白細(xì)胞檢驗(yàn)的基本方法課件

第八章

白細(xì)胞檢驗(yàn)的基本方法

主要內(nèi)容一、白細(xì)胞功能檢驗(yàn)二、白細(xì)胞代謝及其產(chǎn)物檢驗(yàn)三、白細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢驗(yàn)四、白細(xì)胞免疫標(biāo)記及血清粒細(xì)胞抗體檢測(cè)白細(xì)胞分類粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞單核-巨噬細(xì)胞中性粒細(xì)胞嗜堿性粒細(xì)胞嗜酸性粒細(xì)胞T細(xì)胞NK細(xì)胞B細(xì)胞白細(xì)胞白細(xì)胞檢驗(yàn)：運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)及核醫(yī)學(xué)的相關(guān)技術(shù)對(duì)白細(xì)胞的功能、代謝及其動(dòng)力學(xué)進(jìn)行的檢驗(yàn)。白細(xì)胞功能檢驗(yàn)：主要著眼于白細(xì)胞吞噬功能、趨化作用及殺菌作用的檢驗(yàn)?；诩?xì)胞水平。白細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢驗(yàn)：從細(xì)胞增殖周期動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞生長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)兩部分對(duì)細(xì)胞進(jìn)行的檢驗(yàn)。第一節(jié)白細(xì)胞功能檢驗(yàn)吞噬功能試驗(yàn)

一、墨汁吞噬試驗(yàn)

二、細(xì)菌吞噬試驗(yàn)

三、吞噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)

白細(xì)胞趨化性試驗(yàn)

殺菌能力試驗(yàn)

一、硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)

二、白色念珠菌法

第一節(jié)一、墨汁吞噬試驗(yàn)【原理】血液中中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞對(duì)細(xì)菌、異物等具有吞噬作用。在一定量的肝素抗凝血中，加入一定量的墨汁，經(jīng)37℃溫育4小時(shí)，涂片染色鏡下觀察吞噬細(xì)胞對(duì)墨汁的吞噬情況，并計(jì)算吞噬率及吞噬指數(shù)?！緟⒖贾怠砍墒熘行粤＜?xì)胞吞噬率74％±15％，吞噬指數(shù)126±60；成熟單核細(xì)胞吞噬率95％±15％，吞噬指數(shù)313±86。第一節(jié)吞噬功能試驗(yàn)第一節(jié)

【臨床評(píng)價(jià)】

粒細(xì)胞的吞噬功能僅限于成熟階段，單核細(xì)胞幼稚型和成熟型都具有吞噬能力。急性單核細(xì)胞白血病M5a為弱陽(yáng)性，M5b吞噬指數(shù)明顯增高。急性粒細(xì)胞白血病（M2）、急性淋巴細(xì)胞白血病和急性早幼粒細(xì)胞白血病的原始及幼稚細(xì)胞多無(wú)吞噬能力，吞噬試驗(yàn)為陰性。急性粒-單核細(xì)胞白血病呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)鑒別有一定價(jià)值。慢性粒細(xì)胞白血病的成熟中性粒細(xì)胞吞噬能力明顯減低。

M5骨髓象的墨汁吞噬試驗(yàn)第一節(jié)二、細(xì)菌吞噬試驗(yàn)【原理】分離白細(xì)胞懸液，將待測(cè)的吞噬細(xì)胞與某種可被吞噬而又易于查見(jiàn)計(jì)數(shù)的顆粒物質(zhì)如葡萄球菌混合，溫育一定時(shí)間后，細(xì)菌可被中性粒細(xì)胞吞噬，可在鏡下觀察中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌的情況，根據(jù)吞噬率和吞噬指數(shù)即可反映吞噬細(xì)胞的吞噬功能。第一節(jié)【參考值】1.吞噬率（％）=吞噬細(xì)菌的細(xì)胞數(shù)／200個(gè)（中性粒細(xì)胞）X100％；正常人為62.8％±1.4％2.吞噬指數(shù)＝200個(gè)中性粒細(xì)胞吞噬細(xì)菌總數(shù)／200個(gè)（中性粒細(xì)胞）；正常人為1.06±0.05第一節(jié)【臨床評(píng)價(jià)】吞噬細(xì)胞分大吞噬細(xì)胞和小吞噬細(xì)胞兩大類。前者包括組織中的巨噬細(xì)胞和血循環(huán)中的大單核細(xì)胞，后者主要是中性粒細(xì)胞。本試驗(yàn)可了解中性粒細(xì)胞的吞噬功能。如吞噬率和吞噬指數(shù)增高，反映中性粒細(xì)胞吞噬異物功能的增強(qiáng)，常見(jiàn)于細(xì)菌性感染。對(duì)疑有中性粒細(xì)胞吞噬功能低下者，有幫助確診的價(jià)值。第一節(jié)三、吞噬細(xì)胞吞噬功能試驗(yàn)【原理】活體巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞在體內(nèi)外均有吞噬細(xì)菌、異物的功能，在體外將細(xì)胞與異體細(xì)胞或細(xì)菌混合孵育后，染色觀測(cè)其吞噬異體細(xì)胞或細(xì)菌的數(shù)量，可了解其吞噬功能。利用中藥斑螫（shi）在人的前臂皮膚上發(fā)皰，造成非感染性炎癥，誘使單核細(xì)胞游出血管大量聚集于皰液內(nèi)，抽取皰液則成為天然提純的吞噬細(xì)胞懸液。以雞紅細(xì)胞為靶細(xì)胞，在體外370C條件下觀察吞噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬消化活性，取試管內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行涂片染色和鏡檢并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

第一節(jié)

【參考值】

吞噬百分率（62.77±1.38）％吞噬指數(shù)1.058±0.049【臨床評(píng)價(jià)】l.吞噬細(xì)胞吞噬功能低下主要見(jiàn)于各種惡性腫瘤，吞噬率常低于45％，手術(shù)切除好轉(zhuǎn)后可以上升，故可作為腫瘤病人化療、放療、免疫治療療效的參考指標(biāo)。

2.一些免疫功能低下的病人，吞噬率降低，可作為預(yù)測(cè)感染發(fā)生的概率。并觀測(cè)療效、判斷預(yù)后的指標(biāo)。第一節(jié)白細(xì)胞趨化性試驗(yàn)【原理】在微孔濾膜的一側(cè)放入粒細(xì)胞，另一側(cè)放入趨化因子（細(xì)菌毒素、補(bǔ)體C3a、淋巴因子等），檢測(cè)離體粒細(xì)胞經(jīng)濾膜到達(dá)趨化因子這一側(cè)定向移動(dòng)的能力。【參考值】趨化指數(shù)3.0－3.5第一節(jié)

【臨床評(píng)價(jià)】趨化性是粒細(xì)胞到達(dá)炎癥局部所必需的。本試驗(yàn)是觀察粒細(xì)胞向感染灶運(yùn)動(dòng)能力的一項(xiàng)重要檢測(cè)方法。趨化功能異常可見(jiàn)于幼年型牙周炎、糖尿病、燒傷、新生兒、慢性皮膚粘膜白色念珠菌病、高IgE綜合征、先天性魚(yú)鱗病、膜糖蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量11000）缺陷癥、肌動(dòng)蛋白功能不全癥、Chediak-Hisashi（切東）綜合征。第一節(jié)殺菌能力試驗(yàn)一、硝基四氮唑藍(lán)還原試驗(yàn)【原理】硝基四氮唑藍(lán)（NBT）是一種染料，其水溶性呈淡黃色。當(dāng)被吞入或摻入中性粒細(xì)胞后，有產(chǎn)生過(guò)氧化物酶的作用，可接受葡萄糖中間代謝產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸在已糖磷酸旁路代謝中NADPH氧化脫下的氫，而被還原成非水溶性的藍(lán)黑色甲顆粒，呈點(diǎn)狀或片狀沉著在胞漿內(nèi)有酶活性的部位，可在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。【參考值】正常成人的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在10％以下。若有10％以上中性粒細(xì)胞能還原NBT，即為NBT還原試驗(yàn)陽(yáng)性；低于10％則為陰性。第一節(jié)【臨床評(píng)價(jià)】1.用于中性粒細(xì)胞吞噬殺菌功能異常的過(guò)篩鑒別和輔助診斷兒童慢性肉芽腫。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥，髓過(guò)氧化物酶缺乏癥和Job綜合征，硝基四氮唑藍(lán)（NBT）還原試驗(yàn)陽(yáng)性。

第一節(jié)

2.用于細(xì)菌感染的鑒別

3.器官移植后發(fā)熱的鑒別

4.無(wú)丙種球蛋白血癥、鐮狀細(xì)胞病、惡性營(yíng)養(yǎng)不良等NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞比例可降低。

5．新生兒、小兒成骨不全癥、心肌梗死急性期、淋巴肉瘤、NBT還原陽(yáng)性細(xì)胞比例可增高。二、白色念珠菌法【原理】白色念珠菌法是將白細(xì)胞與白色念珠菌共育后，加入亞甲藍(lán)染液做活體染色，觀察白細(xì)胞對(duì)白色念珠菌的吞噬情況?；罹恢?，被殺死的染成藍(lán)色。計(jì)數(shù)100中性粒細(xì)胞中吞噬有白色念珠菌的細(xì)胞數(shù)即為吞噬率;計(jì)數(shù)100個(gè)中性粒細(xì)胞中吞噬有被染藍(lán)色的白色念珠菌的細(xì)胞數(shù)即為殺菌率?！緟⒖贾怠客淌陕剩?.910±0.058殺菌率：0.327±0.078第一節(jié)【臨床評(píng)價(jià)】

吞噬與殺菌功能缺陷常見(jiàn)于慢性肉芽腫、肌動(dòng)蛋白功能不全、膜糖蛋白缺陷、G6PD高度缺陷等，對(duì)白念的吞噬和殺傷缺陷也見(jiàn)于嚴(yán)重感染和惡性腫瘤。第一節(jié)第二節(jié)白細(xì)胞代謝及其產(chǎn)物檢驗(yàn)

一、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)

（一）酶標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示法

（二）同位素檢測(cè)法

二、N-堿性磷酸酶檢測(cè)

三、酸性α-醋酸酯酶檢測(cè)

四、血清溶菌酶活性試驗(yàn)第二節(jié)

【原理】末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）是一種DNA聚合酶，它不需要模板的指導(dǎo)，就可以催化細(xì)胞的脫氧核苷酸，使其轉(zhuǎn)移到低聚核苷酸或多聚核苷酸的3’-OH端，合成單鏈DNA。兔抗牛TdT抗體能和人細(xì)胞的TdT產(chǎn)生交叉反應(yīng)，可采用免疫熒光技術(shù)或酶標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，用辣根過(guò)氧化物酶-抗酶復(fù)合物在細(xì)胞涂片上定位，顯示細(xì)胞內(nèi)的TdT。

【結(jié)果】陽(yáng)性反應(yīng)為棕黃色顆粒，定位在細(xì)胞核上。TdT為早期T淋巴細(xì)胞的標(biāo)志，在正常情況下不成熟的胸腺淋巴細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，正常人外周血細(xì)胞中極少或無(wú)活性。第二節(jié)酶標(biāo)免疫細(xì)胞化學(xué)顯示法末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶檢測(cè)

【臨床評(píng)價(jià)】95％以上急性淋巴細(xì)胞白血病和大約30％慢性粒細(xì)胞白血病急淋變患者外用血細(xì)胞有明顯的TdT活力，病情緩解后陽(yáng)性率逐漸減弱。在急性淋巴細(xì)胞白血病中，由于細(xì)胞表面標(biāo)志不同,TdT活性也有變化，T-ALL，早B前體-ALL細(xì)胞的陽(yáng)性率很高，B-ALL細(xì)胞陰性。當(dāng)外周血中此酶活性升高，就預(yù)示著血細(xì)胞的惡性變。因此TdT的測(cè)定對(duì)急性白血病的鑒別和治療都有一定意義。第二節(jié)

【原理】以3H或14C標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸等的dXTP為基質(zhì)，用低聚脫氧核苷（dA）等人工同聚物作為引物，由于酶反應(yīng)與引物重合，使基質(zhì)不溶于三氯醋酸，可用玻璃纖維盤(pán)將其吸附，從未被放射性核素標(biāo)記的反應(yīng)基質(zhì)中分離出反應(yīng)的生成物，計(jì)測(cè)放射活性。除去不加引物所測(cè)定的內(nèi)源性反應(yīng)所引起的活性之后，可測(cè)算酶的活性。

【參考值】正常人骨髓細(xì)胞的活性為dGTP摻入l×108個(gè)細(xì)胞的量為（0－0.09）mmol／L。第二節(jié)同位素檢測(cè)法不常見(jiàn)

【臨床評(píng)價(jià)】1．急性淋巴細(xì)胞白血病（B-ALL除外）可檢出較高的TdT活性，慢性粒細(xì)胞性白血病急性變時(shí)，約有1／3的病例在原始細(xì)胞中能檢出高活性的TdT。

2．惡性淋巴瘤中，原始淋巴細(xì)胞性淋巴瘤的淋巴結(jié)細(xì)胞中能檢出高的TdT活性。

3．此酶檢查在研究造血細(xì)胞的分化與白血病的關(guān)系、白血病細(xì)胞的起源、白血病的治療藥物選擇上都有較重要的價(jià)值。第二節(jié)

【原理】用P-硝基酚磷酸鹽作為細(xì)胞堿性磷酸酶總活性檢測(cè)的基質(zhì)，在反應(yīng)中生成P-硝基酚，測(cè)量400nm時(shí)的吸光密度，借以檢測(cè)出細(xì)胞A-Pase的總活性。此外，可通過(guò)巰乙胺-S-磷酸鹽（CASP）作為基質(zhì)來(lái)測(cè)定N-堿性磷酸酶的活性。通過(guò)酶反應(yīng)，生成半胱胺，這是用二硝基苯置換5-硫-硝基酚酸；檢測(cè)412nm的吸光密度，借以檢測(cè)N-APase的總活性。在基質(zhì)液中加人用N-丁醇：水（1：3）的混合液提取粗酶液，室溫下放置60分鐘，記錄酶反應(yīng)，求出酶反應(yīng)的速度。一般情況下，N-APase的P-NPP與CASP的水解速度之比（VP-NPP／VCASP）在1.1－2.0的范圍內(nèi)，平均為1．8。因此，N-APase的活性可用VP-NPP-1.8VCASP求出，再?gòu)腣P-NPP計(jì)算N-APase的百分率。第二節(jié)N-堿性磷酸酶檢測(cè)

【參考值】正常人的粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞中不能檢出N-APase的活性。

【臨床評(píng)價(jià)】在AML及CML慢性期、CML急性變的原粒細(xì)胞中，均不能檢出N-APase。但在ALL和CML急淋變時(shí)，原始淋巴細(xì)胞能檢出N-APase，且不僅在非T-ALL、非B-ALL的幼稚細(xì)胞，就是在T-ALL及具有B細(xì)胞標(biāo)記物的原始細(xì)胞中亦可檢出。因此，認(rèn)為此酶是從未成熟的白血病性原始淋巴細(xì)胞向T細(xì)胞、B細(xì)胞分化過(guò)程中，未成熟的淋巴系統(tǒng)的細(xì)胞標(biāo)志酶。此外，在鼻咽癌、喉癌等被認(rèn)為是病毒感染的腫瘤細(xì)胞中，以及與EB病毒有關(guān)的傳染性單核細(xì)胞增多癥、Burkitt淋巴瘤等，均可檢出此酶。第二節(jié)T細(xì)胞白血病的血象第二節(jié)

【原理】血細(xì)胞中的酸性α-醋酸酯酶（ANAE），在弱酸性（pH5.8）條件下能將基質(zhì)液中的α-醋酸萘酯水解，產(chǎn)生α-萘酚。產(chǎn)生的α-萘酯酚再與六偶氮副品紅偶聯(lián)形成不溶性暗紅色偶氮副品紅萘酚沉淀，定位于胞質(zhì)內(nèi)酶活性處，呈現(xiàn)單一的或散在的紅色點(diǎn)塊狀或顆粒狀。第二節(jié)酸性α-醋酸酯酶檢測(cè)

【結(jié)果】

酸性α-醋酸酯酶（ANAE）主要分布在T細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)；粒細(xì)胞、B細(xì)胞、紅系細(xì)胞、巨核細(xì)胞和血小板中含量較少。

T細(xì)胞為ANAE陽(yáng)性細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)有大小不等、數(shù)量不一的紫紅色顆粒或斑塊；B細(xì)胞為ANAE陰性細(xì)胞，胞質(zhì)呈黃綠色，胞質(zhì)內(nèi)無(wú)紅色斑塊；單核細(xì)胞為ANAE陽(yáng)性，其胞質(zhì)內(nèi)有細(xì)小紅褐色顆粒斑塊。第二節(jié)酸性磷酸酶染色第二節(jié)

【臨床評(píng)價(jià)】l.有助于區(qū)分T細(xì)胞和B細(xì)胞ANAE染色在T細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)點(diǎn)狀顆?；虼髩K局限陽(yáng)性反應(yīng)中細(xì)胞大多數(shù)為陰性反應(yīng)，偶見(jiàn)稀疏彌散細(xì)小顆粒。

2.鑒別急性白血病類型急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞為點(diǎn)狀或塊狀陽(yáng)性，局限分布；急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞ANAE染色大部分呈陰性或弱陽(yáng)性反應(yīng)，顆粒增多的早幼粒白血病細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)較強(qiáng)，為彌散性分布；急單呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，胞質(zhì)為均勻一致的彌散樣淡紅色或深紅色，無(wú)點(diǎn)狀顆粒。第二節(jié)血清溶菌酶活性試驗(yàn)【原理】溶菌酶能水解革蘭氏陽(yáng)性球菌的細(xì)胞壁乙酰氨基多糖成分，使細(xì)胞失去細(xì)胞壁而破裂。本試驗(yàn)以對(duì)溶菌酶較敏感的微球菌懸液為作用底物，根據(jù)微球菌的溶解程度來(lái)檢測(cè)血清或尿中溶菌酶的活性?！緟⒖贾怠?/p>

比濁法：11.8±2.2mg/L平板法：20.4±2.7mg/L免疫測(cè)定法：10~40mg/L第二節(jié)

【臨床評(píng)價(jià)】

l.血清溶菌酶含量增高可見(jiàn)于部分急性髓細(xì)胞白血病。①急性單核細(xì)胞白血病

②急性粒-單核細(xì)胞白血病

③急性粒細(xì)胞白血病

2．血清溶菌酶含量減低急性淋巴細(xì)胞白血病多數(shù)減低，少數(shù)正常。慢性粒細(xì)胞白血病血清溶菌酶含量正常，但急變時(shí)下降。第二節(jié)第三節(jié)白細(xì)胞動(dòng)力學(xué)檢驗(yàn)

第三節(jié)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)：細(xì)胞增殖周期動(dòng)力學(xué)細(xì)胞生長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)細(xì)胞增殖周期動(dòng)力學(xué)：為方便研究，人為將細(xì)胞有絲分裂過(guò)程分為G0、G1、S、G2、M期。

G0細(xì)胞靜止期G1DNA合成前期SDNA合成期G2復(fù)制、有絲分裂前期M有絲分裂期細(xì)胞生長(zhǎng)期動(dòng)力學(xué)：細(xì)胞從原始階段生長(zhǎng)到成熟階段的過(guò)程。第三節(jié)粒細(xì)胞增生、分化、成熟和釋放入外周血的過(guò)程分為四個(gè)階段動(dòng)力學(xué)過(guò)程在骨髓進(jìn)行貯存池增生池/分裂池成熟池原粒、早幼粒、中有粒細(xì)胞桿狀核and分葉核粒細(xì)胞晚幼粒細(xì)胞動(dòng)力學(xué)過(guò)程在組織和血液進(jìn)行循環(huán)池及邊緣池第三節(jié)一、氚標(biāo)記脫氧胸苷測(cè)定

二、潑尼松刺激試驗(yàn)

三、腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)

四、二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記測(cè)定

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA合成及含量

檢測(cè)方法第三節(jié)

【原理】分離的粒細(xì)胞并在培養(yǎng)過(guò)程中加入絲裂原植物血凝素PHA或特異性抗原刺激后，進(jìn)人有絲分裂期，此時(shí)加入3H-TdR，可被細(xì)胞攝入?yún)⑴cDNA合成，其摻入量與DNA合成的量以及增殖細(xì)胞數(shù)成正比，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定3H-TdR的摻入量，即可判定粒細(xì)胞的增殖水平。【參考值】刺激指數(shù)SI＜2第三節(jié)氚標(biāo)記脫氧胸苷3H-TdR測(cè)定【臨床評(píng)價(jià)】在正常情況下，體內(nèi)粒細(xì)胞在增殖池（骨髓）、循環(huán)池（血液）及邊緣池（組織）之間處于平衡狀態(tài)，末梢血中成熟粒細(xì)胞數(shù)為（2.5－5.5）×109／L。在罹患血液病等病理情況下，這種平衡狀態(tài)受到不同程度的破壞，即可能出現(xiàn)異常。研究白血病細(xì)胞動(dòng)力學(xué)時(shí)給急性白血病患者連續(xù)靜脈輸人3H-TdR，8－10天后觀察到仍有8％－10％的白血病細(xì)胞未被標(biāo)記，這一小部分白血病細(xì)胞增殖相當(dāng)緩慢。說(shuō)明白血病細(xì)胞是一群非同步化增殖的細(xì)胞。第三節(jié)

【原理】正常時(shí)骨髓中粒細(xì)胞儲(chǔ)備量大于外周血中的10－15倍，潑尼松具有刺激骨髓中性粒細(xì)胞由儲(chǔ)備池向外周血釋放的功能。如果受檢者骨髓的粒細(xì)胞儲(chǔ)備池正常，服用潑尼松后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間儲(chǔ)備池大量釋放至血流而使外周血中性粒細(xì)胞的絕對(duì)值明顯增高。反之，則無(wú)此作用或作用不明顯?？砷g接測(cè)定骨髓粒細(xì)胞池粒細(xì)胞的儲(chǔ)備功能。

【參考值】服藥后中性粒細(xì)胞最高絕對(duì)值＞20×109／L（服藥后5小時(shí)為中性粒細(xì)胞上升到高峰的時(shí)間）第三節(jié)潑尼松刺激試驗(yàn)

【臨床評(píng)價(jià)】

潑尼松試驗(yàn)可反應(yīng)骨髓中性粒細(xì)胞儲(chǔ)備池的容量。中性粒細(xì)胞減少患者，如服用潑尼松后外周血中性粒細(xì)胞最高絕對(duì)值＞20×109／L，表明患者中性粒細(xì)胞的儲(chǔ)備池正常，粒細(xì)胞減少可能是由于骨髓釋放障礙或其他因素所致。這對(duì)于某些骨髓受損引起粒細(xì)胞減少的輕微病例有一定參考及診斷價(jià)值。反之，則反映儲(chǔ)備不足。第三節(jié)

【原理】

白細(xì)胞（主要是指中性粒細(xì)胞）進(jìn)入血流后，約半數(shù)進(jìn)入循環(huán)池，半數(shù)粘附于血管壁成為邊緣池的組成成分。此部分白細(xì)胞在外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)中不能得到反映。注射腎上腺素后血管收縮，粘附于血管壁上的白細(xì)胞脫落，從邊緣池進(jìn)入循環(huán)池，致外用血白細(xì)胞數(shù)增高，其作用持續(xù)時(shí)間為20－30分鐘。分別在注射前和注射后20分鐘取血，計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞數(shù)。第三節(jié)腎上腺素激發(fā)試驗(yàn)

【參考值】粒細(xì)胞上升值一般低于（1.5－2）×109／L【臨床意義】白細(xì)胞減少者，注射腎上腺素后，如外周血白細(xì)胞能較注射前增加1倍以上或粒細(xì)胞上升值超過(guò)（1.5－2）×109／L，表示患者白細(xì)胞在血管壁粘附增多，提示病人粒細(xì)胞分布異常，即邊緣池粒細(xì)胞增多，如無(wú)牌大，可考慮為“假性”粒細(xì)胞減少。如果增高低于上述值，則應(yīng)進(jìn)行其他檢查，進(jìn)一步確定白細(xì)胞減少的病因。第三節(jié)

【原理】二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記（DF32P）是利用含有放射性磷的二異丙酯氟磷酸作為膽堿酯酶的抑制劑，與細(xì)胞上的膽堿酯酶結(jié)合，即使細(xì)胞崩解，也不再與其他細(xì)胞相結(jié)合。故對(duì)測(cè)定血液循環(huán)中細(xì)胞池的大小（poolsize）以及滯留的時(shí)間均非常方便。用于粒細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，一旦采血制成離體標(biāo)記物后，即作靜脈注射。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間再次采血。分離粒細(xì)胞，通過(guò)追蹤觀察其放射活性的變化，可測(cè)知外周血中有關(guān)粒細(xì)胞地的參數(shù)。第三節(jié)二異丙酯氟磷酸鹽標(biāo)記（DF32P）測(cè)定【參考值】l.粒細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定標(biāo)記粒細(xì)胞半衰期間（T1/2）：4－10小時(shí)；血中滯留時(shí)間：10－14小時(shí)。全血粒細(xì)胞池（TBGP）：（35－70）x107/kg

循環(huán)粒細(xì)胞池（CGP）：（20－30）xl07／kg

邊緣粒細(xì)胞地（MGP）：（l5－40）x107/kg

粒細(xì)胞周轉(zhuǎn)率（GTR）：（60－160）x107／（kg·d）第三節(jié)

2．單核細(xì)胞總數(shù)的測(cè)定標(biāo)記單核細(xì)胞半衰期：4.5－10.0小時(shí)全血單核細(xì)胞池（TBMP）：（3．9－12.7）x107／kg

循環(huán)單核細(xì)胞池（CMP）：（l．0－2．7）x107／kg

邊緣單核細(xì)胞池（MMp）：（2．4－11.7）×107／k。單核細(xì)胞周轉(zhuǎn)率（MTR）：（7．2－33．6）x107／kg

第三節(jié)【臨床評(píng)價(jià)】在慢性白血病、真性紅細(xì)胞增多癥和骨髓纖維化時(shí)，TBGP及GTR顯著增加。粒細(xì)胞半壽期明顯延長(zhǎng)。急性粒細(xì)胞白血病時(shí)有輕微的延長(zhǎng)，而再生障礙性貧血時(shí)各指數(shù)測(cè)定值均偏低。第三節(jié)流式細(xì)胞儀（FCM）是對(duì)單細(xì)胞快速定量分析和分選的新技術(shù)。當(dāng)被測(cè)細(xì)胞被制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后加入樣品管中，在氣體壓力推動(dòng)下，流經(jīng)100μm的孔道時(shí)，細(xì)胞排成單列，逐個(gè)勻速通過(guò)激光束，被熒光染料染色的細(xì)胞受到強(qiáng)烈的激光照射后發(fā)出熒光，同時(shí)產(chǎn)生散射光。熒光被轉(zhuǎn)化為電子信息，在多道脈沖高度分析儀的熒光屏上，以一維組方圖或二維點(diǎn)陣圖及數(shù)據(jù)表或三維圖形顯示，計(jì)算機(jī)快速而準(zhǔn)確地將所測(cè)數(shù)據(jù)計(jì)算出來(lái)，結(jié)合多參數(shù)分析，從而實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的定量分析。第三節(jié)流式細(xì)胞儀檢測(cè)DNA合成和含量

（一）DNA合成的檢測(cè)

【原理】與氚-胸腺嘧啶標(biāo)記法的原理一樣，用5-溴脫氧尿嘧啶摻入S期細(xì)胞的DNA，然后用抗5-BrdU抗原的特異性抗體，通過(guò)免疫熒光技術(shù)，用FCM準(zhǔn)確測(cè)定DNA合成速率。

【結(jié)果】快速提供有關(guān)細(xì)胞周期各時(shí)相分布的動(dòng)態(tài)參數(shù)，間接了解DNA的合成情況。

【臨床評(píng)價(jià)】可直接用于白血病病人體內(nèi)細(xì)胞增殖的動(dòng)態(tài)研究，據(jù)此按化療藥物對(duì)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的干擾理論設(shè)計(jì)最佳治療方案，靜止期腫瘤細(xì)胞對(duì)化療不敏感而增殖期（SG2M）敏感，可將GO期細(xì)胞分化誘導(dǎo)進(jìn)人SG2M期，再予以細(xì)胞殺傷藥物，以達(dá)到最佳殺傷瘤細(xì)胞的效果。第三節(jié)

（二）DNA含量的檢測(cè)

【原理】碘化丙啶（ProPidiumiodide，PI）熒光染料可嵌入到雙鏈DNA和RNA的堿基對(duì)中與之結(jié)合。用PI染DNA后能在指定波長(zhǎng)的光波激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，利用FCM可將細(xì)胞按不同的熒光強(qiáng)度即DNA含量分類并繪出DNA直方圖。細(xì)胞在增殖周期的不同階段，其DNA含量是不同，從DNA直方圖中可以得出細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。第三節(jié)

【結(jié)果】l.細(xì)胞中DNA含量多少用DNA指數(shù)（DI）來(lái)表示。根據(jù)DI值來(lái)判斷細(xì)胞DNA倍體的方法是：以正常同源組織細(xì)胞作為樣品2CDNA含量細(xì)胞的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)。DNA倍體的判斷標(biāo)準(zhǔn)為DI＝0.1±2CV。二倍體：DI＝1.0±2CV（直方圖上僅1個(gè)G0／G1峰）。非整倍體（aneuplid，AN）：DI值＜0.91，＞1.10。

DNA指數(shù)（DI）計(jì)算公式:樣品G0／G1期DNA量平均數(shù)÷標(biāo)準(zhǔn)二倍體DNA量平均數(shù)第三節(jié)

2.細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞比率包括：G0／G1期、5期和G2M期，計(jì)算各時(shí)相細(xì)胞的百分比。細(xì)胞增殖指數(shù)（proliferousindex，PI）（％）＝［（S＋G2M）÷（G0／G1．＋S＋G2M）］x100％第三節(jié)

【臨床評(píng)價(jià)】1.DNA非整倍體細(xì)胞是腫瘤的特異性標(biāo)志，從FCM的DNA圖形分析，可得知血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞DNA的相對(duì)含量，從而了解白血病細(xì)胞的信體水平及增殖活動(dòng)。

2.以縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)，橫坐標(biāo)表示DNA相對(duì)含量，可繪出DNA不同含量血細(xì)胞分布曲線，得到G期、S期和G2＋M期細(xì)胞的百分比，尤其對(duì)白血病病人血細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的了解更為重要。急性白血病患者在來(lái)經(jīng)治療時(shí)其骨髓細(xì)胞（大多數(shù)為白血病細(xì)胞）S％（S期細(xì)胞DNA的百分含量）明顯低于正常骨髓。第三節(jié)

3.用流式細(xì)胞儀對(duì)白血病化療后監(jiān)測(cè)藥效是目前較為靈敏的方法，對(duì)比化療后的細(xì)胞內(nèi)DNA含量表化，可迅速得出是否敏感的結(jié)論，從而指導(dǎo)臨床對(duì)初治或復(fù)發(fā)白血病病人選用和及時(shí)更換化療方案。

4.白血病病人外周血白血病細(xì)胞多處于G0或G1期。S期細(xì)胞百分率（S％）高者對(duì)常用周期特異性藥物較為敏感，患者的完全緩解率高，但容易復(fù)發(fā)。S％低者對(duì)化療不敏感，但一旦緩解，不易復(fù)發(fā)。根據(jù)增殖期細(xì)胞對(duì)周期特異藥物比靜止期細(xì)胞為敏感，應(yīng)用G-CSF來(lái)復(fù)蘇G0期白血病細(xì)胞，有利于提高化療效果。第三節(jié)第四節(jié)白細(xì)胞免疫標(biāo)記及血清粒細(xì)胞抗體檢測(cè)

一、熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)

二、堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)法檢測(cè)

三、流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)

四、粒細(xì)胞抗體檢測(cè)第四節(jié)白細(xì)胞分化抗原：血細(xì)胞在分化成熟為不同譜系、分化的不同階段及細(xì)胞活化的過(guò)程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記分子。白細(xì)胞免疫標(biāo)記檢測(cè)：利用抗人白細(xì)胞分化抗原CD系列單克隆抗體來(lái)進(jìn)行血細(xì)胞免疫標(biāo)記檢測(cè)。方法：熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)

堿性磷酸酶-抗堿性磷

流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)檢測(cè)

【原理】將抗體標(biāo)記上熒光素制成的熒光抗體，在一定條件下與細(xì)胞表面的分化抗原簇相互作用，洗去游離的熒光抗體后，結(jié)合于細(xì)胞表面的熒光素在一定波長(zhǎng)激發(fā)光照射下，發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，借此用熒光顯微鏡就可檢測(cè)到與熒光抗體特異結(jié)合的表面標(biāo)志。以鼠抗羊IgG作陰性對(duì)照，標(biāo)本中有明顯熒光現(xiàn)象就證明有相應(yīng)的抗原存在，借此對(duì)標(biāo)本中的抗原作鑒定和定位。根據(jù)標(biāo)記物和反應(yīng)程序的不同分為：直接熒光法，間接熒光法和雙標(biāo)記法，

第四節(jié)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)檢測(cè)【結(jié)果】觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度一般用＋號(hào)表示，－表示無(wú)熒光；±為極弱的可疑熒光；＋為熒光較弱但清楚可見(jiàn)；2＋為熒光明亮；3＋－4＋為熒光閃亮。計(jì)算公式：陽(yáng)性細(xì)胞率=熒光陽(yáng)性細(xì)胞/熒光陽(yáng)性細(xì)胞＋熒光陰性細(xì)胞x100％【臨床評(píng)價(jià)】主要用于研究造血細(xì)胞免疫表型、分化發(fā)育、激活增生、生物學(xué)功能及造血細(xì)胞分離純化。第四節(jié)

【原理】堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)法，是用堿性磷酸酶作為標(biāo)記物標(biāo)記已知抗體或抗抗體，進(jìn)行抗體抗原反應(yīng)。先用鼠單抗制備一種堿性磷