.篩選：Cellswithfewerthan2000UMIcountsand500detectedgeneswereconsideredasemptydropletsandremovedfromthedataset.Cellswithmorethan7000detectedgeneswereconsideredaspotentialdoubletsandremovedfromthedataset.結(jié)果分析1.整個(gè)生命周期中人胸腺的細(xì)胞組成作者對(duì)15個(gè)產(chǎn)前胸腺進(jìn)行了scRNA-seq檢測(cè)，范圍從7個(gè)PCW（受孕后的幾周，post-conceptionweeks）（可分離出胸腺殘基）到17個(gè)PCW（胸腺發(fā)育完成）（圖1A和B），還分析了九個(gè)產(chǎn)后樣本，涵蓋了整個(gè)胸腺活動(dòng)期。在單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析與TCRαβ譜分析結(jié)合之前，根據(jù)CD45、CD3或上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）的表達(dá)對(duì)分離的單細(xì)胞進(jìn)行分類，將胸腺細(xì)胞和非胸腺細(xì)胞分離獲取。在進(jìn)行QC后（對(duì)一篇單細(xì)胞RNA綜述的評(píng)述：細(xì)胞和基因質(zhì)控參數(shù)的選擇），從產(chǎn)前胸腺中獲得了138,397個(gè)細(xì)胞，從產(chǎn)后胸腺中獲得了117,504個(gè)細(xì)胞。利用標(biāo)記基因?qū)⒓?xì)胞亞群注釋為40多種不同的細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)（圖1C和1D）。分化中的T細(xì)胞在數(shù)據(jù)集中得到了很好的表示，包括雙陰性（DN，CD4-CD8-）、雙陽性（DP，CD4+CD8+）、CD4+單陽性（CD4+）、CD8+單陽性（CD8+）、FOXP3+調(diào)節(jié)性（Treg）、CD8αα+和γδT細(xì)胞。還確定了其他免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞、先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC）、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和DC。DC可以進(jìn)一步分為髓樣/常規(guī)DC1和DC2以及漿細(xì)胞樣DC（pDC）。該數(shù)據(jù)集還鑒定了非免疫細(xì)胞的胸腺微環(huán)境。作者將非免疫細(xì)胞進(jìn)一步分型，包括TEC、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）、內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1E）。胸腺成纖維細(xì)胞鑒定為兩種之前未被報(bào)道過的亞型：亞型1（Fb1）（COLEC11，C7，GDF10）和2型成纖維細(xì)胞（Fb2）（PI16，F(xiàn)N1，F(xiàn)BN1）（圖1E）。Fb1細(xì)胞獨(dú)特地表達(dá)COLEC11和ALDH1A2，COLEC11在先天免疫中起重要作用，ALDH1A2是負(fù)責(zé)產(chǎn)生視黃酸的酶，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的生長。為了探索這些成纖維細(xì)胞亞型的定位模式，作者對(duì)Fb1和Fb2標(biāo)記基因（COLEC11和FBN1）以及普通成纖維細(xì)胞（PDGFRA），內(nèi)皮細(xì)胞（CDH5）和VSMC（ACTA2）標(biāo)記基因進(jìn)行原位雜交熒光染色定位（圖1F）。結(jié)果表明，F(xiàn)b1細(xì)胞為小葉周細(xì)胞，而Fb2細(xì)胞為小葉內(nèi)細(xì)胞，通常與VSMC的大血管相關(guān)，這與其調(diào)節(jié)血管發(fā)育的基因的轉(zhuǎn)錄組譜一致，并證實(shí)了GDF10和ALDH1A2在小葉周圍區(qū)域的表達(dá)（圖1F）。除成纖維細(xì)胞外，作者還鑒定了人類TEC（圖1E）的亞群，例如髓質(zhì)和皮質(zhì)TEC（mTEC和cTEC）。為了注釋人類TEC，作者將人類數(shù)據(jù)集與已發(fā)布的鼠TEC數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比較，確定物種之間保守的TEC亞群，包括PSMB11陽性cTEC、KRT14陽性mTEC（I）、表達(dá)AIRE的mTEC（II）和表達(dá)KRT1的mTEC（III）（圖1E）。作者注意到了兩種對(duì)人類具有特異性的EpCAM+細(xì)胞類型：（i）表達(dá)MYOD1和MYOG的肌樣細(xì)胞[TEC（myo）s]和（ii）表達(dá)NEUROD1、NEUROG1-和CHGA的TEC（neuro）s，類似于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（圖1E）。值得注意的是，與自身免疫性重癥肌無力相關(guān)的CHRNA1，除了mTEC（II）以外，還由這兩種細(xì)胞類型特異性表達(dá)（圖1E），從而擴(kuò)大了可能參與重癥肌無力的耐受性誘導(dǎo)。為了支持這種可能性，作者檢測(cè)到位于胸腺髓質(zhì)中的MYOD1和NEUROG1表達(dá)細(xì)胞（圖1F）。圖1.Cellularcompositionofthedevelopinghumanthymus(A)Schematicofsingle-celltranscriptomeprofilingofthedevelopinghumanthymus.(B)Summaryofgestationalstage/ageofsamples,organs(circlesdenotethymus;rectanglesdenotefetalliveroradultbonemarrow,adultspleen,andlymphnodes),and10xGenomicschemistry(colors).(C)UMAPvisualizationofthecellularcompositionofthehumanthymuscoloredbycelltype(DN,double-negativeTcells;DP,double-positiveTcells;ETP,earlythymicprogenitor;aDC,activateddendriticcells;pDC,plasmacytoiddendriticcells;Mono,monocyte;Mac,macrophage;Mgk,megakaryocyte;Endo,endothelialcells;VSMC,vascularsmoothmusclecells;Fb,fibroblasts;Ery,erythrocytes).(D)SameUMAPplotcoloredbyagegroups,indicatedbypost-conceptionweeks(PCW)orpostnatalyears(y).(E)Dotplotforexpressionofmarkergenesinthymicstromalcelltypes.Hereandinlaterfigures,colorrepresentsmaximum-normalizedmeanexpressionofmarkergenesineachcellgroup,andsizeindicatestheproportionofcellsexpressingmarkergenes.(F)RNAsmFISHinhumanfetalthymusslideswithprobestargetingstromalcellpopulations.Topleft:Fb2populationmarker

FBN1

andgeneralfibroblastmarkers

PDGFRA

and

CDH5.Topright:Fb1marker

GDF10,

FBN1,and

CDH5.Middleleft:Fb1marker

COLEC11

and

FBN1.Middleright:Fb1marker

ALDH1A2,VSMCmarker

ACTA2,and

FBN1.Bottomleft:TEC(myo)marker

MYOD1.Bottomright:Epithelialcellmarker

EPCAM

andTEC(neuro)marker

NEUROG1.Dataarerepresentativeoftwoexperiments.(G)Relativeproportionofcelltypesthroughoutdifferentagegroups.Dotsizeisproportionaltoabsolutecellnumbersdetectedinthedataset.Statisticaltestingforpopulationdynamicswasperformedby

t

testsusingproportionsbetweenstagegroups.The

x

axisshowsageofsamples,whicharecoloredinthesameschemeas(D).2.

胸腺基質(zhì)和T細(xì)胞的協(xié)調(diào)發(fā)育作者研究了整個(gè)發(fā)育過程中不同胸腺細(xì)胞類型的動(dòng)力學(xué)（圖1G）。在早期胎兒樣本（7至8個(gè)PCW）中，淋巴區(qū)包含NK細(xì)胞、γδT細(xì)胞和ILC3s，幾乎沒有分化的αβT細(xì)胞。分化的T細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)主要是在7個(gè)PCW的樣品的DN階段。他們逐漸從DP發(fā)展到SP階段，在12PCW左右達(dá)到平衡，先天淋巴細(xì)胞的比例則是下降趨勢(shì)。值得注意的是，成人樣本顯示出胸腺變性的形態(tài)學(xué)證據(jù)。將胸腺與同一供體的脾臟和淋巴結(jié)的比較顯示，胸腺中存在終末分化的T細(xì)胞，這表明終末分化的T細(xì)胞再次進(jìn)入胸腺或出現(xiàn)循環(huán)細(xì)胞污染（圖1G）。另一方面，表達(dá)IL10、穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性CD4+T淋巴細(xì)胞（CD4+CTL）在退化的胸腺樣品中富集。在其他樣本中也證實(shí)了記憶T細(xì)胞和B細(xì)胞增加的趨勢(shì)（圖1G；記憶T細(xì)胞的P=9.3×10^(-6)，記憶B細(xì)胞的P=0.0096）。胸腺基質(zhì)細(xì)胞的相應(yīng)變化反映了T細(xì)胞發(fā)育的趨勢(shì)。作者觀察到TEC亞群的時(shí)間變化與T細(xì)胞成熟的開始一致，從富集的cTECs轉(zhuǎn)變到cTECs和mTECs的平衡（圖1G；P=0.0054）。這支持了“thymiccross-talk”的概念，其中的上皮細(xì)胞和成熟的T細(xì)胞協(xié)同相互作用可以支持它們的相互分化。此外，成纖維細(xì)胞的組成在發(fā)育過程中也發(fā)生了變化。上面提到的Fb1亞群在早期發(fā)育中占主導(dǎo)地位，而在較晚的發(fā)育時(shí)間點(diǎn)觀察到了相似數(shù)量的Fb1和Fb2細(xì)胞（P=0.014），并且細(xì)胞周期相關(guān)細(xì)胞數(shù)量減少（圖1G）。最后，其他免疫細(xì)胞也在妊娠和產(chǎn)后生活中發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。早期妊娠期間巨噬細(xì)胞豐富，DC在整個(gè)發(fā)育過程中均增加（圖1G）。12PCW后DC1占主導(dǎo)，產(chǎn)后生活中pDC比例增加（巨噬細(xì)胞，P=2.7×10^(–8)；DC1，P=1.05×10^(–3)；DC2，P=4.86×10^(–5)）。為了進(jìn)一步研究介導(dǎo)胸腺基質(zhì)和T細(xì)胞協(xié)調(diào)發(fā)展的因素，作者使用公共數(shù)據(jù)庫CellPhoneDB.org系統(tǒng)研究了細(xì)胞相互作用，以預(yù)測(cè)在它們之間特異性表達(dá)的配體-受體對(duì)（哇！單細(xì)胞測(cè)序-配體受體互作分析原來可以這么簡單又高大上?。Ｔ陬A(yù)測(cè)的相互作用中，作者核對(duì)了已知跨不同細(xì)胞類型和發(fā)育階段的參與胸腺發(fā)育的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的表達(dá)模式。淋巴毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（LTB：LTBR）來自多種免疫細(xì)胞，并被大多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)所接受。與此相反的是RANKL-RANK（TNFRSF11：TNFRSF11A）信號(hào)傳導(dǎo)被限制在ILC3和mTEC（II）s/淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞之間。FGF信號(hào)傳導(dǎo)（FGF7：FGFR2）來自于成纖維細(xì)胞向TECs發(fā)出信號(hào)，成年胸腺中FGFR2的表達(dá)減少。對(duì)于Notch信號(hào)傳導(dǎo)，NOTCH1是早期胸腺祖細(xì)胞（ETP）中表達(dá)的主要受體，不同的細(xì)胞類型表達(dá)了不同的Notch配體：cTEC和內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)JAG2和DLL4，其他TEC則廣泛表達(dá)JAG1。3.傳統(tǒng)T細(xì)胞分化軌跡當(dāng)胸腺形成時(shí)，胎兒肝臟是主要的造血器官和來源，是造血干細(xì)胞和多能祖細(xì)胞（HSCs/MPPs）的來源，因此作者分析了來自同一胎兒的一對(duì)胸腺和肝臟樣品。作者合并了胸腺和肝臟數(shù)據(jù)，并選擇了包括肝HSC/MPP，胸腺ETP和DN胸腺細(xì)胞的細(xì)胞群進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（圖2A和2B）。為了研究下游T細(xì)胞分化軌跡（NBT|45種單細(xì)胞軌跡推斷方法比較，110個(gè)實(shí)際數(shù)據(jù)集和229個(gè)合成數(shù)據(jù)集），作者決定顯示分化T細(xì)胞的連續(xù)軌跡。為了證實(shí)這一軌跡的有效性，使用T細(xì)胞分化的標(biāo)志性基因：CD4/CD8A/CD8B基因（圖2D），細(xì)胞周期（CDK1）和重組（RAG1）基因（圖2E）以及完全重組的TCRαs/TCRβs（圖2F）。軌跡從CD4-CD8-DN細(xì)胞開始，逐漸表達(dá)CD4和CD8成為CD4+CD8+

DP細(xì)胞，然后過渡到CCR9highTαβ（進(jìn)入）階段，分化為成熟的CD4+或CD8+

SP細(xì)胞（圖2D）。通過細(xì)胞周期基因的表達(dá)將DN和DP細(xì)胞分為兩個(gè)階段（圖2E）。作者將具有強(qiáng)烈細(xì)胞周期特征的早期亞群稱為增殖（P），將晚期亞群稱為靜止（Q）（圖2C）。VDJ重組基因（RAG1和RAG2）的表達(dá)從增殖后期開始增加，并在靜止期達(dá)到高峰。這種模式反映了每輪重組之前T細(xì)胞的增殖。圖2.Thymicseedingofearlythymicprogenitors(ETPs)andTcelldifferentiationtrajectory(A)UMAPvisualizationofETPandfetalliverhematopoieticstemcells(HSCs)andearlyprogenitors.NMP,neutrophil-myeloidprogenitor;MEMP,megakaryocyte/erythrocyte/mastcellprogenitor.(B)ThesameUMAPcoloredbyorgan(liverinblue,thymusinyellow/red).(C)UMAPvisualizationofdevelopingthymocytesafterbatchcorrection.DN,double-negativeTcells;DP,double-positiveTcells;SP,single-positiveTcells;P,proliferating;Q,quiescent).Thedatacontaincellsfromallsampleddevelopmentalstages.Cellsfromabundantclustersaredownsampledforbettervisualization.Thereproducibilityofstructureisconfirmedacrossindividualsamples.UnconventionalTcellsareingray.(D

to

F)ThesameUMAPplotshowing

CD4,

CD8A,and

CD8Bgeneexpression(D),

CDK1

cellcycleand

RAG1

recombinationgeneexpression(E),andTCRα,productiveTCRβ,andnonproductiveTCRβVDJgenes(F).(G)HeatmapshowingdifferentiallyexpressedgenesacrossTcelldifferentiationpseudotime.Top:The

x

axisrepresentspseudo-temporalordering.Geneexpressionlevelsacrossthepseudotimeaxisaremaximum-normalizedandsmoothed.Genesaregroupedbytheirfunctionalcategoriesandexpressionpatterns.Bottom:Celltypeannotationofcellsalignedalongthepseudotimeaxis.Colorsareasin(C).(H)Scatterplotshowingtherateofproductivechaindetectionwithincellsinspecificcelltypes(x

axis)andtheratioofnonproductive/productiveTCRchainsdetectedinspecificcelltypes(y

axis).Left:TCRβ;right,TCRα.(I)Graphshowingcorrelation-basednetworkoftranscriptionfactorsexpressedbythymocytes.Nodesrepresenttranscriptionfactors;edgewidthsareproportionaltothecorrelationcoefficientbetweentwotranscriptionfactors.Transcriptionfactorswithsignificantassociationtospecificcelltypesaredepictedincolor.Nodesizeisproportionaltothesignificanceofassociationtospecificcelltypes.4.Treg和非經(jīng)典T細(xì)胞的發(fā)育除了構(gòu)成發(fā)育中胸腺T細(xì)胞中大多數(shù)的常規(guī)CD4+或CD8+T細(xì)胞外，單細(xì)胞數(shù)據(jù)還按標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行分組，確定了多種非常規(guī)T細(xì)胞類型（圖2I和圖3A和3B）。接下來，作者調(diào)查了這些非經(jīng)典T細(xì)胞的發(fā)育是否依賴于胸腺。作者認(rèn)為，如果一個(gè)細(xì)胞群體是胸腺依賴性的，它將在胸腺成熟（約10PCW）后積累，并且相對(duì)于其他造血器官會(huì)在胸腺中富集。通過繪制散點(diǎn)圖展示胎兒肝和胸腺之間以及胸腺成熟前后（10PCW）每種細(xì)胞類型的相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn)結(jié)果與這個(gè)想法一致，所有非常規(guī)T細(xì)胞都在胸腺富集，尤其是在胸腺成熟后，這表明它們是來源于胸腺（圖3D）。Tregs是胸腺中最豐富的非經(jīng)典T細(xì)胞。在αβT細(xì)胞和Tregs之間有清晰的分化軌跡，作者將過渡態(tài)定義為區(qū)分的Treg（Treg（diff））（圖3A）。相對(duì)于常規(guī)的Treg，Treg（diff）細(xì)胞的FOXP3和CTLA4表達(dá)較低，IKZF4、GNG8和PTGIR的表達(dá)則較高（圖3B）。這些基因與自身免疫和Treg分化有關(guān)。其他非經(jīng)典T細(xì)胞群體包括CD8αα+T細(xì)胞、NKT樣細(xì)胞和TH17樣細(xì)胞（圖3B）。存在三種不同的CD8αα+T細(xì)胞種群：GNG4+CD8αα+T（I）細(xì)胞，ZNF683+CD8αα+T（II）細(xì)胞和以EOMES標(biāo)記的CD8αα+NKT樣細(xì)胞亞群（圖3E）。GNG4+CD8αα+T（I）細(xì)胞和ZNF683+CD8αα+T（II）細(xì)胞在早期階段共享PDCD1表達(dá)，并在其終末分化狀態(tài)下降低。GNG4+CD8αα+T（I）細(xì)胞顯示出與DP晚期不同的軌跡（αβTSP進(jìn)入細(xì)胞），而ZNF683+CD8αα+T（II）細(xì)胞具有混合的αβ和γδT細(xì)胞信號(hào)，并位于GNG4+CD8αα+T（I）細(xì)胞和γδT細(xì)胞旁邊。圖3.IdentificationofGNG4+CD8ααTcellsinthethymicmedulla(A)UMAPvisualizationofmatureTcellpopulationsinthethymus.Axesandcoordinatesareasin圖2C.(Thecellannotationcolorschemeusedhereismaintainedthroughoutthisfigure.)(B)DotplotshowingmarkergeneexpressionforthematureTcelltypes.Genesarestratifiedaccordingtoassociatedcelltypesorfunctionalrelationship.(C)Scatterplotshowingtheratioofnonproductive/productiveTCRchainsdetectedinspecificcelltypesinTCRαchain(x

axis)andTCRβchain(y

axis).ThegrayarrowindicatesatrendlinefordecreasingnonproductiveTCRchainratioinunconventionalversusconventionalTcells.(D)Scatterplotshowingtherelativeabundanceofeachcelltypebetweenfetalliverandthymus(x

axis)andbeforeandafterthymicmaturation(delimitedat10PCW)(y

axis).Grayarrowindicatestrendlineforincreasingthymicdependency.(E

to

H)ScatterplotscomparingthecharacteristicsofunconventionalTcellsbasedon

CD8A

versus

CD8B

expressionlevels(E),

KLRB1

versus

ZBTB16

expressionlevels(F),TCRαproductivechainversus

TRDC

detectionratio(G),and

TRDV1

versus

TRDV2

expressionlevels(H).Grayarrowsorlinesareusedtosetboundariesbetweengroups[(E),(G),(H)]ortoindicatethetrendofinnatemarkergeneexpression(F).(I)RNAsmFISHshowing

GNG4,

TNFRSF9,and

CD8A

ina15PCWthymus.Lowerrightpanelshowsdetectedspotsfromtheimageontopofthetissuestructurebasedon4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)signal.Colorschemeforspotsisthesameasintheimage.(J)FACSgatingstrategytoisolateCD8αα(I)cells(live/CD3+/CD4–/CD137+)andSmart-seq2validationofFACS-isolatedcellsprojectedtotheUMAPpresentationoftotalmatureTcellsfromthediscoverydataset(lowerleft).

GNG4

expressionpatternisoverlaidontothesameUMAPplot(lowerright).5.胸腺髓質(zhì)中GNG4+CD8ααT細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和表征在確定了非經(jīng)典T細(xì)胞及其在胸腺T細(xì)胞發(fā)育中的起源后，作者將重點(diǎn)放在新型GNG4+CD8αα+T（I）細(xì)胞上，因?yàn)樗鼈兙哂歇?dú)特的基因表達(dá)譜（GNG4，CREB3L3和CD72），這與CD8αα+T（II）細(xì)胞形成對(duì)比，CD8αα+T（II）表達(dá)CD8αα+T細(xì)胞的已知標(biāo)記基因，例如ZNF683和MME（53）。此外，胸腺遷徙的調(diào)節(jié)因子KLF2在CD8αα+T（I）細(xì)胞中的表達(dá)水平極低，這表明它們可能是胸腺駐留（圖3B）。為了定位和驗(yàn)證CD8αα+T（I）細(xì)胞，作者在胎兒胸腺組織切片中進(jìn)行了靶向GNG4的RNAsmFISH，GNG4RNA探針鑒定出一組富含胸腺髓質(zhì)并與CD8ARNA共定位的細(xì)胞（圖3I）。由于CD137是CD8αα+T（I）細(xì)胞和Tregs的表面marker基因，作者使用該marker富集了這些細(xì)胞，然后使用CD3+CD137+CD4-FACS進(jìn)一步細(xì)化，這樣能夠特異性富集CD8αα+T（I）細(xì)胞，并通過Smart-seq2scRNAseq確認(rèn)其身份，從而為這些細(xì)胞提供更多的轉(zhuǎn)錄表型（圖3J）。6.胸腺細(xì)胞選擇的DC招募和激活T細(xì)胞的選擇由特異性的TEC和DC協(xié)調(diào)。作者首先確定了三個(gè)以前表征明確的胸腺DC亞型：DC1（XCR1+CLEC9A+），DC2（SIRPA+CLEC10A+）和pDC（IL3RA+CLEC4C+）。然后作者還鑒定了以前沒有描述的細(xì)胞群，稱其為“活化的DC”（aDC），其特征在于LAMP3和CCR7表達(dá)（圖4A和B）。aDCs表達(dá)高水平的趨化因子和共刺激分子，以及轉(zhuǎn)錄因子，表明它們可能與人類扁桃體和胸腺中先前描述的AIRE+CCR7+DC相對(duì)應(yīng)。單細(xì)胞數(shù)據(jù)揭示了aDC組中的三個(gè)亞組，分別由不同的基因表達(dá)譜識(shí)別：aDC1、aDC2和aDC3（圖4A和B）。aDC1和aDC2亞型分別與DC1和DC2共享部分標(biāo)記基因。為了系統(tǒng)地比較aDC亞型和經(jīng)典DC，作者通過總結(jié)marker基因的表達(dá)來計(jì)算每個(gè)DC亞群的同一性得分，并證明了aDC1-DC1和aDC2-DC2對(duì)之間存在明確的關(guān)系，這表明每種aDC亞型均來自不同的DC群體。有趣的是，aDC1和aDC2顯示出不同的趨化因子表達(dá)模式，這說明了這些aDC的功能多樣化（圖4B）。此外，相對(duì)于其他aDC亞群，aDC3細(xì)胞的II類主要組織相容性復(fù)合物（MHC）和共刺激分子表達(dá)降低，這可能反映了激活后的DC狀態(tài)。確定了兩個(gè)典型的TECs和各種DC亞群后，作者再使用CellPhoneDB分析來鑒定這些抗原呈遞細(xì)胞與分化T細(xì)胞之間的特異性相互作用。圖4.Recruitmentandactivationofdendriticcellsforthymocyteselection(A

and

B)UMAPvisualizationofthymicDCpopulations(A)anddotplotoftheirmarkergenes(B).(C)HeatmapofchemokineinteractionsamongTcells,DCs,andTECs,wherethechemokineisexpressedbytheoutsidecelltypeandthecognatereceptorbytheinsidecelltype.(D)SchematicmodelsummarizingtheinteractionsofTECs,DCs,andTcells.Theligandissecretedbythecellatthebeginningofanarrow,andthereceptorisexpressedbythecellattheendofthatarrow.(E)Left:RNAsmFISHdetectionof

GNG4,

XCR1,and

FOXP3

in15PCWthymus.Right:ComputationallydetectedspotsareshownassolidcirclesoverthetissuestructurebasedonDAPIsignal.Colorschemesforcirclesarethesameasintheimage.(F

to

H)Sequentialslidesectionsfromthesamesamplearestainedforthedetectionof

LAMP3,

AIRE,and

XCR1

(F),

LAMP3,

ITGAX,and

CD80

(G),and

LAMP3and

FOXP3

(H).Spotdetectionandrepresentationareasin(E).Dataarerepresentativeoftwoexperiments.7.人TCRrepertoire構(gòu)成和選擇中的偏移從富含TCR的5’測(cè)序文庫中檢測(cè)到TCR鏈，對(duì)其進(jìn)行全長重組體的過濾，并與細(xì)胞類型注釋關(guān)聯(lián)，這樣能夠分析TCRrepertoire的形成和選擇模式（圖5A和5B）對(duì)于TCRβ位點(diǎn)，作者觀察到VDJ基因的使用存在強(qiáng)烈偏移，這種偏移從重組（DN細(xì)胞）開始到成熟的T細(xì)胞階段持續(xù)存在（圖5A）。重組信號(hào)序列（RSS）得分未能解釋該偏移。在小鼠中觀察得到偏移確實(shí)與基因組位置有很好的相關(guān)性，這與基因座的環(huán)狀結(jié)構(gòu)是一致的（圖5C），但是在小鼠中未發(fā)現(xiàn)在人體內(nèi)可以觀察到的V基因使用偏移。作者還觀察到D2基因與J2基因有優(yōu)先關(guān)聯(lián)，而D1基因可以與J1和J2基因以相似的頻率重組。TCRβV-D或V-J對(duì)之間則沒有明確的關(guān)聯(lián)。對(duì)于TCRα位點(diǎn)，作者發(fā)現(xiàn)發(fā)育時(shí)機(jī)與VJ配對(duì)之間存在明確的關(guān)聯(lián)：首先重組近端對(duì)，然后重組遠(yuǎn)端對(duì)（圖5B），這反過來又限制了V、J基因之間的配對(duì)。這為TCRα基因座進(jìn)行重組提供了直接證據(jù)（圖5D）。另外相對(duì)于DP細(xì)胞，近端對(duì)在成熟T細(xì)胞中耗竭，這表明在陽性選擇步驟中存在進(jìn)一步的偏差。為了研究不同細(xì)胞類型之間是否存在差異性TCRrepertoire偏倚，作者通過主成分分析比較不同細(xì)胞類型的TCRrepertoire（圖5E），觀察到CD8+T細(xì)胞和其他細(xì)胞類型清晰地分開。而且相對(duì)于其他細(xì)胞類型，CD8+T細(xì)胞的TRAV-TRAJrepertoire偏向遠(yuǎn)端V-J對(duì)（圖5F）?？紤]到遠(yuǎn)端repertoire是在TCRα重組的后期產(chǎn)生的，這可能是CD8+T譜系的反應(yīng)較慢或效率較低造成的（圖5D）。圖5.IntrinsicbiasinhumanTCRrepertoireformationandselection(A)HeatmapshowingtheproportionofeachTCRbV,D,andJgenesegmentpresentatprogressivestagesofTcelldevelopment.Genesegmentsarepo