食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程課件

第四章

細(xì)胞工程與食品工業(yè)第四章細(xì)胞工程與食品工業(yè)1主要內(nèi)容細(xì)胞工程的概念、研究范疇植物細(xì)胞培養(yǎng)動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要內(nèi)容細(xì)胞工程的概念、研究范疇2第一節(jié)、概述利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用工程學(xué)的方法，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性和生物學(xué)特性，從而獲得特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)品或新生物品種的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。細(xì)胞工程的核心技術(shù)：細(xì)胞培養(yǎng)與繁殖

目的：獲得新性狀、新個體、新物質(zhì)1細(xì)胞工程的概念及研究范疇第一節(jié)、概述利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用工3研究范疇研究對象：植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞根據(jù)改造遺傳物質(zhì)的不同層次可分為：大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞融合細(xì)胞拆合（核移植、細(xì)胞器移植）染色體工程胚胎工程（胚胎培養(yǎng)、胚胎移植）研究范疇研究對象：植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞41、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞在人工提供的體外條件下進(jìn)行生長和繁殖。三個層次：單個細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)微生物一般劃分到發(fā)酵工程植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的培養(yǎng)可以用于育種，優(yōu)良植株的快速生長。動物細(xì)胞培養(yǎng)多用于產(chǎn)生有價值的細(xì)胞產(chǎn)物，如疫苗。產(chǎn)品檢測、疾病治療。1、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞在人工5

1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)6

2）動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)2）動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)7

3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）

細(xì)胞融合是指利用人工和自然的方法將兩個或幾個不同親本細(xì)胞融合成一個細(xì)胞，用于改良或創(chuàng)造新的物種及生產(chǎn)單克隆抗體。四個步驟：細(xì)胞標(biāo)記---融合的細(xì)胞進(jìn)行遺傳標(biāo)記原生質(zhì)體的制備---酶法破處細(xì)胞壁誘導(dǎo)細(xì)胞融合---兩種或兩種以上細(xì)胞按一定比例置于高滲溶液，加入誘導(dǎo)劑或物理方法促進(jìn)融合篩選雜合細(xì)胞---利用遺傳標(biāo)記，篩選有雙親遺傳特性的的雜合細(xì)胞。

3）細(xì)胞融合技術(shù)（體細(xì)胞雜交技術(shù)）84)細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合是指通過物理或化學(xué)的方法將完整細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)分離開，或?qū)⒓?xì)胞核吸出來，再將同種或異種的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)重新組合起來，培育成新的細(xì)胞或新的生物個體的過程，也包括各種細(xì)胞器的分離和重新組合。最早：紫外線、激光破壞細(xì)胞核，再用微吸管將其它細(xì)胞核注入后期：用微吸管將細(xì)胞核吸出，再注入其它去核細(xì)胞中，進(jìn)行融合。4)細(xì)胞拆合細(xì)胞拆合是指通過物理或化學(xué)的方法將完整細(xì)胞的細(xì)胞94）細(xì)胞拆合－核移植技術(shù)4）細(xì)胞拆合－核移植技術(shù)105）染色體工程技術(shù)

染色體工程是按人們的需要來添加、削減或替換生物的染色體從而定向改變遺傳特性和選育新品種的一種技術(shù)。主要分為動物染色體工程和植物染色體工程.動物染色體工程主要采用對細(xì)胞進(jìn)行微操作的方法(如微細(xì)胞轉(zhuǎn)移方法等)來達(dá)到轉(zhuǎn)移基因的目的.植物細(xì)胞工程目前主要是利用傳統(tǒng)的雜交回交等方法來達(dá)到添加、消除或置換染色體的目的

。5）染色體工程技術(shù)染色體工程是按人們的需要來添加、削減或116）胚胎工程技術(shù)胚胎工程技術(shù)是一項綜合性繁殖生物學(xué)技術(shù)，主要包括體胚胎移植和分割技術(shù)、卵母細(xì)胞體外成熟和移植技術(shù)、胚胎冷凍保存、克隆動物及臨床移植治療疾病6）胚胎工程技術(shù)胚胎工程技術(shù)是一項綜合性繁殖生物學(xué)技127）干細(xì)胞和組織工程7）干細(xì)胞和組織工程138）細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器8）細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器142、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用2、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用15食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件16食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件17食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件18食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件19紫杉醇(taxol)是從紅豆杉屬(TaxusL.)植物中分離出的一個具有獨特抗腫瘤活性的二萜類化合物，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床治療卵巢癌和乳腺癌。紫杉醇(taxol)是從紅豆杉屬(TaxusL.)20三、動物細(xì)胞工程的應(yīng)用1.在疫苗生產(chǎn)上的應(yīng)用

。將乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高效表達(dá)，已生產(chǎn)出乙型肝炎疫苗。2.生產(chǎn)單克隆抗體

單克隆抗體可以檢測出多種病毒中非常細(xì)微的株間差異，鑒定細(xì)菌的種型和亞種。3.繁育優(yōu)良品種。

目前，人工受精、胚胎移植等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)。4.在干擾素生產(chǎn)上的應(yīng)用

三、動物細(xì)胞工程的應(yīng)用1.在疫苗生產(chǎn)上的應(yīng)用。2.生產(chǎn)單21是指動物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的生長、分裂和繁殖，并在培養(yǎng)過程中不再形成組織的一項技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)第二節(jié)、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指動物、植物和微生物細(xì)胞在體外無菌條件下的生長、22一、植物細(xì)胞工程的發(fā)展

細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立：1838～1839年間由德國的植物學(xué)家施萊登（Schleiden）和動物學(xué)家施旺（Schwann）所提出,直到1858年才較完善。理論基礎(chǔ)和探索一、植物細(xì)胞工程的發(fā)展細(xì)胞學(xué)說的創(chuàng)立：1838～18323

1902年，德國著名植物生理學(xué)家Haberlandt,提出細(xì)胞全能性學(xué)說，并首次進(jìn)行高等植物的細(xì)胞培養(yǎng)實驗，但細(xì)胞未能發(fā)生細(xì)胞分裂和增殖。

1756年，Moncean首先發(fā)現(xiàn)植物在受傷愈合的組織皮層能產(chǎn)生芽，因而預(yù)言這一途徑可以成為一種繁殖方式1902年，德國著名植物生理學(xué)家Haberlandt,24培養(yǎng)技術(shù)建立培養(yǎng)技術(shù)建立25植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展

20世紀(jì)40年代：J.Bonner銀膠菊組織培養(yǎng)生產(chǎn)橡膠。

20世紀(jì)70年代：植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成份。

20世紀(jì)80年代：400多種植物，600多種代謝產(chǎn)物。40多種植物次生代謝產(chǎn)物達(dá)到或超過植株產(chǎn)量。

20世紀(jì)90年代：1000多種植物。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用發(fā)展20世紀(jì)40年代：J.Bonne261.首先，要取材和除菌。用一定的化學(xué)試劑對材料進(jìn)行嚴(yán)格的表面清洗、消毒。有時還要借助某些特定的酶，對材料進(jìn)行預(yù)處理，以期得到分散生長的細(xì)胞。

常用的消毒滅菌劑:效果較好的有幾種化學(xué)試劑，如次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞等。二、細(xì)胞培養(yǎng)一般步驟1.首先，要取材和除菌。用一定的化學(xué)試劑對材料27

2.其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點，配制細(xì)胞培養(yǎng)基，對培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌或除菌。采用無菌操作技術(shù)，將生物材料接種于培養(yǎng)基中。3.最后，將接種后的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱中，提供各類細(xì)胞生長所需的最佳培養(yǎng)條件。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定生物量時應(yīng)及時收獲或傳代。2.其次，根據(jù)各類細(xì)胞的特點，配制細(xì)胞培養(yǎng)基28三.植物細(xì)胞培養(yǎng)基 植物細(xì)胞的培養(yǎng)基:通常包括無機(jī)鹽、碳源、維生素、生長調(diào)節(jié)素、有機(jī)添加劑等。用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基本上與整個植物的要求一樣，但是用于培養(yǎng)細(xì)胞、組織和器官的培養(yǎng)基要滿足各自特殊的要求三.植物細(xì)胞培養(yǎng)基 植物細(xì)胞的培養(yǎng)基:通常包括無機(jī)鹽、碳源29培養(yǎng)中的細(xì)胞對蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果較差。培養(yǎng)基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。碳源和能源培養(yǎng)中的細(xì)胞對蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果較差。30培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物素和葉酸，效果更好。原生質(zhì)體培養(yǎng)通常需要大多數(shù)必需維生素。維生素培養(yǎng)中的植物細(xì)胞都需要硫胺素，加入煙酸、泛酸、生物31 雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好處的。此外，還使用蛋白酶解產(chǎn)物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有機(jī)添加劑還有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸 雖然植物細(xì)胞在培養(yǎng)過程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入32 激素分為兩類，生長素和分裂素。生長素促進(jìn)細(xì)胞生長，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促進(jìn)細(xì)胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-芐氨基嘌呤和玉米素，對芽的誘導(dǎo)具有重要作用。分裂素和生長素通常一起使用，來促進(jìn)細(xì)胞的分裂、生長。植物生長激素植物生長激素33四.愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織：是指外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏散的排列的薄壁細(xì)胞，是分化的，而且還未形成組織的結(jié)構(gòu)。外植體：是指植物組織培養(yǎng)中用來進(jìn)行離體培養(yǎng)的植物材料。

四.愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)愈傷組織：是指外植體組織增生的34愈傷組織的誘導(dǎo)①選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉②選擇適宜的培養(yǎng)基：MS，B5，N6較高激素濃度豐富的有機(jī)附加物。培養(yǎng)基中有較高含量的無機(jī)氮源較低的蔗糖濃度③適當(dāng)縮短繼代培養(yǎng)的間隔時間有利于疏松易碎愈傷組織的形成。愈傷組織的誘導(dǎo)①選擇適宜的外植體：幼胚、下胚軸、子葉35要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色，呈細(xì)小顆粒狀，疏松易碎適宜懸浮培養(yǎng)適宜再生植株要求：松散性好、增殖快、再生能力強。其外觀一般是色澤呈鮮艷的36食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件37高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤鮮艷二是均一性好三是生長速度快、次生代謝產(chǎn)物合成能力強高表達(dá)細(xì)胞系的篩選建立一是懸浮培養(yǎng)物分散性好，外觀疏松、色澤38五.單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)機(jī)械法將葉肉組織研碎，經(jīng)過濾和離心，收集和凈化細(xì)胞。優(yōu)點：不受酶的傷害，有利于細(xì)胞生理和生化研究。缺點：手工操作難度大，獲得完整的細(xì)胞數(shù)量少。1、單細(xì)胞分離方法五.單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)機(jī)械法將葉肉組織研碎，經(jīng)過濾和離心，收39酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植物體，使細(xì)胞分離。加滲透壓保護(hù)劑如甘露醇以防酶對細(xì)胞的損傷。加硫酸葡聚糖鉀鹽可提高游離細(xì)胞的產(chǎn)量。酶法利用果膠酶、纖維素酶處理植物葉片或其他外植物體，使細(xì)40化學(xué)法利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。

草酸鈣處理胡蘿卜懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物時，可獲得分散細(xì)胞。

秋水仙堿、2，4－D或LH?；瘜W(xué)法利用利用化學(xué)藥劑使細(xì)胞分離的方法。41看護(hù)培養(yǎng)2、單細(xì)胞培養(yǎng)方法

用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂和增殖的方法。優(yōu)點：簡便易行，效果好。缺點：不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞分裂、生長過程?？醋o(hù)培養(yǎng)2、單細(xì)胞培養(yǎng)方法用一塊活躍生長的愈傷組織來促進(jìn)培42平板培養(yǎng)將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)法。平板培養(yǎng)將懸浮單細(xì)胞與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪43平板培養(yǎng)植板率優(yōu)點： 單細(xì)胞在培養(yǎng)基中分布均勻，便于在顯鏡下對細(xì)胞進(jìn)行定點觀察。篩選效率高、篩選量大、操作簡便。缺點： 通氣狀況不好，排泄物質(zhì)易積累造成毒害或影響組織吸收。平板培養(yǎng)植板率優(yōu)點：44在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。微室培養(yǎng)在人工制造的無菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培45優(yōu)點： 可對培養(yǎng)細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，了解一個細(xì)胞的生長、分裂、分化等過程。缺點： 培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pH變動幅度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂。優(yōu)點：46六.提高植物細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物含量的方法加入前體物或誘導(dǎo)物 前體物：次生代謝合成途徑中的某一中間化合物或是合成的起始物。 誘導(dǎo)物：一類能引起植物細(xì)胞代謝強度變化或代謝途徑改變的物質(zhì)。六.提高植物細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物含量的方法加入前體物或誘導(dǎo)物 前47植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用（1）利用植物細(xì)胞工程生產(chǎn)香料（2）生產(chǎn)食品添加劑（3）生產(chǎn)天然食品

七、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)在食品工業(yè)中的應(yīng)用（1）利用植物細(xì)胞工程生48植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點①植物細(xì)胞對剪切力敏感。

②植物細(xì)胞培養(yǎng)通常形成細(xì)胞團(tuán)。③植物細(xì)胞生長速度慢，操作周期長④多泡沫。⑤植物細(xì)胞在高濃度培養(yǎng)時為假塑性流體。⑥植物細(xì)胞的需氧量要比微生物要低的多。⑦大多數(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)需要光照。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的特點①植物細(xì)胞對剪切力敏感。491.植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢把離體的植物細(xì)胞懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)1）培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)接觸面大，傳質(zhì)效果好。2）可帶走有害的代謝產(chǎn)物，避免了有害產(chǎn)物局部濃度過高的問題。3）能充分保證氧的供給。1.植物細(xì)胞懸浮細(xì)胞培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)優(yōu)勢把離體的502.植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包裹于一些多糖或多聚化合物上進(jìn)行培養(yǎng)，并生產(chǎn)有用代謝物的技術(shù)。固定化培養(yǎng)技術(shù)2.植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)植物細(xì)胞固定化是將植物細(xì)胞包51（1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累；（2）減弱剪切力損傷；（3）有利于連續(xù)培養(yǎng)和產(chǎn)物的收集；固定化培養(yǎng)優(yōu)勢（1）有利于次生物質(zhì)的合成、積累；固定化培養(yǎng)優(yōu)勢52

1）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器

植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的初期（20世紀(jì)70年代），主要采用微生物培養(yǎng)用的機(jī)械攪拌反應(yīng)器。1972年，Kato首先用機(jī)械攪拌反應(yīng)器培養(yǎng)煙草細(xì)胞以獲取煙堿。Fujita利用這種反應(yīng)器生產(chǎn)紫草寧。3.植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器機(jī)械攪拌反應(yīng)器

1）懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器

植53機(jī)械攪拌植物細(xì)胞反應(yīng)器機(jī)械攪拌植物細(xì)胞反應(yīng)器54機(jī)械攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點及存在的問題優(yōu)點：機(jī)械攪拌生物反應(yīng)器最大的優(yōu)點就是獲得高的溶氧系數(shù)(KLa＞100h-1)，植物細(xì)胞培養(yǎng)一般只需要KLa在5-20h-1之間就夠了；再是反應(yīng)器的溫度、pH值、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)的濃度較易控制。存在的問題：主要問題是剪切力問題；對只需較低kLa的植物細(xì)胞培養(yǎng)，促進(jìn)氧傳遞的機(jī)械攪拌，每單位體積消耗的功率比氣體攪拌要大；機(jī)械攪拌需攪拌軸，由此又帶來了無菌密封問題。機(jī)械攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點及存在的問題優(yōu)點：機(jī)械攪拌55非機(jī)械攪拌反應(yīng)器通常為氣體攪拌反應(yīng)器，是一種利用通入的空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡式反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器，氣升式反應(yīng)器又可分為外循環(huán)和內(nèi)循環(huán)式。我國的劉大陸、查麗杭等發(fā)明了“氣升內(nèi)錯流式”植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器用于培養(yǎng)紫草，紫草寧含量達(dá)到了干細(xì)胞重的10%，是天然植株的2-8倍。非機(jī)械攪拌反應(yīng)器通常為氣體攪拌反應(yīng)器，是一種利56食品生物技術(shù)-第四章-細(xì)胞工程ppt課件57氣體攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點及存在的問題優(yōu)點：剪切力小，對植物細(xì)胞損傷??；因沒有攪拌軸而更易保持無菌；操作費用低。不足：因氣體攪拌強度低，高密度培養(yǎng)時混合不夠均勻?？看罅康耐廨斎雱恿亢湍芰?，以保證反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的良好傳質(zhì)、傳熱。但過量的通氣易排除培養(yǎng)液中的二氧化碳和乙烯，對于細(xì)胞生長有阻礙作用。再是過高的溶氧對植物細(xì)胞合成次級代謝產(chǎn)物不利。氣體攪拌反應(yīng)器的優(yōu)點及存在的問題優(yōu)點：剪切力小，582)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器

固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生物體用物理或化學(xué)方法使其與適當(dāng)載體相結(jié)合，作為固體催化劑利用。2)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器

固定化細(xì)胞：將一定生理功能的生59優(yōu)點：單位體積細(xì)胞多，受剪切力小。缺點：由于其混合效果低，對必要的氧傳遞，pH值、溫度控制和氣體產(chǎn)物(如C02)的排除造成了困難。再者支持物顆粒破碎易堵塞填充床。填充床反應(yīng)器Jones在填充床反應(yīng)器中進(jìn)行了固定化胡蘿卜的培養(yǎng)，Kargi采用這種反應(yīng)器培養(yǎng)長春花優(yōu)點：單位體積細(xì)胞多，受剪切力小。填充床反應(yīng)器Jones在60流化床反應(yīng)器優(yōu)點：良好的傳質(zhì)特性。缺點：剪切力和顆粒碰撞會損壞固定化細(xì)胞，同時，流體動力學(xué)的復(fù)雜性使之難以放大。典型的流化床反應(yīng)器是利用液體或氣體的流動使支持物顆粒處于懸浮狀態(tài)。Hamilton用之培養(yǎng)胡蘿卜細(xì)胞，研究了轉(zhuǎn)化酶活性。流化床反應(yīng)器優(yōu)點：良好的傳質(zhì)特性。典型的流化床反應(yīng)器是利用液61膜反應(yīng)器優(yōu)點：可以重復(fù)使用。另外，流體易控制，易放大，而且能提供更均勻的環(huán)境條件。膜具有選擇性，有利于產(chǎn)品分離。缺點是構(gòu)建膜反應(yīng)器的成本較高。膜反應(yīng)器優(yōu)點：可以重復(fù)使用。另外，流體易控制，易放大，而62第三節(jié)、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)63

19世紀(jì)30年代，Muller,Schwann,Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象。1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在，1855年～1858年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞。

1．融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)一、動物物細(xì)胞工程的發(fā)展19世紀(jì)30年代，Muller,Schwann,V641859年，A.Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個核細(xì)胞融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而形成的。1859年，A.Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏652.動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立 1907年，R.Harrison將蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織存活了若干星期，而且還長出了軸突(神經(jīng)纖維)細(xì)胞。 Carrel(1911)發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對于某些細(xì)胞的生長具有很強的促進(jìn)效應(yīng)，把無菌技術(shù)引到了組織培養(yǎng)技術(shù)中。2.動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立 1907年，R.Harr661914年，Thomson創(chuàng)立了器官培養(yǎng)法，以后被Strangeways和Fell所發(fā)展。1940年，Earle建立了小鼠的結(jié)締組織細(xì)胞系－L系。1951年，Gay建立了第一個人體細(xì)胞系.1914年，Thomson創(chuàng)立了器官培養(yǎng)法，以后被Stran673.細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生 1958年,Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。 Harris(1965)誘導(dǎo)不同的動物體細(xì)胞融合獲得成功。Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用選擇性培養(yǎng)基篩選異型融合細(xì)胞，并能不斷地增殖。 1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。3.細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生 1958年,O684.動物克隆技術(shù)的建立 1891，Heape等人首次報道了家兔胚胎移植成功的結(jié)果。 20世紀(jì)30年代以后，先后在羊、豬、牛等動物的胚胎移植上獲得成功。

1962年，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1％的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。 1997年2月，英國科學(xué)家Wilmut等報道了世界第一只克隆羊的誕生。4.動物克隆技術(shù)的建立 1891，Heape等人首次報道了691.過程二、動物細(xì)胞培養(yǎng)1.過程二、動物細(xì)胞培養(yǎng)702.幾個概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組織,將它分散成單個細(xì)胞,然后,放在適宜的培養(yǎng)基中,讓這些細(xì)胞生長和增殖,并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。動物細(xì)胞培養(yǎng)2.幾個概念：動物細(xì)胞培養(yǎng)就是從動物機(jī)體中取出相關(guān)的組71 將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng) 用胰蛋白酶將出現(xiàn)接觸抑制的貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，制成細(xì)胞懸液，分裝到多個培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程叫傳代培養(yǎng)。 將動物組織消化后的初次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)72細(xì)胞系和細(xì)胞株 初次培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)第一次傳代成功后，即稱之為細(xì)胞系。 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱細(xì)胞株。細(xì)胞系和細(xì)胞株 從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)73有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系 大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)增殖，當(dāng)超過有限世代后，它們可能有兩種情況，一是衰老死亡，二是發(fā)育成無限細(xì)胞系或稱連續(xù)細(xì)胞系。有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過度期稱為轉(zhuǎn)換期，其轉(zhuǎn)換過程在動物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化。

有限細(xì)胞系和無限細(xì)胞系 大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)增殖，當(dāng)超74接觸抑制密度抑制3.動物細(xì)胞培養(yǎng)生長的特點貼附生長接觸抑制密度抑制3.動物細(xì)胞培養(yǎng)生長的特點貼附生長75貼附生長

粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。 懸浮型細(xì)胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細(xì)胞。絕大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞屬粘附型細(xì)胞，只有少數(shù)細(xì)胞類型如某些腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞可在懸浮狀態(tài)下生長。貼附生長粘附型細(xì)胞:附著在某一固相支持物表面才能生長76細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞在貼壁生長過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)胞分裂和生長停止的現(xiàn)象。細(xì)胞接觸抑制細(xì)胞在貼壁生長過程中，細(xì)胞間相互接觸，細(xì)77密度抑制

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞密度增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響而導(dǎo)致的細(xì)胞分裂和生長停止。細(xì)胞在體內(nèi)、外的粘附方式存在差異體內(nèi)：粘附是全方位，外形具有復(fù)雜的立體特征體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個附著平面，外形一般與體內(nèi)時明顯不同密度抑制細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞密度增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減78上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型性細(xì)胞型4、培養(yǎng)動物細(xì)胞形態(tài)上皮細(xì)胞型4、培養(yǎng)動物細(xì)胞形態(tài)79 類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。彼此緊密相連成鋪石狀薄層；生長時呈膜狀移動；很少脫離細(xì)胞群而單個活動上皮細(xì)胞型 類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核。彼此緊80 胞體梭形或不規(guī)則三角形；胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的細(xì)胞突起；中有卵圓形核。排列成放射狀，漩渦狀，不連成片。成纖維細(xì)胞型 胞體梭形或不規(guī)則三角形；胞質(zhì)向外伸出2—3個長短不等的細(xì)胞81游走細(xì)胞型

外形不規(guī)則且不斷變化，細(xì)胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒。生長位置不固定，分散，呈活躍的的游走和變形運動。游走細(xì)胞型外形不規(guī)則且不斷變化，細(xì)胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆82多型性細(xì)胞型

外形不規(guī)則，細(xì)胞由略呈多角形的胞體和細(xì)長的、類似偽足的胞突兩部分組成，胞內(nèi)容易出現(xiàn)暗的吞噬性顆粒多型性細(xì)胞型外形不規(guī)則，細(xì)胞由略呈多角形的胞體和細(xì)長的、83血清：如Hela細(xì)胞系在高血清－成纖維細(xì)胞樣；低血清－上皮樣細(xì)胞pH：如Hela細(xì)胞系，太酸或太堿－成纖維細(xì)胞樣；標(biāo)準(zhǔn)pH－上皮樣細(xì)胞

細(xì)胞密度：3T3，低密度－成纖維細(xì)胞樣；高密度－上皮樣細(xì)胞

生長狀態(tài)改變：懸浮－圓形懸??；貼附－成纖維或上皮樣

轉(zhuǎn)化與否：未轉(zhuǎn)化成纖維樣；轉(zhuǎn)化后－可成上皮樣培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)變化血清：如Hela細(xì)胞系在高血清－成纖維細(xì)胞樣；低血清－上皮樣84三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程1.培養(yǎng)細(xì)胞生命期

所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程1.培養(yǎng)細(xì)胞生命期所謂85正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期正常培養(yǎng)的細(xì)胞周期862.體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期-生長曲線潛伏期指數(shù)增長期平衡期衰退期所謂細(xì)胞的“一代”是指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。2.體外培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期-生長曲線潛伏期所謂細(xì)胞的“一87四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1.無菌、無毒的環(huán)境添加一定量的抗生素，定期更換培養(yǎng)液。2.溫度和pH溫度pH與體內(nèi)相近35-37℃7.2~7.4四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)1.無菌、無毒的環(huán)境添加一定量的883.氣體環(huán)境O2CO2細(xì)胞代謝所必需維持pH

CO2培養(yǎng)箱（95%空氣＋5%CO2

）3.氣體環(huán)境O2細(xì)胞代謝所必需維持pHCO2培養(yǎng)箱（95895.平衡鹽溶液BSS 人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，用來洗滌細(xì)胞。 Hanks液、Earle液和PBS液等4.營養(yǎng)物質(zhì)糖、氨基酸、促生長因子、無機(jī)鹽、微量元素、激素以及動物或人血清等。5.平衡鹽溶液BSS 人工合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)用液，用來洗滌細(xì)90培養(yǎng)方式分為：分批式流加式半連續(xù)式連續(xù)式1.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式五、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式分為：1.動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)工藝方式五、動物細(xì)胞大規(guī)91

分批式培養(yǎng)

分批式培養(yǎng)：指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物不斷形成，經(jīng)一段時間后，終止培養(yǎng)。特點：分批式培養(yǎng)過程的環(huán)境隨時間變化很大細(xì)胞的生長階段可分為延滯期、對數(shù)生長期、減速期、平穩(wěn)期和衰退期。

分批式培養(yǎng)

分批式培養(yǎng)：指先將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入92

流加式培養(yǎng)

特點：可避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高；能防止?fàn)I養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡；整個過程反應(yīng)體積是變化的。

流加式培養(yǎng)是指先將終體積1/3~1/2的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，隨著細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分又不斷補充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞持續(xù)生長代謝，到反應(yīng)終止時取出整個反應(yīng)系。

流加式培養(yǎng)

特點： 流加式培養(yǎng)是指先將終體積1/3~193半連續(xù)式培養(yǎng)

指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批培養(yǎng)的培養(yǎng)液部分取出，并補充加入等量的新鮮培養(yǎng)基，使反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。半連續(xù)培養(yǎng)能夠重復(fù)獲得大量均一的培養(yǎng)細(xì)胞供進(jìn)一步利用。特點：操作簡便、生產(chǎn)效率高，可長期生產(chǎn)，細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高水平。半連續(xù)式培養(yǎng)

指在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，將分批94連續(xù)式培養(yǎng)

連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培養(yǎng)物并注入等量新鮮培養(yǎng)基，使培養(yǎng)物不斷得到養(yǎng)分補充，保持反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。 特點：（1）反應(yīng)器培養(yǎng)狀態(tài)恒定，保持細(xì)胞在優(yōu)化狀態(tài)下生長；

（2）適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)； (3)操作復(fù)雜、增加污染機(jī)會、細(xì)胞變異、設(shè)備儀器要求高連續(xù)式培養(yǎng)

連續(xù)式培養(yǎng)：指在培養(yǎng)過程中，以不斷抽取懸浮培95

2、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)貼壁培養(yǎng)固定化培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)技術(shù)大載體培養(yǎng)技術(shù)多孔載體培養(yǎng)微囊化培養(yǎng)技術(shù)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)2、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)96第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù) 是指在外力的作用下，兩個以上的異源（種、屬）細(xì)胞或原生質(zhì)體互相接觸，不經(jīng)過有性過程而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成一個雜合細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合（體細(xì)胞雜交）

第三節(jié)細(xì)胞融合技術(shù) 是指在外力的作用下，兩個以上的異源（種97白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)植物體細(xì)胞融合應(yīng)用示例白菜甘藍(lán)白菜－甘藍(lán)植物體細(xì)胞融合應(yīng)用示例98雜交的兩個細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁原生質(zhì)體Ａ、Ｂ經(jīng)離心、振動、電刺激用聚二乙醇（ＰＥＧ）誘導(dǎo)融合后的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁雜種細(xì)胞脫分化細(xì)胞分裂愈傷組織雜種植株再分化（植物體細(xì)胞融合完成的標(biāo)志）植物細(xì)胞融合植物組織培養(yǎng)雜交的兩個細(xì)胞用纖維素酶、果膠酶處理細(xì)胞壁原生質(zhì)體Ａ、Ｂ經(jīng)離99 細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜發(fā)生粘連，細(xì)胞開始細(xì)胞質(zhì)融合，然后在培養(yǎng)過程中，進(jìn)而發(fā)生核融合，形成雜種細(xì)胞。細(xì)胞融合的過程 細(xì)胞在促融因子的作用下，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，然后，細(xì)胞之間的質(zhì)膜100細(xì)胞融合細(xì)胞融合101一.誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法1、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合 病毒是最早采用的融合劑。常用于誘導(dǎo)動物細(xì)胞融合的病毒有仙臺病毒、新城雞瘟病毒、皰疹病毒等，其中仙臺病毒最常用。 用作融合劑的病毒必須事先用紫外線或β-丙內(nèi)酯滅活，使病毒的感染活性喪失而保留病毒的融合活性。一.誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法1、病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合 病毒是最早采用的102兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近，使兩個細(xì)胞膜、胞質(zhì)間互相滲透、細(xì)胞核互相融合，進(jìn)入正常的細(xì)胞分裂途徑，形成雜種細(xì)胞。機(jī)制機(jī)制103優(yōu)點：融合率較高，適宜各種動物細(xì)胞，且仙臺病毒能在雞胚中大量繁殖，容易培養(yǎng)；缺點：仙臺病毒不穩(wěn)定，在保存過程中融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣。此外，病毒引進(jìn)細(xì)胞后，可能會對細(xì)胞的生命活動產(chǎn)生干擾。病毒誘導(dǎo)融合優(yōu)缺點病毒誘導(dǎo)融合優(yōu)缺點104 利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。2、化學(xué)融合劑法 利用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體相互靠近、粘連融合的方法。2105

1981年，Scheurich和Zimmermann發(fā)明了電誘導(dǎo)細(xì)胞融合。

采用直流電脈沖的誘導(dǎo)，可改變原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷，使異種原生質(zhì)體粘合，并使原生質(zhì)膜瞬間破裂，相鄰的原生質(zhì)體連接、閉合、產(chǎn)生融合體。

3、電誘導(dǎo)細(xì)胞融合法 1981年，Scheurich和Zimmermann106細(xì)胞電融合原理：

懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在交流電場中（1—100MHz和100—1000V/cm），會向小電極移動，并極化成偶極子，并沿電場方向排列成串，此時再加上適當(dāng)強度和持續(xù)時間的高壓電脈沖，即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電降解，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。細(xì)胞電融合原理：

懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液107

①電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個膜接觸狀態(tài)，形成念珠鏈。

②融合：由于膜的可逆性電激穿，使原生質(zhì)體發(fā)生融合。電融合包括兩個步驟：

①電泳：在電極的作用下，原生質(zhì)體泳到一起，建立一個108原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接觸。2）脈沖刺激后30s

3)50秒后4）1.5分鐘后5）6分鐘后6）15分鐘后，原生質(zhì)體融合完成。原生質(zhì)體電融合過程1）在高頻電流電場下的相互接觸。109優(yōu)點：融合率高，達(dá)70％－80％，甚至100％可在顯微鏡下定向誘導(dǎo)細(xì)胞融合可直接挑選雜種細(xì)胞重復(fù)性強、對原生質(zhì)體傷害??；裝置精巧、方便簡單；免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控制性強等。缺點：必須購置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。優(yōu)點：融合率高，達(dá)70％－80％，甚至100％缺點：必須購置110離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合 在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場的改變，據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)的細(xì)胞融合離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合 在離子束與生物體相互作用中，粒子的植入111二、植物細(xì)胞融合原生質(zhì)體 原生質(zhì)體是指用特殊方法去除細(xì)胞壁后而形成的祼露的、有生活力的原生質(zhì)團(tuán)。二、植物細(xì)胞融合原生質(zhì)體 原生質(zhì)體是指用特殊方法去除細(xì)胞壁112植物原生質(zhì)體的制備流程原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的純化鑒定取材與消毒洗滌活力測定植物原生質(zhì)體的制備流程原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的純化鑒定取材與1131、取材與消毒 可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。肥皂水－70%酒精－3%次氯酸鈉－無菌水1、取材與消毒 可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷114先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形后，再用機(jī)械法磨碎組織，從傷口處可釋放出完整的原生質(zhì)體。缺點：獲得完整的原生質(zhì)體的數(shù)量比較少，能夠用此法產(chǎn)生原生質(zhì)體的植物種類受到限制。優(yōu)點：該方法可避免酶制劑對原生質(zhì)體的破壞作用。2、原生質(zhì)體的分離機(jī)械分離法先將細(xì)胞放在高滲糖溶液中預(yù)處理，待細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離115指將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時間，在酶液的作用下，細(xì)胞壁被降解，從而獲得大量有活力的原生質(zhì)體的方法。酶解分離法優(yōu)點：獲得量大，適用廣