aflp技術(shù)表型可塑性

aflp技術(shù)表型可塑性AFLP技術(shù)是一項(xiàng)新的分子標(biāo)記技術(shù)，是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。中文名擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性外文名AFLP發(fā)明時(shí)間1995年發(fā)明人PieterVos目錄.1概述.2技術(shù)原理.3流程.4技術(shù)應(yīng)用.5技術(shù)特點(diǎn)概述AFLP（amplifiedfragmentlengthpolymorphism擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）是由荷蘭科學(xué)家PieterVos等于1995年發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)。文章發(fā)表于《NucleicAcidsResearch》Vol.23。AFLP是基于PCR技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列，作為引物結(jié)合位點(diǎn)。限制性片段用二種酶切割產(chǎn)生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點(diǎn)，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴(kuò)增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無(wú)此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過(guò)引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標(biāo)記。AFLP可在一次單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)到大量的片段。所以說(shuō)AFLP技術(shù)是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術(shù)。技術(shù)原理AFLP技術(shù)是基于PCR反應(yīng)的一種選擇性擴(kuò)增限制性片段的方法。由于不同物種的基因組DNA大小不同，基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，產(chǎn)生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴(kuò)增反應(yīng)的模板，用含有選擇性堿基的引物對(duì)模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增，選擇性堿基的種類、數(shù)目和順序決定了擴(kuò)增片段的特殊性，只有那些限制性位點(diǎn)側(cè)翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)放射性同位素標(biāo)記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后根據(jù)凝膠上DNA指紋的有無(wú)來(lái)檢驗(yàn)多態(tài)性［5］。Vos等(1995)曾對(duì)AFLP的反應(yīng)原理進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果檢測(cè)到的酶切片段數(shù)與預(yù)測(cè)到的酶切片段數(shù)完全一致，充分證明了AFLP技術(shù)原理的可靠性。進(jìn)行AFLP分析時(shí)，一般應(yīng)用兩種限制性內(nèi)切酶在適宜的緩沖系統(tǒng)中對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，一種為低頻剪切酶，識(shí)別位點(diǎn)為六堿基的rareCutter;另一種為高頻剪切酶，識(shí)別位點(diǎn)為四堿基的frequentCutter。雙酶切產(chǎn)生的DNA片段長(zhǎng)度一般小于500bp，在AFLP反應(yīng)中可被優(yōu)先擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物可被很好地分離，因此一般多采用稀有切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶與多切點(diǎn)限制性內(nèi)切酶相搭配使用的雙酶切。常用的兩種酶是4個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的MseI和6個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的EcoRI。AFLP接頭和引物都是由人工合成的雙鏈核苷酸序列。接頭(Artificialadapter)一般長(zhǎng)14,18個(gè)堿基對(duì)，由一個(gè)核心序列(CoreSeqUence)和一個(gè)酶?；蛄?EnZyme-SpecificSeqUence)組成。常用的多為EcoRI和MseI接頭，接頭和與接頭相鄰的酶切片段的堿基序列是引物的結(jié)合位點(diǎn)。AFLP引物包括三部分:5,端的與人工接頭序列互補(bǔ)的核心序列(coresequence，CORE)，限制性內(nèi)切酶特定序列(enzyme-specificsequence，ENZ)和3/端的帶有選擇性堿基的粘性末段(SelectiVeextension,EXT)。流程AFLP反應(yīng)程序主要包括模板DNA制備，酶切片段擴(kuò)增及凝膠電泳分析這3個(gè)基本步驟。各步驟具體的過(guò)程有:首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA,選擇6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。DNA片段的預(yù)擴(kuò)增。在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。GenomicAFLPcDNA-AFLP技術(shù)應(yīng)用AFLP具有可靠性好，重復(fù)性強(qiáng)，可信度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究，在動(dòng)物遺傳育種、動(dòng)物基因組研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。如:構(gòu)建遺傳連鎖圖譜利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記AFLP輔助的輪回選擇育種利用AFLP技術(shù)研究基因表達(dá)與調(diào)控分類和進(jìn)化研究甲基化研究技術(shù)特點(diǎn)(1)分析所需DNA量少，僅需0.5μg。也可以用作于線粒體DNA。從線粒體中得到RFLP研究所需的幾十到上百μg的DNA是很困難的。Roseudahl和Taylor(1997)成功地從一種真菌(MycorrhiZalfungi)的單個(gè)孢子中得到AFLP標(biāo)記，而每個(gè)單孢子僅產(chǎn)生約0.1,0.5μgDNA。另外,AFLP反應(yīng)對(duì)模板濃度的變化不敏感，DNA濃度在1000倍的范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)反應(yīng)的影響都不太大,所產(chǎn)生的指紋圖譜十分相似。(2)可重復(fù)性好。AFLP分析基于電泳條帶的有或無(wú),高質(zhì)量的DNA和過(guò)量的酶可以克服因DNA酶切不完全而產(chǎn)生的失真,PCR中較高的退火溫度和較長(zhǎng)的引物可將擴(kuò)增中的錯(cuò)誤減少到最低限度,因而AFLP分析具有很強(qiáng)的可重復(fù)性。Jones等(1997)在歐洲8個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用共同的樣本，進(jìn)行嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，將得到的DNA圖譜進(jìn)行比較，172條譜帶中僅一條出錯(cuò)，誤差小于0.6%。(3)多態(tài)性強(qiáng)。AFLP分析可以通過(guò)改變限制性內(nèi)切酶和選擇性堿基的種類與數(shù)目,來(lái)調(diào)節(jié)擴(kuò)增的條帶數(shù),具有較強(qiáng)的多態(tài)分辨能力。設(shè)計(jì)不同的人工接頭就會(huì)相應(yīng)地產(chǎn)生不同的AFLP引物，引物3'端的選擇性堿基數(shù)目可以是2+2,2+3也可以是3+3,這些堿基的組成也是多種多樣的。由于AFLP引物設(shè)計(jì)的巧妙與搭配的靈活，使得AFLP能產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限的。迄今為止，每個(gè)AFLP反應(yīng)能檢出多態(tài)片段之多，信息量之大，效率之高是其它任何一種分子標(biāo)記所無(wú)法比擬的。⑷分辨率高。AFLP擴(kuò)增片段短，適合于變性序列凝膠上電泳分離，因此片段多態(tài)性檢出率高，而RFLP片段相對(duì)較大，內(nèi)部多態(tài)性往往被掩蓋。(5)不需要SOUthern雜交，無(wú)放射性危害，且不需要預(yù)先知道被分析基因組DNA的序列信息，是一種半隨機(jī)的PCR。(6)樣品適用性廣。AFLP技術(shù)適用于任何來(lái)源和各種復(fù)雜度的DNA,如基因組山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文29DNA、cDNA、質(zhì)粒、某一個(gè)基因或基因片段,且不需要預(yù)知這些DNA的序列特征。用同樣一套限制酶、接頭和引物,可對(duì)各種生物的DNA進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記研究。(7)穩(wěn)定的遺傳性AFLP標(biāo)記在后代中的遺傳和分離中符合Mendel式遺傳規(guī)律，種群中的AFLP標(biāo)記位點(diǎn)遵循Hardy,Wein