基因工程原理第七章

基因工程原理第七章第1頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月動物細胞基因操作動物細胞基因操作的必須性:可進行細菌和真菌細胞所無法進行的真正的翻譯后修飾載體1)非復制質(zhì)粒載體2)帶有病毒復制子的質(zhì)粒3)病毒轉(zhuǎn)導載體細胞：與細胞本身特性、載體、轉(zhuǎn)移、應用相關轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)移技術、瞬時與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染應用：細胞研究、蛋白表達、體內(nèi)基因治療、轉(zhuǎn)基因動物第2頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第一節(jié)動物細胞DNA轉(zhuǎn)移技術第3頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月動物細胞基因轉(zhuǎn)移的途徑=轉(zhuǎn)基因技術直接DNA轉(zhuǎn)移：外源DNA通過物理轉(zhuǎn)化直接進入細胞如顯微注射、含DNA顆粒轟擊、轉(zhuǎn)染：化學轉(zhuǎn)染技術、脂質(zhì)體、電穿孔轉(zhuǎn)導：通過動物病毒包裹，利用病毒可以自然感染細胞并將自身核酸分子轉(zhuǎn)入細胞的能力。第4頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)染技術化學轉(zhuǎn)染技術(利用胞吞作用)1)DNA/磷酸鈣共沉淀法適用于單層生長細胞，不適用于懸浮或成團生長的細胞對某些細胞有毒性，難以轉(zhuǎn)染2)二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)

可溶性聚陽離子制劑，不能用于形成穩(wěn)定的細胞系脂質(zhì)體(利用胞吞作用)

低毒性，易操作，效率高，適用細胞類型多，甚至可轉(zhuǎn)染活體細胞電穿孔(利用電脈沖在細胞膜上形成瞬時的納米大小的孔）第5頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)移后DNA的命運具備在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮功能的復制起始子，可以穩(wěn)定復制(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)可以整合到基因組DNA上，穩(wěn)定復制(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)不具備在宿主細胞內(nèi)發(fā)揮功能，也沒有整合到基因組DNA上，瞬時保留(瞬時轉(zhuǎn)染）DNA轉(zhuǎn)入細胞的效率遠高于DNA整合的效率兩個物理上不相連的基因可以發(fā)生共轉(zhuǎn)染，甚至可以都整合到基因組DNA上第6頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第二節(jié)

動物細胞載體第7頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月動物細胞載體非復制型載體瞬時轉(zhuǎn)染的載體(啟動子功能分析的載體)

選擇標記DNA帶有病毒復制子的質(zhì)粒

SV40、BPV、EBV病毒轉(zhuǎn)導載體腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第8頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月瞬時轉(zhuǎn)染的非復制型載體載體無法復制，也不整合于基因組上在宿主細胞中往往只能保持1-2d的穩(wěn)定可以進行基因的表達載體上往往具有報告基因，能夠報告表達的發(fā)生第9頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月啟動子功能分析與報告基因第10頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月選擇標記基因未經(jīng)克隆的含TK基因的外源DNA使一些攝入細胞具有了在選擇培養(yǎng)基上生存的能力，這樣的基因稱為選擇性標記基因轉(zhuǎn)染實驗TK胸苷激酶第11頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月核苷酸從頭合成和補救途徑：編碼補救途徑的酶的基因(Hprt,Tk)可以用作選擇標記第12頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月共轉(zhuǎn)化與選擇標記兩個物理上不相連的基因通過共轉(zhuǎn)染，共同整合到基因組中的現(xiàn)象這是由于發(fā)生了整合之前的DNA融合只要能同時轉(zhuǎn)入一個選擇標記基因，共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象就可以使任何外源DNA序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞根據(jù)標記基因篩選方法，選擇標記可以分為：內(nèi)源性選擇標記、顯性選擇標記、擴增選擇標記第13頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)源性選擇標記來自于動物細胞內(nèi)的標記基因，大多數(shù)涉及與冗余內(nèi)源核苷酸生物合成途徑內(nèi)源性選擇標記的缺點：只能用于那些對應基因不具有功能的突變細胞。第14頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月顯性選擇標記顯性選擇標記：往往來自于細菌(外源)，因此其所提供的表型對于細胞來說是全新的，可用于任何細胞。這些標記通常是細菌的抗藥基因，因此陽性細胞可以在適當?shù)乃幬餄舛鹊呐囵B(yǎng)基上進行篩選。第15頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月擴增選擇標記當動物細胞暴露在某種藥物的有毒濃度中，少數(shù)個別細胞由于自發(fā)的、擴增性的抗藥突變而存活，這樣的DNA上的擴增性標記，稱為擴增選擇標記出現(xiàn)擴增選擇性標記的細胞栽種群中是隨機出現(xiàn)的，可進行高濃度抗藥性的篩選側(cè)翼DNA序列可隨標記基因一起擴增氨基蝶呤DHFR葉酸第16頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月擴增選擇標記擴增選擇標記也常可用于內(nèi)源或顯性選擇標記，但常常用于擴增選擇的藥物不同第17頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月擴增選擇標記常用于外源基因的高效表達第18頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月復制子載體：帶有病毒復制子的載體病毒基因組具有在宿主細胞內(nèi)獨立復制的能力可能造成溶解性感染，使宿主細胞裂解，如SV40，由于宿主細胞的裂解，實現(xiàn)的是一種高水平瞬時表達可能造成潛伏性感染，從而并不影響宿主細胞生長，實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如EBV和PBV，其中EBV載體相對于PBV載體復制更加穩(wěn)定第19頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月SV40（猴多瘤病毒DNA）第20頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒轉(zhuǎn)導載體外源DNA分子包入病毒粒子(通過連接或同源重組的方式插入病毒載體），后者吸附到細胞表面從而進入細胞效率很高，而且具有高效復制與高水平表達基因的潛能不僅可用于培養(yǎng)細胞，也可用于活體細胞腺病毒、桿狀病毒、牛痘病毒、Lentivirus等第21頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月可復制病毒載體與復制缺陷型病毒載體當轉(zhuǎn)移基因插入到基因組中或它所替換的基因?qū)τ谠谒拗骷毎械母腥局芷诓皇潜匦钑r，載體可以獨立的增殖，稱為可復制的或不依賴輔助病毒載體。當轉(zhuǎn)入基因替換了病毒的必需基因時，這樣的載體則稱為復制缺陷型或輔助病毒依賴性載體。因為它們失去的功能需要通過共轉(zhuǎn)入攜帶有載體所缺失基因的輔助病毒來提供。第22頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月可復制病毒載體與復制缺陷型病毒載體:以桿狀病毒為例第23頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月無內(nèi)含載體不具有所有病毒編碼序列的載體，只含有包裝和基因組擴增所必需的順式作用元件。優(yōu)點:1)可容納高容量的外源DNA2)不產(chǎn)生病毒基因產(chǎn)物，對細胞無毒性第24頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第三節(jié)細胞與應用第25頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月正常動物細胞生長特性第26頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月宿主動物細胞所需特性第27頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月正常細胞生長特性和宿主細胞所需特性上的差異某種程度上造成了各種表達系統(tǒng)對宿主細胞選擇和應用的差異第28頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月第四節(jié)

動物基因操作第29頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月動物基因工程動物基因工程動物基因工程動物細胞基因工程轉(zhuǎn)基因動物個體動物工程細胞動物遺傳性狀改良藥物篩選研究評價模型人體基因治療蛋白多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研究評價模型第30頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月動物基因工程哺乳動物轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎干細胞同源重組基因?qū)ぐ锌寺⊙蚝艘浦财渌棺祫游镒笩o脊椎動物

果蠅第31頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法體細胞-卵細胞核替換顯微注射受精卵反病毒侵染胚胎干細胞或早期胚第32頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)基因小鼠大多數(shù)動物細胞在發(fā)育能力上受到限制，不能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物：分化的細胞無法完全去分化和重復發(fā)育動物中實現(xiàn)生殖細胞系轉(zhuǎn)化的唯一途徑就是在形成生殖細胞系的發(fā)育階段之前把DNA導入全能細胞胚胎干細胞(EsCells)是這樣一個動物體特殊的全能細胞第33頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)基因小鼠中的DNA轉(zhuǎn)移方法直接顯微注射：注入剛受精卵細胞的雄或雌性原核中重組反轉(zhuǎn)錄病毒：不適宜產(chǎn)生完全的轉(zhuǎn)基因動物，可用于形成胚轉(zhuǎn)基因部分Es細胞轉(zhuǎn)染：可利用標準標記進行篩選

第34頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月胚胎干細胞(EsCells)取自生殖細胞發(fā)育前的早期胚具有發(fā)育成動物的所有組織的能力受同源重組影響顯著，可以用于基因?qū)ぐ?，即可用外源DNA的同源片段精確地替換內(nèi)源基因組的片段。第35頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月Es細胞的基因?qū)ぐ型庠碊NA的同源片段精確替換內(nèi)源基因組片段的過程由于同源重組的幾率遠低于隨機整合，進行尋靶的細胞需要有較高的同源重組能力體外操作的多能性、可操作性以及同源重組的能力使Es細胞成為唯一適合于產(chǎn)生定向突變小鼠的細胞，即在每個細胞中攜帶有相同突變并能將其傳遞給生殖細胞系的小鼠。標記基因已被運用到尋靶過程和其后的篩選

第36頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月尋靶載體特化的質(zhì)粒載體，導入到Es細胞后可以促進同源重組促進同源重組的原因主要是含有一段同源區(qū)轉(zhuǎn)染前載體的線性化，有助于重組效率的提高多數(shù)基因?qū)ぐ惺菫榱舜驍鄡?nèi)源基因位點，使之無效，稱為基因敲除第37頁，課件共39頁，創(chuàng)作于2023年2月兩種類型的尋靶載體：替代與插入