數(shù)據(jù)分析文獻(xiàn)閱讀-測(cè)序深度和覆蓋度剖析課件

基因組分析的關(guān)鍵因素

—測(cè)序的深度和覆蓋度李言2014-08-19基因組分析的關(guān)鍵因素

—測(cè)序的深度和覆蓋度李言1目錄基因組從頭測(cè)序基因組重測(cè)序轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基因定位分析目錄基因組從頭測(cè)序2基本概念測(cè)序深度：測(cè)序得到的堿基數(shù)量與待測(cè)基因組的比值，假設(shè)一個(gè)基因大小為2M，測(cè)序深度為10X，那么獲得的總數(shù)據(jù)量為20M。測(cè)序覆蓋度：測(cè)序獲得的序列占整個(gè)基因組的比例，例如一個(gè)細(xì)菌基因組測(cè)序，覆蓋度是98%，那么還有2%的序列區(qū)域是沒(méi)有通過(guò)測(cè)序獲得的。Gap:由于基因組中復(fù)雜結(jié)構(gòu)（高GC，重復(fù)序列）的存在，使得測(cè)序最終拼接組裝獲得的序列往往無(wú)法覆蓋所有的區(qū)域，這部分區(qū)域就是Gap?；靖拍顪y(cè)序深度：測(cè)序得到的堿基數(shù)量與待測(cè)基因組的比值，假設(shè)3基本概念覆蓋度的冗余也叫深度或覆蓋深度。LN/G表示：L代表閱讀的長(zhǎng)度，N代表閱讀序列的數(shù)量，G代表單倍體基因組長(zhǎng)度。一般而言，越高覆蓋度的測(cè)序方法往往要求越高的花費(fèi)。真實(shí)的測(cè)序方法中讀碼序列很短（小于250個(gè)核苷酸），并且有錯(cuò)誤；可以通過(guò)增加讀碼序列的數(shù)量來(lái)克服它，比如：具有1%錯(cuò)誤變異率的譯碼，在結(jié)合8個(gè)相同的包含變異位點(diǎn)的序列后可以使錯(cuò)誤率變?yōu)槭f(wàn)分之一?；靖拍罡采w度的冗余也叫深度或覆蓋深度。LN/G表示：L代表4基本概念Lander–Waterman公式：揭示人類(lèi)基因組和外顯子組測(cè)序的一般性規(guī)律。從公式中知：通過(guò)試算基因組的測(cè)序深度的方差來(lái)評(píng)估覆蓋度的均勻性非常重要。從Box1中知：覆蓋度越高最后測(cè)序的堿基數(shù)也越多，而且讀碼序列的個(gè)數(shù)與長(zhǎng)度之間具有一定的關(guān)系,并且在一定的比例時(shí)測(cè)序效果最好?；靖拍頛ander–Waterman公式：揭示人類(lèi)基因組和5基因組從頭測(cè)序指不依賴(lài)于任何已知基因組序列信息對(duì)某個(gè)物種的基因組進(jìn)行測(cè)序。決定測(cè)序深度的主要因素是錯(cuò)誤率、拼接算法、讀碼序列的長(zhǎng)度和基因組的重復(fù)的復(fù)雜性。經(jīng)常使用混合的方法得到高質(zhì)量的拼接，比如高深度、短閱讀測(cè)序的優(yōu)勢(shì)常與低深度但是長(zhǎng)閱讀測(cè)序法相結(jié)合。基因組從頭測(cè)序指不依賴(lài)于任何已知基因組序列信息對(duì)某個(gè)物種的基6基因組從頭測(cè)序例如野生草山羊序列的拼接，因?yàn)樗哂?.4Gb并且三分之二的區(qū)域有高度重復(fù)的轉(zhuǎn)座元件，所以測(cè)序非常困難。首先成功把原始序列拼接成短序列，使用了45個(gè)文庫(kù)中的高質(zhì)量的短閱讀長(zhǎng)度的398Gb的數(shù)據(jù)，其中的覆蓋率達(dá)到了90倍。然后這些片段可以使用雙尾閱讀信息與長(zhǎng)的支架進(jìn)行串聯(lián)。基因組從頭測(cè)序例如野生草山羊序列的拼接，因?yàn)樗哂?.4Gb7基因組從頭測(cè)序低覆蓋度在測(cè)序后分析和生物學(xué)解釋方面有兩個(gè)主要的影響：1、它不能確定是否有編碼蛋白質(zhì)基因的缺失、開(kāi)放閱讀框的中斷、一個(gè)真正的進(jìn)化基因的丟失。2、更嚴(yán)重的是低覆蓋度會(huì)產(chǎn)生序列的錯(cuò)誤，并且會(huì)隨著下游的分析和誤導(dǎo)性的結(jié)論而進(jìn)行擴(kuò)散?；蚪M從頭測(cè)序低覆蓋度在測(cè)序后分析和生物學(xué)解釋方面有兩個(gè)主要8基因組重測(cè)序?qū)蚪M序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析。與已知序列比對(duì)，尋找單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、插入缺失位點(diǎn)（InDel）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（SV，StructureVariation）位點(diǎn)及拷貝數(shù)變化(CNV)。測(cè)序的深度取決于研究的變異類(lèi)型、疾病的類(lèi)型和區(qū)域的長(zhǎng)度?；蚪M重測(cè)序?qū)蚪M序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體或9基因組重測(cè)序測(cè)序的策略取決于測(cè)序深度和樣本數(shù)量之間的權(quán)衡。WGS（全基因組測(cè)序）：高深度的WGS方法對(duì)DNA測(cè)序來(lái)說(shuō)是黃金準(zhǔn)則，因?yàn)樗鼛缀蹩梢蕴綔y(cè)到所有的變異類(lèi)型。WES（全基因組外顯子測(cè)序）：WES主要探測(cè)在蛋白質(zhì)編碼基因中的SVNs（單核苷酸變異）、indels（插入缺失）和其他的功能元件，因此它忽略了調(diào)節(jié)元件比如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。WES的測(cè)序花費(fèi)比WGS要少，但它具有各種的限制條件?；蚪M重測(cè)序測(cè)序的策略取決于測(cè)序深度和樣本數(shù)量之間的權(quán)衡。10基因組重測(cè)序SNV和indel檢測(cè)：使用Illumina短閱讀技術(shù)表明，純合型的SVNs的檢測(cè)使用15x的覆蓋度，雜合型的為33x。變異檢測(cè)的能力會(huì)因堿基的質(zhì)量低和覆蓋度不均勻而下降。CNV檢測(cè)：CNVs可以通過(guò)對(duì)WES和WGS兩種測(cè)序的數(shù)據(jù)使用分析覆蓋深度來(lái)得到，其中拷貝數(shù)目的變化可通過(guò)基因組區(qū)域的覆蓋深度的變化推導(dǎo)得到。在WGS中0.1x的覆蓋度可以獲得合理的特異位點(diǎn)?；蚪M重測(cè)序數(shù)據(jù)的分析：典型的重測(cè)序數(shù)據(jù)的分析途徑是把測(cè)序的短序列與參考的基因組進(jìn)行比對(duì)。基因組重測(cè)序SNV和indel檢測(cè)：使用Illumina短閱11基因組重測(cè)序WGS：80x的覆蓋度要求覆蓋89.6–96.8%的目標(biāo)堿基，這取決于測(cè)序的平臺(tái)但是至少要10x的覆蓋度。外顯子的研究中要求至少80%的目標(biāo)區(qū)域被覆蓋，并且使用10x的覆蓋度。群體基因組測(cè)序中，許多基因組的測(cè)序都是短閱讀序列的方法，比如：400個(gè)樣本，4倍的覆蓋度?；蚪M重測(cè)序WGS：80x的覆蓋度要求覆蓋89.6–96.812基因組重測(cè)序四種不同測(cè)序策略（WES,WGS,RNA-seq,ChIp-seq)的測(cè)序?qū)ι疃鹊囊笠膊幌嗤?。它們的測(cè)序深度和測(cè)試的花費(fèi)按以下的順序遞增：ChIp-seq,RNA-seq,WES,WGS。ChIp-seq，WES,WGS具有典型的應(yīng)用和標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)序深度，但是RNA-seq的深度與它們不一致，并且差距非常之大?；蚪M重測(cè)序四種不同測(cè)序策略（WES,WGS,RNA-seq13轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

RNA-seq:可以對(duì)生物樣本的表達(dá)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行檢測(cè)和量化分析，但沒(méi)有明確的指南和閱讀數(shù)量的要求。它的應(yīng)用主要包括：異常轉(zhuǎn)錄物的發(fā)現(xiàn)，差異性表達(dá)和可變剪接的分析。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的覆蓋度：讀碼序列的數(shù)量取決于RNA的最小豐度；有用的讀碼序列可以通過(guò)減少核糖體RNA，豐富RNA的數(shù)目來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

RNA-seq:可以對(duì)生物樣本的表達(dá)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行檢14轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)：轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)主要取決于它在測(cè)序文庫(kù)中的長(zhǎng)度和豐度，以及它的可作圖性。如果分子以每100萬(wàn)個(gè)中0.6-2.5個(gè)的頻率出現(xiàn)，使用12.4millions特異映射的36bp閱讀片段是無(wú)法被檢測(cè)的。基因組的轉(zhuǎn)錄能力影響閱讀的深度，哺乳動(dòng)物中有成千上萬(wàn)個(gè)基因，大多基因都有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄時(shí)通常跳過(guò)基因間序列；而單細(xì)胞真核生物、細(xì)菌等含有較少的復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也比較少。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)：轉(zhuǎn)錄物的檢測(cè)主要取決于它在測(cè)序文庫(kù)15轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

例如：比如僅僅四百萬(wàn)個(gè)閱讀序列就可以檢測(cè)到酵母的80%的基因（至少4個(gè)reads映射到它的3‘末端），隨著額外數(shù)據(jù)的添加加被檢測(cè)基因的數(shù)量增加的并不明顯。差異性表達(dá)分析：由于外部的刺激或是實(shí)驗(yàn)的偏差造成的基因表達(dá)的差異是非常有用的，經(jīng)常用于推導(dǎo)生物體內(nèi)的特異路徑，產(chǎn)生意外的假說(shuō)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

例如：比如僅僅四百萬(wàn)個(gè)閱讀序列就可以檢測(cè)到酵母的16轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在RNA-seq的分析中基因或者轉(zhuǎn)錄物的豐度經(jīng)常用FPKM來(lái)表示。FPKM=(totalexonfragments)/(mappedreads(millions)*exonlength(kb))當(dāng)前計(jì)算FPKM時(shí)通常用75%的reads數(shù)量代替映射到的reads數(shù)量。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在RNA-seq的分析中基因或者轉(zhuǎn)錄物的豐度經(jīng)常用17轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可變剪接的分析：RNA-seq實(shí)驗(yàn)可以整合外顯子閱讀的信息，來(lái)檢測(cè)是否有替代亞型。人類(lèi)基因中的大部分都是被可變剪接的，外顯子的跳讀是可變剪接的主要類(lèi)型。早期兩種可變剪接的研究中每個(gè)樣本使用3.5到4.4個(gè)百萬(wàn)的27-bp的reads,和12到29個(gè)百萬(wàn)的32-bp的reads。最近的一項(xiàng)研究使用~30million的80-bp的單尾reads去鑒定老鼠組織中的不同類(lèi)型的外顯子。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可變剪接的分析：RNA-seq實(shí)驗(yàn)可以整合外顯子閱18基因定位分析基因定位分析主要有兩種方法：ChIp-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序）和3C（染色體構(gòu)象捕獲）。定位分析的位點(diǎn)主要包括：DNA-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)、RNA-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)、RNA-DNA相互作用位點(diǎn)和DNA-DNA相互作用位點(diǎn)基因定位分析基因定位分析主要有兩種方法：ChIp-seq19基因定位分析ChIp-seq鑒定DNA-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)：1、最初的ChIp-seq技術(shù)僅僅可以檢測(cè)樣本中已經(jīng)測(cè)序的2~5百萬(wàn)的閱讀片段。2、影響ChIp-seq實(shí)驗(yàn)中閱讀數(shù)目的重要因素是蛋白質(zhì)是否是點(diǎn)源因子、廣源因子或混源因子。基因定位分析ChIp-seq鑒定DNA-蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)：20基因定位分析單源因子出現(xiàn)在基因組的特異位點(diǎn)中，包括：序列特異性轉(zhuǎn)錄因子、非常狹小的染色質(zhì)標(biāo)記；這些單源因子與增強(qiáng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)合。廣源因子一般覆蓋基因組的擴(kuò)展區(qū)域，比如許多染色質(zhì)標(biāo)記：histoneH3lysine9trimethylation(H3K9me3)marks混源因子比如RNA聚合酶II,產(chǎn)生以上兩種譜峰。廣源因子和混源因子比單源因子要求更多的讀碼序列?；蚨ㄎ环治鰡卧匆蜃映霈F(xiàn)在基因組的特異位點(diǎn)中，包括：序列特異21基因定位分析從圖2中知：1、單源因子產(chǎn)生幾百個(gè)堿基對(duì)的狹窄的譜峰。2、廣源因子產(chǎn)生大范圍的增強(qiáng)的信號(hào)。3、混源因子產(chǎn)生一定范圍的增強(qiáng)區(qū)域。ChIp-seq實(shí)驗(yàn)中三種因子的要求：1、單源因子應(yīng)該在哺乳動(dòng)物中對(duì)每個(gè)因子使用20個(gè)million的reads，或者在組織和小的基因組中使用2個(gè)million的reads,比如果蠅和線蟲(chóng)。2、廣源因子和混源因子對(duì)reads的大致數(shù)量并不清楚，一般而言是40個(gè)million的reads。

基因定位分析從圖2中知：22總結(jié)使用測(cè)序方法時(shí)有許多的因素可以影響到測(cè)序的深度和覆蓋度。我們?cè)谠O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)候要考慮以下的問(wèn)題：基因組結(jié)構(gòu)的差異、轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性、閱讀的可作圖性、測(cè)