第03章污染物的生物效應檢測1課件

第三章污染物的生物效應檢測內容提要：本章介紹了生物測試和測試方法的基本概念以及表示污染物毒性的基本參數。系統(tǒng)地介紹了毒性試驗、致突變試驗、致癌試驗、致畸試驗和微宇宙試驗的基本概念、基本原理和基本方法。環(huán)境生物學第一節(jié)生物測試及方式生物測試的定義生物測試的方式生物測試的標準化一、生物測試的定義生物測試（Bioassay）指系統(tǒng)地利用生物的反應測定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨或聯(lián)合存在時，所導致的影響或危害。所利用的生物反應包括分子、細胞、組織、器官、個體、種群、群落—生態(tài)系統(tǒng)各級水平上的反應。污染物對生物的影響非常復雜。常規(guī)的物理和化學的檢測只能測定污染物濃度，不能測定污染物對生物機體的影響—無法提供毒性效應、毒性強弱的信息。。生物測試還可提供其他的信息環(huán)境狀況對水中生命的適合度。各種環(huán)境因素例如溶解氧（DO）、酸堿度（pH）、溫度、、鹽度、混濁度等對水中生命的有利及不利的濃度或強度。環(huán)境因素對于廢物毒性的影響。廢物對某一被測試生物種的毒性。各種水生生物對某種排放廢水或污染物的相對敏感性。為滿足水污染控制的要求，廢水所應處理的程度，以及廢水處理方法的有效程度。允許的廢水排放量和允許的污染物排放濃度。有關水質標準、對廢水的要求和排放許可之間的一致性。生物測試水污染的生物測試常常被稱為毒性試驗（ToxicityTest），對大氣污染的生物測試常被稱為植物人工熏氣（ArtificialFumigationforPlant）。生物測試的優(yōu)勢方法簡單，不需要特殊儀器設備;能綜合反映污染物對生態(tài)系統(tǒng)的影響或污染狀況生物測試意義和價值：監(jiān)測環(huán)境質量的變化；確定單一污染物的安全濃度；研究多種污染物的聯(lián)合作用的生物效應；制定排污標準和環(huán)境質量標準污染物的生態(tài)風險評價（EcologicalRiskAssessment）等。二、生物測試的方式生物測試的分類受試生物的選擇生物測試的分類1根據生物測試所經歷的時間長短可以分為短期測試方式中期測試方式長期測試方式根據試驗溶液或試驗氣體的給予方式分為靜止式生物測試流動式生物測試在水污染生物測試中，流動式生物測試又可分為重復循環(huán)式更新式在大氣污染生物測試中，流動式又可分為室內動態(tài)熏氣開頂式熏氣田間全開放式熏氣生物測試的分類2根據生物測試中所用測試生物的物種可分為單物種生物測試多物種生物測試模擬生態(tài)系統(tǒng)生物測試。根據測試目的有多種分法：例如，水污染的生物測試根據目的可分為排放水的品質測試、相對毒性測試、相對敏感性測試、味或臭氣測試、生長率測試等等。根據生物測試中所測試的生物效應性質分為毒性試驗積累試驗行為試驗“三致”（致癌、致畸、致突變）試驗DNA損傷試驗等等。短期測試方式中期測試方式長期測試方式短期生物測試1短期的生物測試（ShortTermBioassays）——被測試的生物在短時間內暴露于高濃度的污染物下，測定污染物對生物機體的影響。主要用于測定半數致死濃度（LC50）半數抑制濃度（IC50）半數效應濃度（EC50）這種試驗也可指示出在做中期或長期試驗時所應使用的毒物濃度。根據所用測試生物（受試生物）物種的不同，其測試時間也不同。例如水污染的短期生物測試中，一般來說，藻類<72h；水蚤類＜48h、魚類＜96h其最長不超過8d。短期生物測試2短期生物測試的實用價值或目的:快速估計污染物的毒性評定幾種不同的毒物或廢物對某種生物的相對毒性評定不同生物對不同的條件如溫度、pH的相對敏感性等短期生物測試應注意的問題—避免其他因素干擾測試結果大多數采用靜止式，但如遇下列情況應采用流動式:對于易揮發(fā)或不穩(wěn)定污染物應采用流動式因為在試驗過程中污染物濃度會降低，受試生物對污染物的暴露程度會逐漸減少。對于代謝速率快的受試生物在短期測試中也不用靜止式而應該用流動式因為排出代謝廢物較多，代謝廢物的累積和分解會產生不適當的高濃度二氧化碳和氨，從而影響試驗結果。對于BOD較高的工業(yè)廢水和生活污水應采用流動式因為溶解氧的耗盡會對受試生物造成壓迫中期生物測試

中期生物測試（InterinediateTermBioassays）是介于短期和長期之間的一類生物測試。在短期與中期或在中期與長期之間，沒有嚴格的區(qū)分。一般來說，8d之內算做短期，8d到90d的算做中期。中期的試驗可以是靜止式和流動式，但在大多數情況下采用流動式。長期生物測試1長期生物測試（LongTeimBioassays）——指在低濃度污染物作用下，暴露時間要盡可能長達受試生物的整個生活史的一類生物測試，又稱為全部生活史的生物測試（CompleteLife-cycleBioassays）。對動物來說，要從一個卵期到下一代的卵期或更長，連續(xù)進行。對更小的生物（如浮游生物）則可持續(xù)好幾代。但有些生物的生活史很長，甚至長達數年，因此，人們選用在整個生活史中的最敏感幾個階段來進行，又稱為部分生活史的生物測試（PartialLife-cycleBioassays）。例如人們選用某些魚的早期發(fā)育階段來進行水污染的長期生物測試。中期生物測試2長期生物測試的目的——測定出在持續(xù)情況下不造成有害效應的毒物最大濃度或最大允許毒物濃度（MATC）。其間包括毒物對生長、生殖、有性生殖產物的發(fā)育、成熟、產卵、孵卵的成功性、幼體的成活（Survival）、不同生命階段的生長與存活、以及對畸形、行為和生物積累等的影響。長期的生物測試只能采用流動式。長期的生物測試需注意的問題：要保證試驗的環(huán)境條件如pH、硬度、溫度等和自然界的季節(jié)變化相符合，試驗中有性生殖產物的發(fā)育、生長等則必須合乎自然季節(jié)的規(guī)律。二、生物測試的方式生物測試的分類受試生物的選擇受試生物的選擇在生物測試中，受試生物必須符合以下條件：受試生物對試驗毒物或因子要具有敏感性。受試生物應具有廣泛的地理分布和足夠的數量，并在全年中在某一實際區(qū)域范圍內可獲得。受試生物應是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，具有重大的生態(tài)學價值?！猭eystonespecies在實驗室內易于培養(yǎng)和繁殖。受試生物應具有豐富的生物學背景資料，人們已較清楚了解受試生物的生活史、生長、發(fā)育、生理代謝等等。受試生物對試驗毒物或因子的反應能夠被測定，并具有一套標準的測定方法或技術。受試生物應具有重要的經濟價值和旅游價值，應考慮與人類食物鏈的聯(lián)系。受試生物的個體大小和生活史的長短，以前曾否有過接觸待測試物等異常情況，例如曾經受污染的情況等等。目前，實驗室只能培養(yǎng)少數受試生物，大量的受試生物需從野外采集獲得。三、生物測試的標準化許多因素能影響生物測試的結果，主要有三方面的因素：受試生物年齡、生活階段、尺寸大小、季節(jié)、脫皮階段、食物等均影響生物對毒物的敏感性；試驗條件受試生物的試驗的溫度、水質的溫度和鹽分、水流速度、溶解氧、受試生物的總量、試驗溶液的pH值和構成試驗裝置材料等不同的實驗室實驗室的人員的操作水平、儀器設備和采用的統(tǒng)計分析方法等這些因素中的每J種都能影響測試結果，人們可能把這種影響錯誤地歸因于污染物的差別，因而測試過程必須盡可能地予以標準化。測試方法標準化有以下一些優(yōu)點：①在同一類型的不同實驗室中進行許多有用的測試并把結果一致的測試選擇出來。②增加數據的精確度。③測試可以被其他實驗室重復。④各種人員容易進行該試驗。⑤可方便地將數據進行比較。⑥可為環(huán)境管理、環(huán)境立法（環(huán)境標準建立）提供可靠的數據或結果。生物測試標準方法美國試驗和材料學會（AmericanSocietyforTestingandMaterials,ASTMStandardGuideforPerformanceofLifetimeBioassayfortheTumorigenicPotentialofImplantMaterialsStandardGuideforConductingIn-situFieldBioassaysWithCagedBivalvesrStandardTestMethodforObtainingaPharmacologicalProfilewithMice,etc.經濟合作發(fā)展組織（OrganizationforEconomicCooperationDevelopment，OECD）美國國家環(huán)保局（USEPA）等。我國近年來也頒布了一些標準化的生物測試方法:1991年9月14日頒布、于1992年8月1日開始實施：《水質物質對蚤類（大型蚤）急性毒性測定方法（GB／T13266－91）》《水質物質對淡水魚（斑馬魚）急性毒性測定方法（GB／r13267一91）》在標準化的生物測試中，對重要的因素值作了規(guī)定，例如光照周期、生物大小、生物量、溶解氧和pH等，并且對統(tǒng)計方法、毒物分析方法、環(huán)境條件的測定方法等作出了統(tǒng)一的規(guī)定。標準化生物測試方法的缺陷例如，非常見的污染物、易分解污染物和混合污染物等，目前通過標準化方法還難于進行，因此，還必須發(fā)展更多的標準化的生物測試方法。第二節(jié)一般毒性試驗一、生物毒性的基本概念二、急性毒性試驗三、亞慢性和慢性毒性試驗一、生物毒性的基本概念毒物與中毒表示毒性的常用參數毒物（Toxicant）1在一定條件下，以較小劑量給予機體時，能與生物相互作用，引起生物體功能或器質性損傷的化學物質，或劑量雖微，但累積到一定的量，就能干擾或破壞機體的正常生理功能，引起暫時或持久性的病理變化，甚至危及生命的化合物，亦稱毒物。一定條件兩個方面小劑量→功能損傷微劑量→累積→干擾破壞功能毒物與非毒物之間并不存在絕對的界限，而只能以引起中毒的劑量大小相對地加以區(qū)別。毒物（Toxicant）2討論一種化學物質的毒性時，必須考慮到它進入機體的數量（劑量）方式（經口食人、經呼吸道吸人、經皮膚或粘膜接觸）時間分布（一次或反復多次給予）。其中最基本的因素是劑量—只有達到中毒劑量—才是毒物Paracelsus有名言：“毒物本身并非毒物，主要是劑量才使一個物質變成毒物”。這就是說，在體內潛在性有毒物質的存在，并不意味著發(fā)生了中毒。在我們人體內，大多數含有一定量的鉛、汞和DDT，但并不能說這些物質已使我們發(fā)生了中毒。實際上，任何物質，甚至純水，當服用達到中毒劑量時都是有毒的。毒物（Toxicant）3毒物的種類按其用途及分布范圍可分為：工業(yè)毒物、環(huán)境污染物、食品中有害成分、農用化合物、嗜好品、化妝品、其他日用品中的有害成分、生物毒素、醫(yī)用藥物、軍事毒物、放射性同位素等等分類—化學形態(tài)、制毒部位、作用性質無機毒物—金屬、類金屬（砷）、非金屬（氟化物，氰化物—氰化鉀對人的致死劑量0.1-0.3g）、氣體有機毒物—石油、多氯聯(lián)苯、酚、多環(huán)芳烴（PAH）、合成洗滌劑、有機金屬化合物、殺蟲劑（主要有5大類：有機氯（DDT、六六粉，殘留）、有機磷（抗藥性）、氨基甲酸酯（有機氮、易分解、選擇性強）、有機汞、有機砷）、除草劑、殺真菌劑、藥物、生物毒素。中毒（Intoxication）中毒—生物體受到毒物作用引起功能或器質性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)。例如達到中毒劑量的有機磷農藥進入機體后，使生物出現(xiàn)震顫、出汗、流涎、瞳孔縮小等一系列的中毒癥狀。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)（包括局部的和全身的）。根據病變發(fā)生發(fā)展的快慢，可區(qū)分為急性中毒亞急性中毒慢性中毒。毒性（Toxicity）是指有毒物質接觸或進入機體后，引起生物體的易感部位產生有害作用的能力。毒性作用或毒效應：化學物引起生物體損害的總稱為毒性作用（toxiceffect）。毒性作用可通過觀測的方法來判斷。例如，有機磷農藥對膽堿酯酶有抑制作用；苯可抑制造血功能導致貧血；強酸、強堿可引起局部的皮膚的傷等等。同種化合物作用于機體時，并不一定只產生一種毒性效應。外來化合物對機體的毒性效應類型效應類型注釋致死個體死亡。無脊椎動物停止運動及植物生長停止。生長機體長、寬度及生物量改變生殖生活史中與生殖后代有關的指標改變早期發(fā)育可包括在生殖效應中，有時亦可單獨測試形態(tài)結構包括各種器官可見性損傷，難于定量化行為異常行為。如魚類的非協(xié)調性游泳等無損害作用（Non-adverseEffect）：一般認為無損害作用的特點是不引起機體形態(tài)、生長發(fā)育和壽命的改變；不引起機體功能容量（FunctionalCapacity）的降低和對額外應激狀態(tài)代償能力的損害；所引起的生物學變化一般是可逆的，當停止接觸化學物后，不能檢出機體維持體內穩(wěn)態(tài)（Homeostasis）能力的降低；也不能使機體對其他環(huán)境因素不利影響的易感性增強。損害作用（AdverseEffect）：生物體接觸外來化學物期間或停止接觸后，機體維持體內的穩(wěn)態(tài)能力下降是不可逆的，對某些環(huán)境因素不利影響的易感性增高，代謝速度降低和酶系的相對活力發(fā)生異常改變。效應與反應效應（Effect）表示接觸一定劑量化學物質引起機體個體發(fā)生的生物學變化。例如接觸某些有機磷農藥可引起膽堿酯酶活力降低，即為有機磷農藥引起的效應。對個體水平而言—基因型差異反應（Response）是接觸一定劑量化學物質后，表現(xiàn)一定程度某種效應的個體在一個群體中所占的比例。例如由于接觸某種化學物質引起死亡的動物占該群動物的50％。對群體（種群）水平而言—種群間的遺傳差異劑量—效應關系（Dose－effectRelationship）和劑量一反應關系（dose-responseRelationship）DER—表示一種化學物質攝入量與每個個體所呈現(xiàn)的某種性質的生物學變化強度之間的關系。DRR—指一種化學物的劑量與群體中呈現(xiàn)某種效應并達到一定強度的個體在群體中所占比例的關系。DER—不同劑量在個體或群體中表現(xiàn)出來的量效應大小之間的關系，DRR—不同劑量與質效應發(fā)生率之間的關系。劑量反應關系是評價化學物質的毒性和確定安全接觸水平的基本依據。因此，測定這種關系是毒性試驗和化學物質安全評價的基本內容之一。DER和DRR可用曲線表示—橫坐標：劑量；縱坐標：效應、反應；直線型—成正比拋物線型—非線型關系，隨劑量增加，效應或反應強度也增加，增加的速率先快后慢S形曲線型—多數是此類型危害性（Hazard）和危險性（Risk）危害性：有毒物質在與機體接觸或使用過程中，有引起中毒的可能性。危害性與毒性不同，任何一種毒物不論其毒性強弱，其危害性大小取決于動物是否與它接觸過以及該物質進入機體的能力和數量。在評價毒物的毒性及危害性時，應考慮多方面的因素，單憑它的絕對毒性是不夠的，還必須考慮到這種物質的揮發(fā)性和在水（或血液）中的溶解性。揮發(fā)性小易溶于水或血液中并能迅速達到中毒濃度的化學物質其危害性就大，反之則小。危險性：某化學物質在正常生產使用條件下，能引起機體發(fā)生中毒的可能性稱為該物質的危險性。例如，如果是脂性物質，則易蓄積在脂肪中，不僅影響機體的脂肪代謝，而且具有慢性中毒的危險性。表示毒性的常用參數毒性參數——污染物的毒性大小、不同污染物的毒性毒性參數在量的概念上——必須具備同一性和等效性一些常用的毒性參數：致死劑量或致死濃度最大無作用劑量最小有作用劑量毒作用帶半數效應濃度半數抑制濃度致死劑量或致死濃度（LethalDose，LD或LethalConcentration，LC）表示一次染毒后引起受試動物死亡的劑量或濃度。但在一群體中，死亡個體的多少有很大程度的差別，所以對致死量還應進一步明確下列幾種概念。①絕對致死劑量或濃度（AbsoluteLethalDose，LD100；AbsoluteLethaIConcentration，LC100）——表示一群動物全部死亡的最低劑量或濃度。②半數致死劑量或濃度（MedianLethalDose，LD50；MedianLethalConcentration，LC50）——能引起一群動物的50％死亡的最低劑量或濃度。③最小致死劑量或濃度（MinimumLethalDose，MLD，MinimumLethalconcentration，MLC）——能使一群動物中僅有個別死亡的最高劑量或濃度。④最大耐受劑量或濃度（MaximumToleranceDose，LD0，MaximumToleranceConcentration，LC0）——能使一群動物雖然發(fā)生嚴重中毒，但全部存活無一死亡的最高劑量或濃度。最大無作用劑量（MaximumNo-EffectLeve1）外來化合物對機體的損害作用或毒作用表現(xiàn)為引起機體發(fā)生某種生物學變化。一般說來，此種生物學變化隨劑量的遞減而減弱。當外來化學物的劑量減到一定量但尚未到零時，生物學變化已達到零，即不能再觀察到外來化學物所引起的生物學變化，此劑量即為最大無作用劑量。最大無作用劑量是評定外來化合物毒性作用的主要依據每日容許攝人量（AcceptableDailyIntake，ADI）——人類終生每日攝人該外來化學物對人體不致引起任何損害作用的劑量。最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration，MAC）——某一環(huán)境污染物可以在環(huán)境中存在而不致對人體造成任何損害作用的濃度。未覺察反應濃度NOEC——指化學物在一定時間內，按一定方式與機體接觸，按一定的檢測方法或觀察指標，不能觀察到任何損害作用的最高劑量。

最小有作用劑量（MinimalEffectLevel）和最小有作用濃度環(huán)境中存在某些環(huán)境污染物能引起機體開始出現(xiàn)毒性反應所必需的最低濃度。最小有作用劑量一般都是略高于最大無作用劑量最小有作用劑量＝中毒閾劑量（Thresholdlevel）。最低覺察反應濃度LOEC——是指能使機體發(fā)生某種異常變化所需的最小劑量，即能使機體開始出現(xiàn)毒性反應的最低劑量。毒作用帶（ToxicEffectZone）是一種根據毒性和毒性作用特點來綜合評價外來化合物危險性的指標。急性毒性作用帶（Acute-ToxicEffectzone）比值愈大，外來化合物引起死亡的危險性就愈?。槐戎涤?，則引起死亡的危險性就愈大。慢性毒性作用帶（ChronicToxicEffectZone）比值愈大，表明引起慢性毒性中毒的可能性愈大；比值愈小，引起慢性中毒的可能性愈小，而引起急性中毒危險性則相對較大。急性毒性作用帶=半數致死量急性毒性最小有作用劑量急性毒性作用帶=半數致死量急性毒性最小有作用劑量半數效應濃度（MedianEffectConcentration，EC50）——是指能引起50％受試生物的某種效應變化的濃度。通常指非死亡效應。半數抑制濃度（MedianInhibitionConcentration，IC50）——是指能引起受試生物的某種效應50％抑制的濃度。安全濃度通過整個生活周期甚至持續(xù)數個世代的慢性實驗，對受試生物確無影響的毒物濃度?？捎寐栽囼灲Y果直接求得，也可以通過急性試驗估計。常用的經驗公式有：毒物單位吸入毒物——在空氣中的濃度—mg／m3、mg／L哺乳動物——mg／kg、ml／kg體重表示水環(huán)境中毒物——mg／L、ug／L偶爾也用每單位體表面給藥量即mg／m2表示。毒性分級按所屬毒性級采取相應的防護措施；制定環(huán)境質量標準。EPA—劇毒、高度、中等毒、低毒日本—三級中國工業(yè)急性毒性分級—劇毒、高毒、中等毒、低毒、微毒分級方法、標準和毒性級的名稱很不統(tǒng)一，要統(tǒng)一也比較困難。第二節(jié)一般毒性試驗一、生物毒性的基本概念二、急性毒性試驗三、亞慢性和慢性毒性試驗二、急性毒性試驗急性毒性試驗（AcuteToxicityTest）是研究化學物質大劑量一次染毒或24h內多次染毒動物所引起的毒性試驗。目的——在短期內了解該物質的毒性大小和特點，并為進一步開展其他毒性試驗提供設計依據。哺乳動物急性毒性試驗水生生物急性毒性試驗蚯蚓急性毒性試驗哺乳動物急性毒性試驗實驗通常采用一種以上嚙齒動物。一般選用小鼠和大鼠。毒物經皮可用兔和豚鼠。文獻查閱—類似污染物的LD50（LC50）預試驗：設置以3倍之差的3個劑量組，每組3只動物動物全活、全死劑量

全活全死劑量之間設5～6個劑量組，各組間距按1.2～1.5等比級數設計染毒

觀察兩周內的死亡情況

剖檢死亡和瀕死動物及部分存活動物，做大體病理解剖檢查

計算LD50或LC50、標準誤

急性毒性分級標準評定其毒性大小

水生生物急性毒性試驗魚類毒性試驗水蚤類急性毒性試驗藻類急性毒性試驗魚類毒性試驗實驗用魚的選擇具有一定區(qū)域代表性便于在實驗條件下飼養(yǎng)對化學物質較為敏感的魚實驗條件實驗容器——玻璃缸或白搪瓷桶盛水量——每條魚2～3L水為宜pH值為6.7～8.5冷水溫度為12℃～18℃，溫水溫度為20℃～28℃，水溫變化為±2℃。溶解氧不能低于4mg∕L來源—清潔的河水、湖水或放置3天以上的自來水。全活全死劑量之間按等對數間距設5～7個劑量組，1對照組，每組10～20尾魚

染毒48-96hrs定期觀察（24hrs），記錄中毒反應及死亡時間，死亡魚立即取出剖檢

試驗期間保持溶解氧、pH值、水溫等的穩(wěn)定

計算各時間組LD50或LC50

急性毒性分級標準評定其毒性大小

預試驗水蚤類急性毒性試驗100多年前，就有人用它來檢測藥物的毒性世代周期短，實驗室易培養(yǎng)，裝置簡單，省人力大型水蚤（DaphniamagnaStraus）是水蚤屬中個體最大的種類，系水蚤類毒性試驗的標準生物，試驗用水蚤一般為孤雌生殖新生蚤（＜24h）。參考國家環(huán)保局《環(huán)境監(jiān)測技術規(guī)范》（第四冊）生物監(jiān)測（水環(huán)境部分）蚯蚓急性毒性試驗—土壤赤子愛勝蚓（Eisenia

foefida）濾紙接觸毒性試驗—初篩人工土壤試驗整個試驗期為14d每一處理組和對照組應有4個平行樣藻類急性毒性試驗水體中的藻類——初級生產者生物量受有害物質的影響IC50值——生長率抑制50％的毒性濃度測試指標：光密度細胞數葉綠素含量細胞干重。三、亞慢性和慢性毒性試驗實際中多數接觸低于急性中毒劑量或濃度亞慢性和慢性毒性試驗實際情況的毒作用資料。亞慢性毒性試驗

（SubchronicToxicityTest）亞慢性毒性試驗是在相當于動物生命周期的1∕30～1∕20時間內使動物每日或反復多次接觸受試物的毒性試驗。目的——進一步對受試物的主要毒作用、靶器官和最大無作用劑量或中毒閾劑量作出估計。為慢性試驗觀察指標以及實驗設計提供參考。亞慢性毒性試驗程序（哺乳動物為例）1實驗動物及分組種類選擇—對受試物敏感，與預計慢性毒作用試驗一致兩種試驗動物—嚙齒類和非嚙齒類健康、年幼的個體，體重均值相近（超過組平均體重的＋20％）每組數量—嚙齒類20只，非嚙齒類4-6只，雌雄各半分組—至少設3個劑量組和一個對照組。亞慢性毒性試驗程序（哺乳動物為例）2染毒劑量及實驗期限適宜的劑量為高劑量組能引起明顯中毒反應，但不引起很多動物死亡；低劑量組不引起任何中毒反應；介于二者之間的為中間劑量組。另設一組對照組。一般用LD50（LC50）的1∕80～1／50作為亞慢性試驗劑量。試驗期限隨目的和要求或動物不同而異，大鼠可為90d，較大的動物可為4～6月。亞慢性毒性試驗程序（哺乳動物為例）3盡量模擬人類在環(huán)境中實際接觸的方式或途徑與預期進行慢性毒作用試驗的接觸途徑相一致。主要途徑胃腸道（經口）呼吸道皮膚接觸。亞慢性毒性試驗程序（哺乳動物為例）4觀察指標一般綜合指標：觀察動物的一般活動、癥狀和死亡情況，每周稱重一次，記錄飼料或飲水量，計算生長率（各組每周攝人食量與體重增加量之比），并計算臟器濕重與單位體重的比值（臟器系數）。血液及生化檢驗：主要指血清和肝、腎功能的檢驗。常規(guī)項目包括血紅蛋白、紅細胞數、白細胞數、血小板數、谷草轉氨酶、血清尿素氮等。病理組織學檢查：在外來化合物的亞慢性毒作用試驗中應重視病理組織學檢查，必要時還可進行組織化學和電鏡檢查。實驗過程中解剖死亡或瀕死動物。實驗結束時，處死所有動物進行尸檢。如未見明顯病變，可將高劑量組和對照組的主要臟器進行病理學檢查，發(fā)現(xiàn)病變后再對較低劑量相應器官組織進行檢查。特別要注意肝、腎、睪丸等器官。亞慢性毒性試驗程序（哺乳動物為例）5試驗評價對受試物的主要作用、靶器官和最大無作用水平及中毒閾劑量作出初步估計，并為進一步開展慢性毒性試驗提供依據。慢性毒性試驗（ChronicToxicityTest）以低劑量外來化合物，長期與試驗動物接觸，觀察其對試驗動物所產生的生物學效應的試驗。目的—-確定最大無作用劑量，為制訂人體每日允許攝人量（AllowableDailylntake，ADI）和最高容許濃度（MaximumAllowableConcentration，MAC）提供毒理學依據。哺乳動物的慢性毒性試驗水生生物的慢性毒性試驗哺乳動物的慢性毒性試驗試驗動物及分組：年齡應低于亞慢性試驗染毒劑量和實驗期限：可根據亞慢性實驗資料，取其最低中毒劑量的1∕10、1／20、及1∕50（或LD50的l／100～1／20中取3～4個劑量）。試驗期限為1～12個月，如包括致癌實驗應18～24個月。染毒途徑：同亞慢性毒性試驗。觀察指標：①定期體重檢測②血液學及其他生長指標的測定③對病理檢查作半定量的評定，即除對剖檢及組織學檢查加以詳細描述外，還需根據病變程度加以分級評分試驗評價：依據敏感觀察指標出現(xiàn)異常的最小閾劑量，找出該受試物慢性毒作用的最大無作用劑量，為受試物能否應用或為制訂其在環(huán)境中衛(wèi)生標準，提供最重要的參考依據。由于試驗是在受試動物生命期的絕大部分時間進行，其間通過對動物的一般觀察及其對各臟器的病理學檢查，對受試物的致癌性評定亦可提供一個有參考價值的依據。水生生物的慢性毒性試驗用途——可以指示干擾水生生物的正常生長、發(fā)育和繁殖能力的化學物質濃度。方法——在試驗中，除對照組外所有的試驗種群暴露在不同濃度的化學物質中連續(xù)一段足夠長的時間，每個種群在規(guī)定的時間內觀察其死亡、生長到性成熟并產卵；估計產卵數、孵化率、幼體成活率及其數目、體長、體重的增加，到成體性成熟可能產生的卵及其子代生命周期的影響這些都與對照進行比較。收集這些定量的生物學數據后，用統(tǒng)計學處理檢驗與對照之間是否有顯著性差異，以確定其影響濃度。種類——無脊椎動物：（淡水如大型蚤，海水如糠蝦）脊椎動物：（淡水如鯉魚、鯽魚，海水如蹲魚）。暴露時間——魚類最少6～12月或更長，無脊椎動物3～4周或更長。實驗室慢性毒性試驗的結果直接外推到水環(huán)境存在一定的差異。最大可接受毒物濃度（MaximumAcceptableToxicConcentration，MATC）統(tǒng)計學分析有顯著影響的閾濃度一個假設的濃度，有一定限范圍未覺察反應濃度NOEC＜MATC＜最低覺察反應濃度LOEC應用因子（AF）把化學物質對水生生物急性毒性和慢性毒性聯(lián)系起來。例如某化學物質急性毒性96hLC50是10mg／L，MATC