備課素材：大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)及代謝調(diào)控 高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)及代謝調(diào)控2019版高中生物學(xué)選擇性必修三說，大腸桿菌廣泛應(yīng)用于基因工程的受體細(xì)胞：之后，再用大腸桿菌發(fā)酵獲取產(chǎn)品。大腸桿菌及其衍生菌株是目前蛋白表達(dá)使用最廣泛的菌株。與其他革蘭陰性菌一樣，大腸桿菌有細(xì)胞內(nèi)膜與細(xì)胞外膜之分，并將細(xì)胞分成兩部分空間，即細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞周質(zhì)，通常大腸桿菌表達(dá)的重組蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可溶性重組蛋白易受大腸桿菌內(nèi)源性蛋白酶降解，導(dǎo)致表達(dá)水平低下。形成包涵體的重組蛋白可有效避免內(nèi)源性蛋白酶的降解，且分離純化方便，分離效率高，但重組蛋白的復(fù)性較困難。大腸桿菌的工業(yè)化發(fā)酵主要采用營養(yǎng)源誘導(dǎo)、溫度誘導(dǎo)、IPTG(丙基硫代半乳糖苷和乳糖誘導(dǎo)3種方式：1.營養(yǎng)源誘導(dǎo)營養(yǎng)源誘導(dǎo)啟動(dòng)子包括phoA、ugp、mgl及araB等，此種表達(dá)方式受培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)無機(jī)磷濃度(Pi)、糖原或生物素調(diào)控，其他尚有pH及溶氧誘導(dǎo)調(diào)控型，雖然其中一些表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用例子還不多,但已顯示出很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

2.

溫敏性啟動(dòng)子誘導(dǎo)溫敏性啟動(dòng)子有PL、PR或其雜合啟動(dòng)子PLPR等。發(fā)酵培養(yǎng)溫度采用溫度傳感器檢測并閉環(huán)控制，對于采用溫敏型啟動(dòng)子的大腸桿菌重組菌，溫度檢測與控制十分關(guān)鍵。在發(fā)酵過程中溫度陡然升高，使細(xì)胞內(nèi)的酶活性加強(qiáng)，代謝加快，但當(dāng)溫度持續(xù)較高時(shí)，會引起細(xì)胞內(nèi)一些酶活性降低或變性，細(xì)胞活力逐漸減弱，甚至死亡，即產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)性變化。因此采用溫敏型啟動(dòng)子菌株表達(dá)外源蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間較短，適用于培養(yǎng)規(guī)模較小的重組蛋白發(fā)酵。溫度控制策略通常以30℃或37℃開始培養(yǎng)大腸桿菌到所需的細(xì)胞密度，再升溫至42℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。對于溫敏型表達(dá)系統(tǒng)，最佳的發(fā)酵過程控制方法是在42℃高溫誘導(dǎo)培養(yǎng)1h后，采用溫度逐漸下降的變溫策略，誘導(dǎo)時(shí)間可明顯延長，表達(dá)水平明顯提高。3.

IPTG及乳糖誘導(dǎo)采用IPTG誘導(dǎo)發(fā)酵的重組菌，IPTG濃度應(yīng)控制在亞適量水平，濃度過高導(dǎo)致細(xì)胞中毒，濃度過低引起啟動(dòng)子啟動(dòng)程度減弱，從而影響外源蛋白高效表達(dá)。另外IPTG存在于發(fā)酵液中時(shí)，對蛋白純化亦帶來一定難度。由于IPTG對細(xì)胞有一定的毒害作用、大規(guī)模發(fā)酵價(jià)格昂貴和蛋白質(zhì)藥物純化操作難度增加等原因，在實(shí)際大規(guī)模發(fā)酵時(shí)，一般均采用乳糖替代IPTG。乳糖與其他碳源比例是關(guān)鍵因素，乳糖濃度過小，由于甘油等碳源對啟動(dòng)子產(chǎn)生阻遏作用或抑制作用，使啟動(dòng)子不能啟動(dòng)或啟動(dòng)強(qiáng)度不夠易造成不表達(dá)或低水平表達(dá)，而乳糖濃度過大，會使得菌體只利用乳糖，造成碳源浪費(fèi)，一般乳糖濃度約為2g/L。大腸桿菌培養(yǎng)過程中，特別是菌和宿主菌的生長速率、底物消耗速率、產(chǎn)物生成速率、質(zhì)粒穩(wěn)定性等動(dòng)力學(xué)規(guī)律，是大腸桿菌發(fā)酵過程優(yōu)化的重要基礎(chǔ)。通過分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行有關(guān)動(dòng)力學(xué)研究，對制定的優(yōu)化控制策略加以驗(yàn)證和調(diào)整改進(jìn)大腸桿菌的代謝活動(dòng)，可利用一些宏觀變量觀察和跟蹤。雖然細(xì)胞水平代謝活動(dòng)是肉眼無法直接觀察的，但pH、溶氧、氧消耗速率、二氧化碳釋放速率、呼吸商、菌體細(xì)胞生長、糖耗、氮耗等宏觀變量的變化提供了代謝活動(dòng)的線索，反映了菌代謝流的狀況，是發(fā)酵工藝控制和干預(yù)依據(jù)，也是發(fā)酵過程放大的重要依據(jù)。配置多種傳感器，利用計(jì)算機(jī)采集數(shù)據(jù)并控制的發(fā)酵罐是進(jìn)行有關(guān)研究的關(guān)鍵手段。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（宿主菌、外源基因、載體等）不同時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)表現(xiàn)的代謝過程特征也不同。有些可通過發(fā)酵過程的操作優(yōu)化（補(bǔ)料策略環(huán)境條件優(yōu)化等）使細(xì)胞代謝正常，獲得高效表達(dá)；有些可能是基因背景原因無法實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。1.

宿主菌的選擇不同的大腸桿菌菌株在培養(yǎng)條件和外源基因表達(dá)能力上存在很大差別?，F(xiàn)在普遍應(yīng)用的大腸桿菌BL21(DE3)plysS因其帶有編碼T7溶菌酶的小質(zhì)粒，而有效地降低雜蛋白的表達(dá)，但不影響IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)水平，從而成為近年來最為常用的宿主菌。表達(dá)產(chǎn)物的形成在大腸桿菌體內(nèi)有三條路徑：(1)形成穩(wěn)定的天然構(gòu)象，可溶且有活性，不易被降解；(2)蛋白質(zhì)是可溶性的，但構(gòu)象為非天