生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版-自考-06705-課件第12章-色譜分離技術(shù)

第十二章色譜分離第一節(jié)概述

色譜分離也稱為色層分離或?qū)游龇蛛x，在分析檢測中則常稱為色譜分析。它是一種物理的分離方法。原理：利用多組分混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)(如吸附力、分子極性、分子形狀和大小、分子親和力、分配系數(shù)等)的差別，使各組分以不同程度分布在固定相和流動相中；當多組分混合物隨流動相流動時、由于各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差別，而以不同的速率移動，使之分離。其中固定的稱為固定相；流過固定相的稱為流動相。第十二章色譜分離第一節(jié)概述1第一節(jié)概述色譜分離的基本特點：(1)分離效率高(2)應(yīng)用范圍廣色譜分離的應(yīng)用范圍極廣，從極性到非極性、離子型到非離子型、小分子到大分子、無機到有機及生物活性物質(zhì)，以及熱穩(wěn)定到熱不穩(wěn)定的化合物。尤其是對生物大分子樣品的分離，是其他方法無法代替的。(3)高靈敏度的在線檢測：與其他分離方法相比，色譜分離具有高靈敏度在線檢測的特性。(4)快速分析：高效細顆粒層析劑和高壓液相色譜分離技術(shù)的采用，保證了在高分離效率前提下的高分離速率，從而可以提高單位時間的產(chǎn)量。(5)過程自動化操作：(6)不能放大，操作成本高，一般只適合于高附加值產(chǎn)品的制備：

第一節(jié)概述色譜分離的基本特點：2第二節(jié)色譜分離的分類一、按分離機理不同分類：

（溶質(zhì)與固定相相互作用的機理）(一)吸附色譜分離：

由于固定相對不同物質(zhì)吸附力不同而使混合物分離的方法。(二)分配色譜：

又稱為液液色譜，利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。其操作方法分兩種：

1、柱（紙或板）色譜分離法：

固定相是將與流動互不相溶的液體涂漬到載體上形成的；

2、逆流分配法：

其固定相和流動相都放在一組特別的分配管中。第二節(jié)色譜分離的分類一、按分離機理不同分類：3一、按分離機理不同分類(三)離子交換色譜：

樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進行可逆交換，混合物中不同溶質(zhì)對交換劑具有不同的親和力而將它們分離。(四)凝膠色譜：

以凝膠為固定相，是一種根據(jù)各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù)，因而又稱為分子篩色譜。(五)親和色譜：

把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來。如抗原與抗體，酶蛋白與輔酶。一、按分離機理不同分類(三)離子交換色譜：41、柱色譜分離在柱中進行的色譜分離。

優(yōu)點：進樣量大，回收容易。2、紙上色譜分離以濾紙為載體的分配色譜。

優(yōu)點：設(shè)備簡單，操作方便，分離效率高，所需樣品量少。3、薄層色譜分離將固定相在玻璃平板上鋪成薄層而進行的色譜分離。優(yōu)點：操作簡便，分離效率高，分離速率快，適用廣。二、按固定相形狀不同分類1、柱色譜分離二、按固定相形狀不同分類5三、其他分類方法1、根據(jù)流動相的物態(tài)不同，可分為：氣相色譜分離，液相色譜分離，超臨界色譜分離。2、根據(jù)操作壓力不同，可分為：低壓色譜分離（<0.5MPa），中壓色譜分離（0.5-5MPa），高壓色譜分離（5-50MPa）。3、根據(jù)洗脫操作時展開方式不同，可分為：洗脫展開法，前沿分析法，置換展開法。三、其他分類方法1、根據(jù)流動相的物態(tài)不同，可分為：6第三節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離一、色譜分離的規(guī)模

色譜分析：<10mg；半制備：10-50mg；制備：1.0-10g；工業(yè)生產(chǎn)：>20g/d。二、色譜分離方法的選擇1、目的產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)，物理化學(xué)特性，分子量的大??；2、分子結(jié)構(gòu)，理化特性，大小與目的產(chǎn)物相近的雜質(zhì)的成分和含量。3、目的產(chǎn)物在色譜分離過程中生理活性的穩(wěn)定性。第三節(jié)生物工業(yè)中的色譜分離一、色譜分離的規(guī)模7三、分析色譜與制備色譜

及工業(yè)色譜的比較

1、應(yīng)用色譜技術(shù)范圍的不同：制備和工業(yè)色譜主要是采用以液相為流動相的柱上色譜。2、操作上的不同：制備和工業(yè)色譜中，則要求進樣量越多越好，色譜柱也應(yīng)適當大些。3、色譜分離理論上的不同：①理論塔板數(shù)的不同；②分配系數(shù)的不同；③樣品保留值與峰高的不同。三、分析色譜與制備色譜

及工業(yè)色譜的比較

1、應(yīng)用色譜技術(shù)范8第四節(jié)色譜分離的基本原理

若各組分對固定相的親和力大小不同，因而各組分在固定相流動相中分布也不同，而導(dǎo)致各組分隨流動相的移動速率就不同，使各組分在色譜柱內(nèi)分層而得以分離，這就是色譜分離的基礎(chǔ)。

第四節(jié)色譜分離的基本原理若各組分對9生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)10一、分配色譜分配色譜原理分配色譜是利用附著在層析劑表面的溶劑作為固定相，洗脫劑為流動相，不同物質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)不同，遷移速率不同而實現(xiàn)對混合物的分離。分配色譜由載體、附著在載體表面的固定相、流動相構(gòu)成；載體：惰性物質(zhì)，優(yōu)先吸附固定相而對溶質(zhì)無吸附能力。一、分配色譜分配色譜原理11二、吸附色譜（一）吸附：溶液中的溶質(zhì)在固體表面富集的過程（二）吸附平衡：溶液中的溶質(zhì)被吸附劑表面俘獲的同時，一部分被吸附的溶質(zhì)會脫離吸附劑回到溶液，即解吸附，當吸附的速率與解吸附速率達到相等時，吸附劑上的溶質(zhì)量不再改變即為吸附平衡。（三）吸附等溫線：在一定溫度下，達到吸附平衡時，單位質(zhì)量的吸附劑所吸附的溶質(zhì)量僅與溶液濃度有關(guān)，吸附量與溶液濃度的關(guān)系稱為吸附等溫線。

Langmuir吸附等溫線：當很小時，則因此，吸附色譜與分配色譜一樣為線性色譜，其分配系數(shù)為a，塔板理論同分配色譜完全一樣二、吸附色譜（一）吸附：溶液中的溶質(zhì)在固體表面富集的過程12三、凝膠色譜三、凝膠色譜13三、凝膠色譜凝膠色譜所用的層析劑是一類無吸附能力的多孔凝膠顆粒，多孔顆?？紫秲?nèi)的溶液為固定相，顆粒間隙中的溶液為固定相，由于不同分子大小不同而在顆粒內(nèi)外分布不同，因此洗脫速度不同而實現(xiàn)對分子大小不同的混合物分離。三、凝膠色譜14第五節(jié)柱色譜分離法

工業(yè)規(guī)模的色譜分離大多采用柱色譜分離法。一、層析劑

用于色譜分離技術(shù)中的團定相或分離介質(zhì)，總稱為層析劑。它由基質(zhì)和表面活性官能團(或活動中心)組成。生物產(chǎn)品所需團定相或?qū)游鰟?yīng)具備下列特性：(1)不溶于流動相，且具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和機械強度；(2)具有較大的表面積和孔隙度．且粒度、孔徑分布均勻；(3)有較高的回收率和負載量，能達到所需的分離效率，且重現(xiàn)性好；(4)有些分離過程，層析劑使用前后需要高壓消毒．此時層析劑應(yīng)具有較好的熱穩(wěn)定性；(5)無毒性，分離過程不引起目的產(chǎn)物的變性或失活；(6)成本較低，價格合理。第五節(jié)柱色譜分離法工業(yè)規(guī)模的色譜分離大多采15層析劑種類

層析劑的種類很多。按化合物的種類可分成：無機基質(zhì)層析劑和有機基質(zhì)層析劑兩大類；按色譜分離機理可分成：吸附、分配、離子交換、凝膠和親和層析劑五類；按形狀可分成：球形和無定形兩類；按硬度可分成：硬質(zhì)層析劑、半硬質(zhì)凝膠層析劑及生物軟膠，如瓊脂糖；按結(jié)構(gòu)可分成：表面多孔薄層層析劑和完全多孔層析劑兩類。常用層析劑：無機：硅膠，氧化鋁，活性炭，多孔玻璃，羥基磷灰石；有機：瓊脂糖，葡聚糖，纖維素，聚丙烯酰胺凝膠，聚乙烯醇。層析劑種類層析劑的種類很多。16二、裝置1、進樣及流動相供給裝置；2、色譜柱；3、檢測器與流分收集器。二、裝置1、進樣及流動相供給裝置；17生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)18三、操作技術(shù)(一)樣品溶解與進樣方法：

采用色譜方法分離和純化生物大分子物質(zhì)時，制備合適的樣品溶液是成敗的關(guān)鍵之一。樣品中應(yīng)不夾帶固體顆粒，包括沉淀和菌體碎片等。(二)展開操作：

1．洗脫展開法2．前沿分析法3．置換展開法三、操作技術(shù)(一)樣品溶解與進樣方法：19生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)20生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)21生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)22第六節(jié)親和色譜

親和色譜

是專門用于純化生物大分子的色譜分離技術(shù)，它是基于固定相的配基與生物分子間的特殊生物親和能力的不同來進行相互分離的。親和色譜的顯著特點：

具有其他分離技術(shù)所不能比擬的高選擇性，且色譜過程操作條件溫和，能有效地保持生物大分子高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，活性樣品的回收率也比較高。

所以親和色譜被廣泛用于酶、治療蛋白、抗體、核酸、輔助因子等生物大分子以及細胞、細胞器、病毒等超分子物質(zhì)的分離與純化。

特別是對分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可提純幾百至幾千倍。第六節(jié)親和色譜親和色譜23一、基本原理

親和色譜也屬于一種吸附色譜，但它的吸附作用主要靠生物分子對它的互補結(jié)合體(配基)的生物識別能力。生物活性物質(zhì)的專一性是由分子中有關(guān)作用基團（官能團）的化學(xué)結(jié)構(gòu)與它們的空間排列決定。例如，酶和底物的專一性結(jié)合。一、基本原理親和色譜也屬于一種吸附色譜，但它的24一、基本原理

親和色譜的基本過程：

把具有特異親和力的一對分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入色譜柱，然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動相，在有利于固定相配基和目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下進入色譜柱。目的物質(zhì)被吸附，雜質(zhì)直接流出。變換過柱溶液，使配基與其親和物分離，獲純化的目的產(chǎn)物。一、基本原理親和色譜的基本過程：25生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)26親和色譜分離中經(jīng)常采用的

生物親和關(guān)系①酶：底物、底物類似物、抑制劑、輔酶、金屬離子；②抗體：抗原、病毒、細胞；③激素、維生素：受體蛋白、載體蛋白；④外源凝集素：多糖、糖蛋白、細胞表面受體蛋白、細胞；⑤核酸：互補堿基鏈段、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結(jié)合蛋白；⑥細胞：細胞表面特異蛋白、外源凝集素。親和色譜分離中經(jīng)常采用的

生物親和關(guān)系①酶：底物、底物類似物27二、親和層析劑制備過程：1、載體的選擇；2、載體的活化；3、配基的連接。理想載體的特性：1、不溶性；2、滲透性，即具有疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，容許大分子自由通過；3、高硬度及適當?shù)念w粒形式，最好為均勻的珠狀；4、最低的吸附力；5、較好的化學(xué)穩(wěn)定性；6、抗微生物和酶的侵蝕；7、親水性；8、具有大量的供反應(yīng)的化學(xué)基團，能與大量配基共價連接。（一）瓊脂糖；（二）硅膠；（三）合成高分子。二、親和層析劑制備過程：28生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)29生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)30生物工程下游技術(shù)-毛忠貴版--自考-06705-ppt課件第12章-色譜分離技術(shù)31三、親和色譜操作中的洗脫方法

在親和色譜洗脫操作中，洗脫方法有