親和色譜精講課件

4.3親和色譜(層析)

AffinityChromatography,AC

第一節(jié)概述原理利用生物體中許多高分子化合物具有和某些相對(duì)應(yīng)的分子可逆結(jié)合的特性建立的色譜法。一、特點(diǎn)高效、高收率、有濃縮效應(yīng)，使用局限性4.3親和色譜(層析)

AffinityChrom1二、應(yīng)用高效從復(fù)雜混合物中得某一種物質(zhì)；基于生物功能可把有活性與無活性分開三、基本過程須找配基（它與底物專一可逆結(jié)合如下圖）二、應(yīng)用2親和色譜精講課件3親和色譜精講課件4親和層析過程演示親和層析過程演示5親和吸附劑的構(gòu)成載體（基質(zhì)）、配體、連接臂親和吸附劑的構(gòu)成6說明：1.偶聯(lián)用Gel（須是活化偶聯(lián)介質(zhì)）2.親和吸附劑高度專一親和吸附劑類專一親和吸附劑3.按相互作用力劃分：次級(jí)鍵——親和色譜配位鍵——螯合色譜共價(jià)鍵——共價(jià)色譜疏水鍵——疏水色譜說明：7親和層析的必要條件:合適的配體（配基、ligand)合適的載體（Matrix)合適的吸附和洗脫條件親和層析的必要條件:8第二節(jié)親和色譜配基(ligandL)㈠作為配體的條件

親和力大;具有解離平衡;與載體偶聯(lián)不失活㈡常用系統(tǒng)酶:底物或類似物、輔助因子、可逆抑制劑、效應(yīng)物核酸:互補(bǔ)順序、組蛋白、結(jié)合蛋白、核酸多聚物激素:受體、運(yùn)載蛋白抗體:抗原、病毒、細(xì)胞外源凝集素:多糖、糖蛋白、細(xì)胞第二節(jié)親和色譜配基(ligandL)9親和層析常用配體配體目標(biāo)分子配體目標(biāo)分子5’-AMPNAD依賴性脫氫酶、ATP依賴性激酶Poly(U)真核mRNA、Poly(U)結(jié)合蛋白ATPATP依賴性激酶凝集素糖蛋白NADNAD依賴性脫氫酶蛋白質(zhì)A/蛋白質(zhì)GIgG或IgG對(duì)應(yīng)抗原NADPNADP依賴性脫氫酶苯基硼酸鹽糖蛋白鈣調(diào)蛋白鈣依賴性酶CibacronBlueF3G-ANAD(P)依賴性脫氫酶、激酶、磷酸酶、白蛋白、干擾素肝素某些凝固蛋白、血漿蛋白、脂蛋白、核酸相關(guān)酶、受體等ProcionRedHE-3BNAD(P)依賴性脫氫酶、干擾素、抑制蛋白、纖溶酶原單克隆抗體特定抗原賴氨酸纖溶酶、纖溶酶原、纖溶酶原激活劑過渡金屬離子含組氨酸的多肽或蛋白質(zhì)親和層析常用配體配體目標(biāo)分子配體目標(biāo)分子5’-AMPNAD依10㈢配體的濃度一般使用較高的固定化配體濃度配體親和力高，且本身帶電則濃度須降低配體濃度過高引起色譜畸變。(與很多物質(zhì)發(fā)生非特異性結(jié)合)㈢配體的濃度11

㈣配體的選擇

1.

考慮親和勢(shì)L+SLSKl=[L][S]/[LS]要求Kl在10-4～10-8mol/L之間2.

與L的偶聯(lián)不破壞L與S的結(jié)合3.

需了解L-S的作用機(jī)制如……

㈣配體的選擇12例：酶有單底物反應(yīng)、雙底物反應(yīng)單APEEEAEP

底物A、產(chǎn)物P或它們的類似物都可以例：酶有單底物反應(yīng)、雙底物反應(yīng)13雙底物依次ABPQEEEAEABEPQEQ

須選擇A、若選B則吸附時(shí)須加A雙底物依次14雙底物隨機(jī)A（B）B（A）P（Q）Q（P）EEEAEA（B）EPQ

A、B都可選擇對(duì)A、B的選擇僅取決于它們親和勢(shì)的大小和固定化的難易程度。雙底物隨機(jī)15第三節(jié)親和層析載體一、作為載體的條件

1.親水

2.惰性

3.具有活化基團(tuán)

4.大網(wǎng)孔

5.機(jī)械性能好第三節(jié)親和層析載體一、作為載體的條件16二、載體的選擇

1.瓊脂糖凝膠：親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定（商品名：Sepharose）

2.聚丙烯酰胺凝膠：理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐有機(jī)溶劑及去污劑，抗微生物能力強(qiáng)，特別適應(yīng)用配基與提取物親和力比較弱的物質(zhì)。

3.葡聚糖凝膠：有良好的化學(xué)及物理性質(zhì)，孔徑小。

4.纖維素：非特異吸附嚴(yán)重，廉價(jià)，易得。

5.多孔玻璃：物理性能好，有非特異性吸附。二、載體的選擇1.瓊脂糖凝膠：親水性強(qiáng)，理化性質(zhì)穩(wěn)定17

三、手臂（Spacerarm）在載體和配基間引入適當(dāng)長度的“手臂”，減少載體的空間阻礙，增加配基的活動(dòng)度。示意圖如下：

三、手臂（Spacerarm）18親和色譜精講課件19親和色譜精講課件20連接臂往往為由烴鏈組成的疏水性手臂（其長短對(duì)吸附的影響大）或具氨基、羧基的親水性手臂（其長短對(duì)吸附的影響不大）；疏水性手臂具體選擇應(yīng)考慮：⑴分離物質(zhì)分子量大?、朴H和勢(shì)大小⑶過長手臂易彎曲、折疊等；最常用的連接臂有6-氨基己酸、1,6-己二胺和3,3’-二氨基二丙胺。

連接臂往往為由烴鏈組成的疏水性手臂（其長短對(duì)吸附的影響大）或21親和色譜精講課件22接有連接臂的親和層析用載體載體連接臂供應(yīng)商瓊脂糖3-氨基丙基和琥珀酰氨基丙基Bio-Rad3,3’-二氨基丙基和琥珀酰二氨基丙基Bio-Rad1,2-二氨基乙烷,1-二氨基己烷,3,3’-二氨基二丙胺ICN1,6-己二胺,6-氨基己酸Pharmacia3,3’-二氨基丙基胺,對(duì)苯甲?；?3,3’-二氨基丙基胺Serva氨基烷基(2,4,6,8,10)Miles聚丙烯酰胺-瓊脂糖1,6-己二胺,6-氨基己酸IBF多孔玻璃氨基丙基,氨基己基Merck接有連接臂的親和層析用載體載體連接臂供應(yīng)商瓊脂糖3-氨基丙基23

第四節(jié)

親和吸附劑的制備

一、要求㈠.

L與基質(zhì)結(jié)合，對(duì)L-S結(jié)合無干擾；㈡.

L為小分子有的需“手臂”，使L-S結(jié)合更有效；㈢.

非專一吸附不大，以免吸附雜質(zhì)；L與基質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定（吸附、洗脫、再生）。

第四節(jié)

親和吸附劑的制備24二、

偶聯(lián)用Gel的選擇需考慮：㈠.

L上可供偶聯(lián)的基團(tuán)㈡.

“手臂”㈢.

L的穩(wěn)定pH

三、

由CNBr活化型Sep.4B制備商品名：CNBr-Sepharose二、

偶聯(lián)用Gel的選擇25一般步驟：凍干粉溶脹洗滌混合反應(yīng)掩蔽溶解L①②③

洗去L（未結(jié)合）成品

一般步驟：凍干粉溶脹洗滌26㈠.

溶脹和洗滌用1mol/LHCl溶脹洗滌除細(xì)碎粒子

㈡.

偶聯(lián)條件注意：前處理、偶聯(lián)密度、緩沖液種類及pH㈢.

掩蔽偶聯(lián)后有部分氰酸酯未偶聯(lián)上L，常利用含-NH2的緩沖液或含-NH2的分子處理，將其掩蔽。㈣.

洗去未結(jié)合L用高-低交叉pH來洗（4～5次）

㈠.

溶脹和洗滌27

親和吸附劑的制備過程親和吸附劑的制備過程28封閉未反應(yīng)的活化基團(tuán)

載體上活化基團(tuán)濃度

5~25mol/ml偶聯(lián)上的配體濃度

1~10mol/ml封閉試劑pH8.0，1mol/L乙醇胺甘氨酸巰基乙醇室溫反應(yīng)1h封閉未反應(yīng)的活化基團(tuán)載體上活化基團(tuán)濃度5~25m29配體濃度評(píng)估

差示分析法直接測(cè)定法放射分析法水解法

連接臂的連接

連接臂先接配體后偶聯(lián)至載體連接臂先偶聯(lián)至載體后接配體配體濃度評(píng)估差示分析法30四、由氨基-Sep或羧基-Sep制備Sep-(CH2)6-NH2L-COOHAH-SepSep-(CH2)6-COOHL-NH2CH-Sep碳二亞胺法（配基偶聯(lián)的一種方法）：

四、由氨基-Sep或羧基-Sep制備31瓊脂糖等多糖類載體溴化氰法

最常使用，簡單溫和，活化效率高，速度快；反應(yīng)可逆，劇毒，可能帶上電荷瓊脂糖等多糖類載體溴化氰法32雙環(huán)氧法(p140-145)

產(chǎn)生親水連接臂，不帶電荷，穩(wěn)定，偶聯(lián)配體數(shù)量少于溴化氰法產(chǎn)生親水連接臂，不帶電荷，穩(wěn)定，偶聯(lián)配體數(shù)量33二乙烯砜法反應(yīng)性能強(qiáng)，適合于偶聯(lián)羥基配體；劇毒，昂貴二乙烯砜法34N,N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯法穩(wěn)定，不帶電荷N,N’-二琥珀酰亞胺碳酸酯法35有機(jī)磺酰氯法對(duì)甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯可釋放生色基團(tuán)，可用于監(jiān)測(cè)偶聯(lián)反應(yīng)有機(jī)磺酰氯法36碳化二亞胺交聯(lián)法碳化二亞胺交聯(lián)法37其他方法羰基二咪唑（CDI）法高碘酸鹽法磺化氟甲基吡啶鎓法N-羥基琥珀酰亞胺法其他方法羰基二咪唑（CDI）法38其他親和吸附劑聚丙烯酰胺載體的親和吸附劑可用戊二醛法和肼解法活化,然后再將含氨基的配體固定到其活化基團(tuán)上;硅膠和多孔玻璃載體的親和吸附劑最常用的修飾方法就是進(jìn)行硅烷化處理,從而給載體引入氨基或環(huán)氧基團(tuán).其他親和吸附劑聚丙烯酰胺載體的親和吸附劑可用戊二醛法和肼解法39戊二醛法

OHC(CH2)3CHO

與載體酰胺基團(tuán)結(jié)合，并與配體氨基結(jié)合簡單、便宜、穩(wěn)定，引入連接臂，有中等毒性肼解法

-CONH2–CONHNH2–CON3–CONH-LNH2NH2NaNO2L-NH2戊二醛法NH2NH2NaNO2L-NH240

類專一性親和吸附劑㈠.

固定化凝集素（本質(zhì)是蛋白質(zhì)）可用來分離糖、糖蛋白如……㈡.

固定化多聚核苷酸可用來分離NA、核蛋白如……㈢.

染料親和吸附劑以染料為配基，用來分離酶類、干擾素等

41親和色譜精講課件42

第五節(jié)

一般實(shí)驗(yàn)方法是否有類專一吸附劑有溶脹Gel

無選L

選偶聯(lián)Gel

偶聯(lián)L

裝柱第五節(jié)

一43安裝儀器

平衡（2～3Vt）

加樣吸附

洗去非吸附物親和柱洗脫液

再生脫鹽

安裝儀器44

一、親和吸附柱的預(yù)備㈠.

親和吸附劑選擇或制備效能小試：據(jù)資料等先選擇始緩沖液種類、I、pH、t①.

用10Vt始緩洗，若目的物未流出，說明吸附性能好，α＞0.9②.

不斷加樣到目的物流出，確定吸附容量㈡.

柱

H/D高度專一短類專一長平衡一般2～3Vt始緩

一、親和吸附柱的預(yù)備45二、

加樣吸附㈠.

樣品平衡（透析或SephadexG-25）㈡.

樣品體積Vs（一般＜5%）若結(jié)合緊密，Vs可較大；不緊，Vs要?、?

洗去非吸附物（10Vt始緩洗）三、洗脫（以S不變性為前提）類專一：選擇性洗脫、有分級(jí)分離要求、梯度或階式洗脫。二、

加樣吸附46樣品準(zhǔn)備

加樣前樣品應(yīng)當(dāng)澄清，不含顆粒狀物質(zhì)，有適當(dāng)?shù)膒H值、離子強(qiáng)度以利于目標(biāo)分子的結(jié)合離心（10000rpm）或過濾（0.45或0.22μm濾膜）除去不溶物對(duì)復(fù)雜樣品如組織細(xì)胞、植物材料、發(fā)酵產(chǎn)物，應(yīng)預(yù)處理，如超聲破碎、溶解、均質(zhì)、抽提、過濾、離心等鹽析、離子交換層析透析或凝膠過濾完成脫鹽、緩沖液交換樣品準(zhǔn)備加樣前樣品應(yīng)當(dāng)澄清，不含顆粒狀物質(zhì)，有適當(dāng)?shù)膒H47加樣吸附目標(biāo)分子與配體形成復(fù)合物而吸附在層析柱上起始緩沖液的選擇：配體-目標(biāo)分子作用類型疏水鍵，提高離子強(qiáng)度，不要采用低溫操作；離子鍵，降低離子強(qiáng)度流速：低壓親和層析，流速50cm/h；高效液相親和層析，流速50～125cm/h。若結(jié)合力弱，應(yīng)降低流速加樣量：不超過親和吸附劑的吸附容量加樣吸附目標(biāo)分子與配體形成復(fù)合物而吸附在層析柱上48洗去雜蛋白5倍床體積的起始緩沖液洗去未吸附物質(zhì)，直至紫外紀(jì)錄曲線回到基線親和柱上存在較多的非特異性吸附，而目標(biāo)分子結(jié)合牢固，可選用介于起始緩沖液和洗脫緩沖液之間的條件洗雜蛋白例：起始緩沖液0.05mol/L磷酸緩沖液洗脫緩沖液含1mol/LNaCl的磷酸緩沖液可用含0.51mol/LNaCl的磷酸緩沖液洗去雜蛋白洗去雜蛋白5倍床體積的起始緩沖液洗去未吸附物質(zhì)，直至紫外紀(jì)錄49洗脫專一性洗脫和非專一性洗脫洗脫專一性洗脫和非專一性洗脫50非專一性洗脫改變緩沖液的離子強(qiáng)度配體與目標(biāo)分子間如果是離子作用：升高離子強(qiáng)度疏水作用：降低離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度變化方式：階段式、梯度式改變緩沖液的pH值

改變表面帶電基團(tuán)的電性和電量，從而破壞離子鍵階段式為主非專一性洗脫改變緩沖液的離子強(qiáng)度51改變緩沖液的極性配體和目標(biāo)分子依靠較強(qiáng)的疏水作用結(jié)合時(shí)，可以往洗脫液中添加一定比例的有機(jī)溶劑使用洗滌劑極端疏水性蛋白質(zhì)，如：膜蛋白最好使用在280nm附近無吸收的非離子型洗滌劑，如NP-40,Lubrol改變緩沖液的極性52使用促溶鹽（chaotropicsalt）促溶鹽能破壞水的結(jié)構(gòu)，降低配體-蛋白質(zhì)間疏水作用的強(qiáng)度親和層析洗脫時(shí)常用的促溶劑有1～3mol/L硫氰化鉀、1～3mol/L碘化鉀、4mol/LMgCl2使用蛋白質(zhì)變性劑

8mol/L尿素，6mol/L鹽酸胍

←蛋白質(zhì)沉淀（鹽析）效應(yīng)增加陰離子：PO43－,SO42－,CH3COO－,Cl－,Br－,NO3－,ClO4－,I－,SCN－陽離子：NH4+,Rb+,K+,Na+,Cs+,Li+,Mg2+,Ca2+,Ba2+蛋白質(zhì)促溶（鹽溶）效應(yīng)增加→使用促溶鹽（chaotropicsalt）←蛋白質(zhì)沉淀（53StepelutionGradientelution

Stepelution54專一洗脫(親和洗脫)使用配體，如：用不同的核苷酸將脫氨酶從染料柱上洗脫使用能與配體結(jié)合的分子，如：用游離糖將糖蛋白從凝集素柱上洗脫優(yōu)點(diǎn)：洗脫條件溫和，目標(biāo)分子不會(huì)變性缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，配體與目標(biāo)分子結(jié)合后需要進(jìn)一步分離專一洗脫(親和洗脫)55CompetingbindingsubstanceinsolutionElutionofglycoproteinsfromConASepharosebya-D-methylmannosideSpecificeluents+CompetingligandinsolutionElutionofenzymesfromBlueSepharosebyfreeNADH+Competingbindingsubstancein56洗脫方式總結(jié):㈠.

pH變化（破壞靜電引力）㈡.

I變化（減弱靜電引力、范德華力）㈢.

親和洗脫L的類似物L(fēng)′，S的類似物S′*采用酶促反應(yīng)的多元專一性洗脫㈣.

表面活性劑減少疏水作用、范德華力種類常有：曲通X1001%（V/V）、乙二醇等

洗脫方式總結(jié):57㈤.

解離試劑主要破壞氫鍵，如尿素、鹽酸胍等㈥.

降低溫度t較高t吸附、較低t洗脫、減少疏水力㈦.

電泳解吸+在柱兩端連上電極進(jìn)行電泳

四、脫鹽-五、再生

㈤.

解離試劑58

再生和保存

再生的目的是除去所有仍然結(jié)合在柱上的物質(zhì)幾個(gè)床體積的起始緩沖液再平衡采用高濃度鹽溶液，如2mol/LKCl

根據(jù)配體的穩(wěn)定性升高和降低pH值、加入洗滌劑、使用尿素等變性劑或加入適當(dāng)?shù)姆菍Ｒ恍缘鞍酌副４鏁r(shí)應(yīng)加抑菌劑，如0.02%W/V疊氮鈉

再生和保存再生的目的是除去所有仍然結(jié)合在柱上的物質(zhì)59第六節(jié)

其它親和色譜簡介一、

共價(jià)色譜利用形成和破壞共價(jià)鍵能力的差異分離其共價(jià)鍵常為二硫鍵—S-S—主要用于分離分子中含巰基的Pr、多肽基本層析過程……第六節(jié)

其它親和色譜簡介60親和色譜精講課件61

二、金屬螯合色譜

原理HisCysTrp能與某些金屬離子形成復(fù)合物，若將金屬離子固定，可將含這些外露AA的Pr吸附。固定方法：將環(huán)氧活化型Sepharose6B與金屬螯合劑偶聯(lián)成配基，再用金屬離子處理。如…洗脫：采用增加I或降低pH或加入EDTA

原理二、金屬螯合色譜原理62原理蛋白質(zhì)分子表面的組氨酸咪唑基、半胱氨酸巰基和色氨酸吲哚環(huán)能與銅、鋅、鎳離子間形成穩(wěn)定的螯合物

原理63親和色譜精講課件64親和色譜精講課件65金屬螯合親和層析材料

載體

Sepharose4B或6B，親水樹脂配體亞氨基二乙酸（IDA）：3個(gè)配位基團(tuán)三（羧甲基）乙二胺（TED）：5個(gè)配位基團(tuán)金屬離子

Cu2+>Ni2+>Zn2+>Co2+>>Ca2+,Mg2+

金屬螯合親和層析材料載體66金屬螯合親和層析實(shí)例純化帶六聚組氨酸（6xHis）末端的基因重組酶NAD激酶樣品準(zhǔn)備重組NAD激酶表達(dá)菌離心，分散于起始緩沖液，超聲破碎細(xì)胞，離心提取上清得粗酶液層析材料

Ni-chelating，以亞氨基二乙酸作為配體的環(huán)氧乙烷活化瓊脂糖凝膠，螯合離子為鎳離子金屬螯合親和層析實(shí)例純化帶六聚組氨酸（6xHis）末端的基因67裝柱

10Vt50mmol/LEDTA-0.5mol/LNaCl除去雜質(zhì)，5Vt蒸餾水清洗，0.6Vt0.1mol/LNiSO4固定金屬離子起始緩沖液

20mmol/LKPB,pH7.5、0.1mmol/LNAD、0.5mmol/L二硫蘇糖醇、0.5mol/LNaCl、10mmol/L咪唑加樣、吸附、洗去雜質(zhì)洗脫液

10mmol/L→0.5mol/L咪唑梯度緩沖液解吸清洗和再生強(qiáng)螯合劑0.05mol/LEDTA,0.5mol/LNaCl再生親和柱，5Vt蒸餾水洗滌，儲(chǔ)存于20%乙醇裝柱68蛋白質(zhì)(mg)NAD激酶活性(U)回收率(%)比活(U/mg)純化倍數(shù)(×)細(xì)胞提取液880111000.01251Ni-親和層析4.66.353.681.3679107蛋白質(zhì)(mg)NAD激酶活性(U)回收率(%)比活(U/mg69

四、有機(jī)染料親和色譜有機(jī)染料如蒽酮化合物和偶氮化合物具類似于NAD+的結(jié)構(gòu)。一些需核苷酸類物質(zhì)為輔酶的酶，對(duì)這些染料具一定親和力。

70Dye-stuffsCibacronBlue3G-AmimicsNADHDye-stuffsCibacronBlue3G-Am71染料配體親和層析以仿生染料，主要是三嗪染料作為配體的親和層析

常用的染料有CibacronblueF3GA（多芳香環(huán)的磺化物）和ProcionRedHE3B，多以Sepharose作為載體，前者稱藍(lán)色Sepharose，后者稱紅色Sepharose具有一定的陽離子交換作用，應(yīng)適當(dāng)提高緩沖液離子強(qiáng)度來減少非特異性吸附作用染料配體親和層析以仿生染料，主要是三嗪染料作為配體的親和層析72原理

藍(lán)色染料CibacronblueF3GA在結(jié)構(gòu)上與NAD+和NADP+很相似，用于純化NAD+、NADP+依賴性酶，如各種激酶、磷酸酶、脫氫酶、DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶等紅色染料ProcionRedHE3B用于純化NADP+依賴性酶，如某些脫氫酶，以及其他非相關(guān)蛋白質(zhì)，如干擾素、抑制蛋白、羧肽酶G、血纖蛋白溶酶原等，結(jié)合不僅依賴于特定基團(tuán)，還依賴于離子鍵或疏水相互作用

原理藍(lán)色染料CibacronblueF3GA在結(jié)構(gòu)上與73材料

制備：偶聯(lián)到6%交聯(lián)瓊脂糖（SepharoseCL-6B）商品化染料親和吸附劑RedSepharoseCL-6B材料制備：偶聯(lián)到6%交聯(lián)瓊脂糖（SepharoseCL-74染料配體親和層析實(shí)例從Candidautilis中分離NADP+依賴型酶

吸附緩沖液：中性pH緩沖液洗脫緩沖液：專一性洗脫：含NAD+或NADP+的緩沖液非專一性洗脫：增加離子強(qiáng)度至2MNaCl或1MKCl染料配體親和層析實(shí)例從Candidautilis中分離NA75

A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脫氫酶，C：谷氨酸脫氫酶，D：谷胱甘肽還原酶，E：6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶A：非吸附蛋白，B：6-磷酸葡萄糖脫氫酶，C：谷氨酸脫76五凝集素親和層析凝集素是一類來自于霉菌、植物和動(dòng)物的蛋白質(zhì)，能可逆地、選擇性地同特定的糖殘基結(jié)合不同的凝集素結(jié)合不同的糖分子用于分離含糖基的化合物，如多糖、糖蛋白、糖脂、細(xì)胞內(nèi)顆粒、細(xì)胞等五凝集素親和層析77凝集素分子量亞基數(shù)目特異性洗脫糖類所需離子伴刀豆球蛋白A550002/4α-D-甘露糖α-D-葡萄糖α-甲基甘露糖α-甲基葡萄糖Ca2+Mn2+扁豆凝集素490002α-D-甘露糖α-D-葡萄糖α-甲基甘露糖α-甲基葡萄糖Ca2+Mn2+豌豆凝集素490004(αβ)α-D-甘露糖α-甲基甘露糖蓖麻凝集素1200004β-D-半乳糖乳糖，半乳糖蓖麻凝集素600002α-D-N-乙酰半乳糖胺α-D-N-乙酰半乳糖胺麥芽凝集素360002N-乙酰葡糖胺N-乙酰葡糖胺Ca2+Mn2+Zn2+大豆凝集素1100004α-D-N-乙酰半乳糖胺α-D-N-乙酰半乳糖胺半乳糖植物血球凝集素1280004α-D-N-乙酰半乳糖胺α-D-N-乙酰半乳糖胺Ca2+Mn2+凝集素分子量亞基數(shù)目特異性洗脫糖類所需離子伴刀豆球蛋白A5578凝集素親和吸附劑的合成據(jù)待分離物質(zhì)所帶糖基選擇適當(dāng)?shù)哪刈鳛榕潴w選擇載體一般選用商品化的活化載體，如CNBr-活化的Sepharose-4B，CDI-活化的Sepharose等偶聯(lián)封閉活性位點(diǎn)凝集素親和吸附劑的合成79凝集素親和層析實(shí)例人細(xì)胞表面抗原的純化吸附劑：ConASepharose-4BConA：伴刀豆球蛋白A，是從刀豆中分離出的四聚體金屬蛋白，與α-D-甘露糖，α-D-葡萄糖結(jié)合吸附緩沖液：20mMTris-HCl，0.5MNaCl，1mMMnCl2，1mMCaCl2，pH7.4

洗脫緩沖液：0.1～0.5M甲基-α-D-葡萄糖或甲基-α-D-甘露糖凝集素親和層析實(shí)例人細(xì)胞表面抗原的純化80填充層析柱，用10Vt的吸附緩沖液清洗并平衡柱子以15cm/h的流速加樣用5-10Vt的吸附緩沖液洗