酵母雙雜交技術(shù)課件

5、利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因EST(expressedsequencetags),是從基因表達(dá)的短的序列，攜帶著完整基因某些片斷的信息，稱(chēng)為表達(dá)序列標(biāo)簽獲得一個(gè)EST的途徑有三種：1大規(guī)模測(cè)序；2比較同源性；3差異顯示或基因芯片法獲得與某一性狀相關(guān)的EST電腦克隆第一步，找到與待克隆基因相關(guān)的EST；第二步計(jì)算機(jī)拼接、比較；第三步檢測(cè)潛在的可讀框ORF確定是否為全長(zhǎng)5、利用EST數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)新基因EST(expressed6.SAGEExpressionLevelExpressionLevelGeneProductsGeneProductsQuantifyTagsandDeterminePatternsofGeneExpressionLinktagstogetherandsequenceIsolateSAGEtagsAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAASampleASampleBSerialanalysisofgeneexpression6.SAGEExpressionExpressionGenSAGESAGE7.基因芯片（genechip）技術(shù)生物芯片（Biochip）:是指通過(guò)機(jī)器人自動(dòng)印跡或引導(dǎo)光化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微列陣，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過(guò)程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、蛋白、基因及其他生物組份的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測(cè)?；蛐酒℅enechip,DNAchip,orDNAmicroarry）：生物芯片的一種。它是將DNA分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)自動(dòng)化儀器檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中mRNA的表達(dá)量，也可進(jìn)行基因突變體的檢測(cè)和基因序列的測(cè)定，為進(jìn)一步了解基因間的相互關(guān)系及基因克隆提供有用的工具基本概念GeneChip將探針固定在特定的固體基質(zhì)上，而原來(lái)印記在膜上的目標(biāo)DNA或RNA進(jìn)行標(biāo)記，然后進(jìn)行的大規(guī)模的雜交。7.基因芯片（genechip）技術(shù)生物芯片（BiochiAffymetrix的原位合成技術(shù)可制作的點(diǎn)陣密度高達(dá)106~1010/cm2。Affymetrix的原位合成技術(shù)可制作的點(diǎn)陣密度高達(dá)106Cy3和Cy5Cy3激發(fā)波長(zhǎng)532nmCy5激發(fā)波長(zhǎng)635nmCy3和Cy5Cy3激發(fā)波長(zhǎng)532nmCy5激發(fā)波長(zhǎng)635n表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)流程1.Samples2.mRNAExtractionandReverseTranscription3.FluorescentLabelingofcDNA’s4.HybridizationtoaDNAMicroarray5.ScanningtheHybridizedArray6.InterpretingtheScannedImage表達(dá)譜芯片實(shí)驗(yàn)流程1.SamplesLiuetal.,JXB,2009Liuetal.,JXB,20098.RNA-seq技術(shù)8.RNA-seq技術(shù)Xuetal.,BMCGenomics,2009Xuetal.,BMCGenomics,20099.酵母雙雜交技術(shù)(YeastTwo-hybridSystem)1、酵母雙元雜交系統(tǒng)的應(yīng)用?驗(yàn)證傳統(tǒng)方法檢測(cè)的相互作用的蛋白?蛋白的功能作圖

–功能域/氨基酸?鑒別新的相互作用蛋白(fromacDNAlibrary)9.酵母雙雜交技術(shù)(YeastTwo-hybridSy?Gal4proteincomprisesDNAbindingdomains(BD)andactivatingdomains(AD)?Bindingdomaininteractwithpromoter?ActivatingdomainwithtranscriptionmachineryGal4雙元系統(tǒng)原理?Gal4proteincomprisesDNAb背景知識(shí)背景知識(shí)酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖酵母雙雜交技術(shù)原理示意圖Yeasttwo-hybridsystem實(shí)例Wuetal.Cell.2006,125:1347-1360Yeasttwo-hybridsystem實(shí)例WueBiFC：雙分子熒光互補(bǔ)

bimolecularfluorescencecomplementation2002年，Hu等報(bào)道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)BiFC技術(shù)原理將熒光蛋白在某些特定的位點(diǎn)切開(kāi)，形成不發(fā)熒光的N和C端2個(gè)多肽，稱(chēng)為N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。當(dāng)這2個(gè)熒光蛋白的片段分別連接到1組有相互作用的目標(biāo)蛋白上，在細(xì)胞內(nèi)共表達(dá)或體外混合這2個(gè)融合蛋白時(shí)，由于目標(biāo)蛋白質(zhì)的相互作用，熒光蛋白的2個(gè)片段在空間上互相靠近互補(bǔ)，重新組裝成完整的發(fā)光蛋白。BiFC：雙分子熒光互補(bǔ)

bimolecularfluYuanetal.PlantCell2010,22:3164-3176Yuanetal.PlantCell2010,22免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）優(yōu)點(diǎn)：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；（3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）優(yōu)HIS3：篩選標(biāo)記酵母單雜交技術(shù)Li等（1993）從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來(lái)，研究DNA和蛋白質(zhì)互作。HIS3：篩選標(biāo)記酵母單雜交技術(shù)Li等（1993）從酵母雙雜ChIP:Chromatinimmunoprecipitation主要實(shí)驗(yàn)流程：在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復(fù)合物，并通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片段的純化與檢測(cè)，獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP:Chromatinimmunoprecipi酵母雙雜交技術(shù)課件思考題什么是基因工程？對(duì)社會(huì)和科學(xué)技術(shù)發(fā)展有什么重要意義？限制性?xún)?nèi)切酶有哪幾類(lèi)？什么是回文結(jié)構(gòu)？常見(jiàn)載體？報(bào)告基因？藍(lán)白斑篩選？基因克隆的常用策略及原理？果樹(shù)上使用的有哪些方法？什么是細(xì)菌感受態(tài)？轉(zhuǎn)化？轉(zhuǎn)染？酵母雙雜交？思考題什么是基因工程？對(duì)社會(huì)和科學(xué)技術(shù)發(fā)展有什么重要意義？主要參考資料基因VIII基因操作原理孫明華中農(nóng)業(yè)大學(xué)